III.

METODOLOGI PENELITIAN

Penelitian ini dilakukan di laboratorium Mikrobiologi kelompok

Bioteknologi KPRT Proses. Untuk pembuatan sel ammobil mikroba dilakukan di
laboratorium Mikrobiologi Sekolah Ilmu Teknologi Hayati ITB. Penelitian ini
dilakukan dalam beberapa tahapan yaitu aktivasi dan kultivasi biakan mikroba,
screening mikroba, kurva pertumbuhan mikroba, screening nutrisi, dan produksi
biosurfaktan dengan sel ammobil. Diagram alur kegiatan dapat dilihat pada
Gambar 3.1 berikut ini :

Aktivasi dan Kultivasi Biakan

Mikroba

Screening Mikroba

Kurva Pertumbuhan
Mikroba

Screening Nutrisi

Pembuatan Sel
Ammobil di ITB

Produksi Biosurfaktan dengan

Sel Ammobil

Gambar 4. Diagram Alir Produksi Biosurfaktan

A. Aktivasi dan Kultivasi Biakan Mikroba

Aktivasi mikroba dilakukan bertujuan untuk mengaktifkan biakan mikroba
yang akan digunakan dalam percobaan. Aktivasi pertama dilakukan dengan
cara menginokulasikan 1 ose biakan murni mikroba ke dalam tabung reaksi
yang telah berisikan masing-masing 10 mL media Nutrient Broth (NB),
diinkubasi selama 24 jam pada suhu 27 oC. Aktivasi kedua dilakukan dengan

23
menginokulasikan 1 mL kultur aktivasi pertama ke dalam tabung reaksi yang
telah berisi 9 mL NB baru, kemudian diinkubasi selama 24 jam pada suhu 27 oC.
Aktivasi ketiga dilakukan sama halnya seperti aktivasi pertama dan kedua, yaitu
dengan cara menginokulasikan 10 mL biakan kultur aktivasi kedua ke dalam
erlenmeyer 200 mL yang telah berisi 90 mL medium NB, diinkubasi selama 24
jam pada suhu 27oC. Kultur biakan mikroba yang telah aktif kemudian
dikultivasi.
Kultivasi biakan mikroba pada prinsipnya sama seperti yang dilakukan
pada saat aktivasi biakan mikroba, hanya saja media dan kultur cair mikroba
yang digunakan dalam volume besar. Kultivasi dilakukan bertujuan untuk
mendapatkan stok kultur aktif mikroba dalam jumlah optimum. Kultur mikroba
yang telah dikultivasi selanjutnya dapat digunakan dalam percobaan dan
pembuatan kurva tumbuh.

B. Screening Mikroba Penghasil Biosurfaktan

Screening mikroba dilakukan dengan tujuan mendapatkan mikroba yang
potensial menghasilkan biosurfaktan. Screening atau penapisan dilakukan
dalam dua tahapan. Tahapan pertama yaitu uji awal pada media agar darah,
dan tahapan kedua uji lanjut pada media minyak.

1. Uji Awal Media Agar Darah

Melalui uji awal pada media agar darah ini dapat diamati mikroba-
mikroba yang menghasilkan biosurfaktan melalui indikasi adanya zona bening
pada permukaan agar darah. Langkah kerja yang dilakukan adalah sebagai
berikut :
a. Disiapkan media agar darah siap pakai, diperoleh dari Laboratorium
Mikrobiologi Fakultas Kedokteran Universitas Indonesia.
b. Diambil satu ose biakan mikroba yang diuji, kemudian di streak
horizontal secara berurutan dengan pengulangan minimal sebanyak
empat kali.
c. Media yang telah berisikan bakteri ini kemudian diinkubasi pada suhu
27oC.

24
 d. Setelah 24 jam masa inkubasi diamati pembentukan zona bening (clear
zone) disekitar goresan biakan mikroba
e. Pengamatan terhadap pembentukan zona bening dilakukan berdasarkan
luasnya zona lisis yang terbentuk secara visualisasi (Gambar 5).

Kultur mikroba

Clear Zone

Streak horizontal Setelah inkubasi 24 jam

Gambar 5. Skema kerja screening mikroba pada media agar darah

2. Uji Lanjut pada Media Minyak

Uji lanjut pada media minyak dilakukan untuk mengamati pengaruh
biosurfaktan yang dihasilkan oleh mikroba terhadap tegangan antar muka
antara fasa berat (minyak) dan fasa ringan (media). Tahapan kerja pada
kegiatan ini adalah sebagai berikut :
a. Dipilih mikroba-mikroba dengan luas zona bening terluas dari tahapan
kegiatan screening mikroba menggunakan agar darah.
b. Mikroba-mikroba terpilih ini kemudian dikultivasi untuk mendapatkan stok
kultur yang optimum.
c. Setelah kultivasi dilakukan selanjutnya mikroba ditumbuhkan pada media
yang telah dicampur minyak.
d. Percobaan ini diinkubasi selama tujuh hari pada suhu 27 oC.
e. Pengukuran tegangan antar muka (IFT) dilakukan pada hari ke-0 dan
hari ke-7 pengamatan.

25
C. Pembuatan Kurva Tumbuh Mikroba
Kurva pertumbuhan menggambarkan pertumbuhan mikroba di dalam
suatu kultur. Kurva tumbuh dibuat dengan metode cawan hitung (“Total plate
count”). Biakan mikroba yang telah diaktivasi diambil sebanyak 15 mL dengan
OD 0,5 (106 sel/mL), dimasukkan ke dalam dua erlenmeyer 500 mL yang
berisikan masing-masing 285 mL medium Nutrient Broth (NB). Pembuatan
kurva tumbuh dimulai dengan mengukur kerapatan optik (“optical dencity”),
setiap 2 jam selama 24 jam menggunakan spektrofotometer dengan panjang
gelombang 600 nm, dilanjutkan dengan menghitung koloni mikroba. Sebelum
pengukuran kurva tumbuh dimulai, kerapatan optik mikroba diukur terlebih
dahulu menggunakan spektrofotometer. Biakan mikroba yang digunakan dalam
pembuatan kurva tumbuh memiliki kerapatan optik 0,08 sampai 0,1. (Cappucino
dan Sherman, 1987).
Perhitungan koloni dilakukan dengan membuat seri pengenceran dalam
akuades. Satu mL biakan dicuplik dan dimasukkan ke dalam tabung reaksi
yang berisikan 9 mL akuades sehingga didapatkan pengenceran 10 -1.
Pengenceran 10-2 dilakukan dengan memindahkan 1 mL dari pengenceran 10 -1
ke dalam tabung reaksi yang berisikan 9 mL akuades. Proses ini terus
dilakukan hingga diperoleh pengenceran 10 -13. Penanaman biakan dilakukan
secara duplo untuk pengenceran 10 -5 sampai 10-13, dengan cara 1 mL dari
masing-masing pengenceran tersebut disebar dengan menggunakan triglaski
ke dalam cawan petri yang berisi 10 mL medium Nutrient Agar (NA) steril.
Biakan diinkubasi pada suhu 27 oC selama 24 jam. Koloni yang tumbuh dihitung
sesuai dengan aturan perhitungan untuk metode cawan hitung. Data yang
dimasukkan dalam perhitungan adalah yang memenuhi persyaratan 30-300
koloni dalam satu cawan. Asumsi dasar dari perhitungan ini adalah satu koloni
berasal dari satu sel bakteri.
Penentuan umur inokulum yang terbaik dilakukan dengan menghitung
laju pertumbuhan dari L. bulgaricus dan S. thermophillus. Laju pertumbuhan
dihitung dengan menggunakan rumus (Fardiaz, 1992) :

μ = ln Nt – ln No
(Tt – To)

26
dengan Nt adalah jumlah sel pada waktu t, No adalah jumlah sel awal, Tt
adalah waktu t dan To adalah waktu awal. Umur inokulum terbaik ditunjukkan
oleh waktu dengan laju pertumbuhan mikroba yang tertinggi.

D. Screening Nutrisi
Screening nutrisi merupakan kegiatan penting dalam penelitian ini yang
memiliki tujuan memilih nutrisi yang potensial mendukung aktivitas metabolisme
mikroba memproduksi biosurfaktan. Kegiatan ini dilakukan setelah screening
mikroba selesai dilakukan, karena mikroba hasil screening akan digunakan
dalam tahapan kegiatan ini. Nutrisi yang digunakan terdiri dari lima formulasi
media untuk masing-masing mikroba, dimana formulasi media ini sama untuk
setiap mikroba, hanya saja penggunaan media spesifik mikroba berbeda
tergantung jenis mikrobanya. Media spesifik mikroba ini merupakan bagian dari
formulasi nutrisi.
Parameter yang digunakan terdiri dari pengukuran pH, Populasi
Bakteri/Total Plate Count (TPC), Tegangan Antar Muka/Interfacial Tension
(IFT), dan Viskositas. Pengamatan dilakukan pada hari ke-0 dan hari ke-7.

1. Pengukuran pH
Pengukuran pH dilakukan dengan menggunakan pH meter elektrik yang
telah dikalibrasi dengan larutan buffer pH 7. Probe pH meter dimasukkan ke
dalam 10 mL sampel, kemudian dibaca nilainya hingga konstan.

2. Total Plate Count (TPC)

Jumlah mikroba dapat dihitung dengan menggunakan prosedur “Serial
Dilution-Agar Plating” yaitu menumbuhkan mikroba dengan seri pengenceran,
kemudian dilanjutkan dengan “Total plate count” (hitungan cawan). Jumlah
koloni mikroba dapat dihitung dengan membuat seri pengenceran dengan
akuades. Satu mL biakan mikroba dicuplik dan dimasukkan ke dalam tabung
reaksi yang berisikan 9 mL akuades sehingga didapatkan pengenceran 10 -1.
Pengenceran 10-2 dilakukan dengan memindahkan 1 mL dari pengenceran 10 -1
ke dalam tabung reaksi yang berisikan 9 mL akuades. Proses ini terus

27
dilakukan hingga diperoleh pengenceran 10 -13. Penanaman biakan dilakukan
secara duplo untuk pengenceran 10 -5 sampai 10-13, dengan cara 1 mL dari
masing-masing pengenceran tersebut disebar dengan menggunakan triglaski
ke dalam cawan petri yang berisi 10 mL medium Nutrien Agar (NA) steril.
Biakan mikroba diinkubasi pada suhu 27 oC selama 24 jam. Koloni yang tumbuh
dihitung sesuai dengan aturan perhitungan untuk metode cawan hitung. Data
yang dimasukkan dalam perhitungan adalah yang memenuhi persyaratan 30-
300 koloni dalam satu cawan. Hasil hitungan cawan menunjukkan sel yang
hidup dan pada hitungan ini satu koloni diasumsikan berasal dari satu sel
(Cappucino dan Sherman, 1987).

3. Interfacial Tension (IFT)

Tegangan antarmuka atau Interfacial Tension (IFT) diukur menggunakan
medium fermentasi dengan minyak mentah dengan alat Processor Tensiometer
tipe K.12/MK.4 nomor seri 94303 merk Kruss dengan batas pengukuran 71
mN/m, dengan tahapan kerja sebagai berikut :
Dihidupkan Processor Tensiometer dan dipastikan sistem pengukuran
(knop) dalam posisi terkunci. Kemudian disiapkan sampel kultur fermentasi
yang akan diukur dalam gelas sampel volume 50 mL. Sampel yang sudah siap
dimasukkan ke dalam bejana termostat. Setelah itu dimasukkan plat platina
yang bersih dan kering di atas bejana termostat. Processor Tensiometer
kemudian ditutup. Setting dalam set up menu dimodifikasi menurut jenis vessel,
standar deviasi 0,00 dan kode sampel.
Termostat dihidupkan pada suhu 50oC kemudian bejana termostat
dinaikkan dengan knop sampai plate di atas permukaan sampel. Setelah
Processor Tensiometer dalam posisi ON atau setelah menekan reset, perintah
seperti yang tertera pada monitor diikuti.
Dibuka kunci keseimbangan sampai sistem pengukuran melakukan tera
secara otomatis, setelah itu akan terlihat pemilihan metode di layar unit
processor yaitu metode plat. Alat akan bekerja secara otomatis dan hasil
pengukuran data dilihat pada layar unit processor kemudian dicetak.
Pencetakan data dilakukan sampai didapat data stabil kurang lebih selama satu

28
jam pengamatan dengan ulangan 10X. Pengukuran tegangan antarmuka
dilakukan dengan dua kali ulangan.

4. Viskositas
Viskositas diukur menggunakan minyak mentah dengan alat
Viscosimeter HAAKE B3. Langkah kerja pengukuran adalah sebagai berikut :
1. Diyakinkan alat dalam keadaan baik dan siap digunakan.
2. Dihidupkan alat dengan menekan tombol ”ON”.
3. Dihidupkan alat pemanas dengan menekan tombol ”ON” dan diatur
temperatur sesuai dengan yang diinginkan, ditunggu beberapa saat
hingga temperatur stabil.
4. Dimasukkan sebanyak 9 mL sampel ke dalam wadah penampung
contoh yang terdapat pada alat.
5. Diatur program dengan menekan tombol ”D”, diikuti tombol ”O” sehingga
display alat menunjukkan angka 0,00
6. Tombol START/STOP ditekan, diamati dan dicatat hasil yang tertera
pada monitor.
7. Setelah pekerjaan selesai, alat dimatikan dengan menekan tombol
STOP/START lagi.
8. Dikeluarkan sampel dan dibersihkan wadah penampung sampel setelah
semua pekerjaan selesai dilakukan.

E. Produksi Biosurfaktan dengan Sel Ammobil

Kegiatan ini diawali dengan membuat beads sel mikroba ammobil yang
dilakukan di Laboratorium Mikrobiologi Sekolah Ilmu Teknologi Hayati, ITB.
Bead dibuat menggunakan bahan baku polisakarida yang bersifat non toksik
bagi mikroba. Pada tahapan ini juga digunakan senyawa Al 2SO4 dan CaCl2
yang berfungsi sebagai pencuci beads hasil cetakan. Pencucian bead bertujuan
agar material polisakarida terikat kuat membungkus sel mikroba.
Sel ammobil yang telah diperoleh digunakan sebagai stok kultur untuk
memproduksi biosurfaktan. Tahapan kerja pada kegiatan ini adalah sebagai
berikut :

29
1. Diambil sebanyak 10% b/v sel ammobil dari mikroba hasil screening
diinokulasikan ke dalam medium hasil screening nutrisi.
2. Langkah selanjutnya dilakukan inkubasi pada suhu 27 oC selama 7 hari.
3. Diikur laju penurunan tegangan antar muka (IFT) dan viskositas pada
hari ke-7 perlakuan pada sampel minyak yang digunakan .
4. Untuk data pembanding dilakukan juga pengukuran dua parameter
diatas pada hari ke-0.
5. Hasil pengukuran ditabulasikan dalam tabel pengamatan.

Gambar 6. Beads sel mikroba ammobil

30