BIOTEKNOLOGI PANGAN
ACARA III
PERHITUNGAN JUMLAH MIKROBA DENGAN METODE MOST PROBABLE
NUMBER (MPN)
Disusun oleh:
Nama : Septiani Nurcahyanti
NIM : 24020221140090
Kelas : Bioteknologi B
Kelompok :3
Nama Asisten : T.A Tyas Kilulud
I. TUJUAN
Mahasiswa mampu mengetahui sistem perhitungan sel mikroorganisme
dengan metode Most Probable Number (MPN).
II. TINJAUAN PUSTAKA
2.1 Perhitungan Mikroorganisme Secara Tidak Langsung
Perhitungan jumlah bakteri merupakan salah satu cara yang dilakukan
untuk bisa mengetahui berapa banyak koloni bakteri yang terdapat pada suatu
media, baik itu koloni sel yang hidup maupun koloni sel bakteri yang mati.
Metode yang digunakan adalah perhitungan secara langsung dan perhitungan
secara tidak langsung. Perhitungan bakteri secara tidak langsung digunakan
untuk menentukan jumlah bakteri yang hidup saja. Setiap perhitungan jumlah
bakteri baik secara langsung maupun tidak langsung memiliki kelemahan
masing-masing. Jumlah bakteri masih belum mendekati hasil maksimal
dikarenakan perhitungan yang melibatkan sel hidup maupun sel mati bakteri,
keterbatasan alat dan bahan saat perhitungan, keperluan persiapan alat dan
bahan yang cukup panjang, ketelitian penelitian oleh peneliti dan lain-lain
(Rosmania et al., 2020).
Enumerasi merupakan teknik menghitung jumlah sel bakteri. Teknik
enumerasi digunakan untuk menghitung jumlah mikroba dalam suatu media
tanpa mengidentifikasi jenis mikroba. Teknik ini bertujuan untuk
menentukan jumlah sel dari suatu kultur bakteri secara kuantitatif. Enumerasi
secara kuantitatif bakteri dapat dilakukan dengan perhitungan jumlah bakteri
secara langsung atau tidak langsung dari suatu sampel. Keuntungan
menggunakan metode enumerasi mikroorganisme secara tidak langsung
adalah perhitungan hanya dilakukan pada mikroba yang masih hidup
sehingga hasilnya lebih akurat (Alfiyanti et al., 2020).
2.2 Metode Most Probable Number (MPN)
Metode Most Probable Number (MPN) atau APM (Angka Paling
Mungkin) merupakan metode yang paling sederhana yang digunakan untuk
menguji kualitas air. Metode Most Probable Number ini merupakan metode
yang mengunakan data dari hasil pertumbuhan mikroorganisme pada medium
cair spesifik dalam serial tabung yang ditanam dari sampel padat atau cair,
sehingga dihasilkan kisaran jumlah mikroorganisme dalam jumlah perkiraan
terdekat. Sistem Quanti-Tray adalah sistem perhitungan bakteri didasarkan
dari metode MPN yang disederhanakan, sehingga terlihat secara kualitatif
dengan indikator warna. Metode ini juga dapat dikuantitatifkan dengan
bantuan tabel MPN yang sudah berstandar ISO 9308-2:2012. Sistem Quanti-
Tray Idexx merupakan sistem enumerasi bakteri yang sudah dimodernisasi
sehingga lebih efektif, seperti pembuatan media, kebutuhan untuk membuat
pengenceran manual dari sampel air yang terkontaminasi dan kebutuhan alat
yang digunakan. Quanti-Tray tidak hanya metode yang lebih cepat dan jauh
lebih sederhana, juga sangat hemat biaya (Agista et al., 2020).
2.3 Pengujian Metode Most Probable Number (MPN)
Prinsip utama metode ini adalah mengencerkan sampel sampai tingkat
tertentu sehingga didapatkan konsentrasi mikroorganisme yang pas/sesuai
dan jika ditanam dalam tabung menghasilkan frekensi pertumbuhan tabung
positif “kadang-kadang tetapi tidak selalu”. Semakin besar jumlah sampel
yang dimasukkan (semakin rendah pengenceran yang dilakukan) maka
semakin “sering” tabung positif yang muncul. Semakin kecil jumlah sampel
yang dimasukkan (semakin tinggi pengenceran yang dilakukan) maka
semakin “jarang” tabung positif yang muncul. Jumlah sampel/pengenceran
yang baik adalah yang menghasilkan tabung positif “kadang-kadang tetapi
tidak selalu”. Semua tabung positif yang dihasilkan sangat tergantung dengan
probabilitas sel yang terambil oleh pipet saat memasukkannya ke dalam
media. Oleh karena itu homogenisasi sangat mempengaruhi metode ini.
Frekuensi positif (ya) atau negatif (tidak) ini menggambarkan konsentrasi
mikroorganisme pada sampel sebelum diencerkan (Rubiani et al., 2022).
2.3.1 Uji Penduga (Presumptive Test)
Prinsip dari metode MPN yaitu menghitung jumlah perkiraan
terdekat melalui uji penduga (presumptive test). Setelah uji penduga,
dilanjutkan dengan uji penguat (confirmed test) untuk menentukan
kelompok koliform yang positif pada uji penduga. Kemudian
dilanjutkan dengan uji pelengkap (completed test) untuk menentukan
jenis bakteri colinya. Uji penduga (presumptive test) merupakan tes
pendahuluan tentang ada tidaknya kehadiran bakteri koliform
berdasarkan terbentuknya asam dan gas disebabkan karena fermentasi
laktosa oleh bakteri golongan coli. Terbentuknya asam dilihat dari
kekeruhan pada media laktosa, dan gas yang dihasilkan dapat dilihat
dalam tabung durham berupa gelembung udara. Tabung dinyatakan
positif jika terbentuk gas di dalam tabung durham. Banyaknya
kandungan bakteri dapat diperkirakan dengan menghitung tabung yang
menunjukkan reaksi positif terbentuk asam dan gas dan dicocokkan
dengan tabel MPN. Apabila pada inkubasi 1 x 24 jam hasilnya negatif,
maka dilanjutkan dengan inkubasi 2 x 24 jam pada suhu 370 C.
Apabila dalam waktu 2 x 24 jam tidak terbentuk gas dalam tabung
durham, dihitung sebagai hasil negative (Sampulawa et al., 2020)
2.3.2 Uji Penegasan (Confirmative Test)
Uji penegasan (Confirmative Test) merupakan uji lanjutan yang
dilakukan pada sampel positif Coliform pada uji pendugaan. Pengujian
dilakukan dengan mengiinokulasi media positif pada Brillian Green
Lactose Bile Broth (BGLBB) steril secara aseptis. Inkubasi dilakukan
selama 24 jam pada suhu 35℃. Adanya gelembung gas yang terbentuk
pada tabung durham menunjukkan sampel positif Coliform fecal.
Penggunaan media BGLB pada uji penegasan berfungsi sebagai
penghambat pertumbuhan flora mikroba yang tidak diharapkan. Media
BGLB merupakan media yang akan berwarna hijau metalik jika
terdapat reaksi fermentasi dengan bakteri coliform. Warna ini berasal
dari adanya koloni coliform yang bereaksi dengan BGLB. Bakteri
coliform merupakan bakteri fermentasi, seringkali menghasilkan warna
hijau metalik mengkilap. Bakteri yang menfermentasi dengan lambat
akan menghasilkan koloni berwarna merah muda (Hadiansyah, 2021).
2.3.3 Uji Pelengkap (Complete Test)
Uji kelengkapan untuk menentukan bakteri Escherichia coli. Uji
kelengkapan menggunakan medium agar miring Nutrient Agar (NA)
untuk menumbuhkan bakteri yang diinokulasikan dari uji penguat.
Dari media agar miring NA dibuat pewarnaan Gram dimana bakteri
Escherichia coli menunjukkan Gram negatif berbentuk batang pendek.
Pada tahap uji ini terlihat tabung Brilliant Green Lactose Bile Broth
2% yang positif ditandai dengan adanya perubahan warna dan
menghasilkan gas, diinokulasikan dengan ose ke dalam media Eosin
Methylen Blue Agar (EMBA). Setelah itu diinkubasi dalam inkubator
pada suhu 37℃ selama 1x24 jam. Keberadaan Escherichia coli
ditandai dengan terbentuknya koloni bakteri yang mengkilat (merah
kehijauan metalik) (Agustina et al., 2021)
III. METODE PENELITIAN
3.1 Alat
1. Tabung reaksi
2. Tabung durham
3. Cawan petri
4. Erlenmeyer
5. Inkubator
6. Rak tabung reaksi
7. Pipet ukur
3.2 Bahan
1. Sampel air jogging track Undip
2. Medium Lactose Broth (LB)
3. Medium Brilliant Green Lactose, Bile, Broth (BGLBB)
4. Medium Eosin Methylene Blue Agar (EMBA)
3.3 Cara Kerja
3.3.1 Uji Penduga
1. Sampel air jogging track sebanyak 5 mL dimasukkan ke dalam tiga
seri tabung berisi Lactose Broth (LB) untuk menghasilkan tabung
yang memiliki dua kali kekuatan.
2. Sebanyak 1 mL sampel air jogging track Undip dimasukkan ke
dalam tabung reaksi berisi akuades 9 mL untuk menghasilkan
pengenceran 10-1.
3. Sampel sebanyak 1 mL dari pengenceran 10 -1 diambil dan
dimasukkan ke tabung reaksi berisi 9 mL akuades, sehingga
didapatkan pengenceran 10-2. Begitu seterusnya hingga tingkat
pengenceran 10-3.
4. Sampel sebanyak 0,5 mL dari pengenceran 10-1 diinokulasikan
secara aseptis ke dalam tiga seri tabung reaksi berisi Lactose Broth
(LB) dan tabung durham.
5. Sampel sebanyak 0,5 mL dari pengenceran 10 -2 diinokulasikan ke
tiga seri tabung reaksi berisi Lactose Broth (LB) dan tabung
durham.
6. Sampel sebanyak 0,5 mL dari pengenceran 10 -3 diinokulasikan ke
tiga seri tabung reaksi berisi Lactose Broth (LB) dan tabung
durham.
7. Seluruh tabung reaksi diinkubasi pada suhu 37℃ selama 24 jam.
3.3.2 Uji Penegasan
1. Sampel positif dari uji penduga diinokulasikan ke dalam tabung
berisi Brilliant Green Lactose, Bile, Broth (BGLBB) yang berisi
tabung durham.
2. Sampel diinkubasi pada suhu 37℃ selama 24 jam.
3.3.3 Uji Pelengkap
1. Ose bulat disterilkan di atas lampu spiritus hingga berpijar.
2. Sampel positif dari tabung uji penegasan diinokulasikan dengan
diambil sebanyak dua ose, kemudian digores dengan metode four-
way streak pada medium Eosin Methylene Blue Agar (EMBA).
3. Sampel diinkubasi pada suhu 44℃ selama 24 jam.
Perhitungan :
Total Coli
Tabung sampel positif =
1) Dua tabung dari pengenceran 10-1
2) Satu tabung dari pengenceran 10-2
3) Nol tabung dari pengenceran 10-3
Nilai MPN yang diperoleh dari tabel adalah 15
1
Hasil perhitungan = Nilai MPN X
Pengenceran tengah
1
= 15 x −2
10
= 1500 MPN/gr
Fecal Coli
Tabung sampel positif =
1) Nol tabung dari pengenceran 10-1
2) Nol tabung dari pengenceran 10-2
3) Nol tabung dari pengenceran 10-3
Nilai MPN yang diperoleh dari tabel adalah 3,0
1
Hasil perhitungan = Nilai MPN X
Pengenceran tengah
1
= 3,0 x −2
10
= 300 MPN/gr
V. PEMBAHASAN
Praktikum Bioteknologi Pangan dengan judul acara “Perhitungan Jumlah
Mikroba dengan Metode Most Probable Number (MPN)” dilaksanakan pada hari
Kamis, 21 September 2023 pukul 13.00 WIB secara luring di Laboratorium
Bioteknologi. Praktikum ini bertujuan untuk mengetahui sistem perhitungan
jumlah sel mikroorganisme dengan metode Most Probable Number (MPN). Alat
dan bahan yang diperlukan meliputi tabung reaksi, rak tabung, cawan petri,
erlenmeyer, inkubator, pipet ukur, sampel air Jogging Track Undip, medium
Lactose Broth (LB), medium Brilliant Green Lactose, Bile, Broth (BGLBB), dan
medium Eosin Methylene Blue Agar (EMBA).
Metode MPN (Most Probable Number) atau juga disebut dengan metode
APM (Angka Paling Mungkin) merupakan metode perhitungan mikroorganisme
atau perhitungan koloni bakteri yang menggunakan data dari hasil pertumbuhan
pada medium cair yang ditanam dalam seri tabung sehingga dihasilkan perkiraan
jumlah mikroorganisme terdekat. Metode MPN (Most Probable Number) umum
digunakan untuk menghitung dan mendeteksi jumlah bakteri. Hal ini selaras
dengan pernyataan Agista (2020) bahwa metode (Most Probable Number) (MPN)
atau APM (Angka Paling Mungkin) merupakan metode yang paling sederhana
yang digunakan untuk menguji kualitas air. Metode MPN (Most Probable
Number) ini merupakan metode yang mengunakan data dari hasil pertumbuhan
mikroorganisme pada medium cair spesifik dalam serial tabung yang ditanam dari
sampel padat atau cair, sehingga dihasilkan kisaran jumlah mikroorganisme
dalam jumlah perkiraan terdekat. MPN (Most Probable Number) merupakan uji
yang mendeteksi sifat fermentatif Coliform dalam sampel, MPN terdiri dari tiga
tahap, yaitu uji pendugaan (Presumptive test), uji konfirmasi (Confirmed test),
dan uji kelengkapan (Completed test). Dalam uji tahap pertama, keberadaan
Coliform masih dalam tingkat probabilitas rendah, masih dalam dugaan.
Prinsip pengujian MPN yakni pengenceran sampel hingga tingkat tertentu
sehingga mendapatkan konsentrasi mikroorganisme yang sesuai. Apabila
mikroorganisme ditumbuhkan dalam tabung Durham akan menunjukkan hasil
positif dengan pembentukan gas. Hal ini diperjelas oleh pernyataan Rubiani
(2022) bahwa prinsip utama metode MPN (Most Probable Number) adalah
mengencerkan sampel sampai tingkat tertentu sehingga didapatkan konsentrasi
mikroorganisme yang pas/sesuai dan jika ditanam dalam tabung menghasilkan
frekensi pertumbuhan tabung positif “kadang-kadang tetapi tidak selalu”.
Semakin besar jumlah sampel yang dimasukkan (semakin rendah pengenceran
yang dilakukan) maka semakin “sering” tabung positif yang muncul. Semakin
kecil jumlah sampel yang dimasukkan (semakin tinggi pengenceran yang
dilakukan) maka semakin “jarang” tabung positif yang muncul. Jumlah
sampel/pengenceran yang baik adalah yang menghasilkan tabung positif “kadang-
kadang tetapi tidak selalu”. Semua tabung positif yang dihasilkan sangat
tergantung dengan probabilitas sel yang terambil oleh pipet saat memasukkannya
ke dalam media. Oleh karena itu homogenisasi sangat mempengaruhi metode ini.
Frekuensi positif (ya) atau negatif (tidak) ini menggambarkan konsentrasi
mikroorganisme pada sampel sebelum diencerkan.
(A) (B)
Gambar 2. Hasil uji penegasan menggunakan media BGLBB (Brilliant Green
Lactose Bile Broth) a). inkubasi pada suhu 37oC dan b). inkubasi pada suhu 44oC
(Dok. Pribadi, 2023)
Dilanjutkan dengan uji penegasan yang mana pengujian ini dilakukan setelah
uji penduga untuk memastikan hasil positif dari uji sebelumnya, serta untuk
membedakan bakteri Coliforn fecal dan nonfecal menggunakan media BGLBB
(Brilliant Green Lactose Bile Broth) yang dilakukan dengan menginokulasikan
sampel positif dari uji pendugaan ke dalam media BGLBB dan setelah diinkubasi
pada suhu 37oC dan suhu 44oC. Penggunaan media BGLBB (Brilliant Green
Lactose Bile Broth) pada uji penegasan adalah sebagai media selektif bagi bakteri
Coliform, karena mengandung laktosa dan bile. Berdasarkan hasil inokulasi
diperoleh sebanyak 3 tabung positif pada inkubasi suhu 37oC dan 0 tabung tidak
terdapat positif pada inkubasi suhu 44oC. Sampel air Jogging Track Undip
menunjukkan hasil uji positif pada suhu 37 0C pada media BGLB, seperti pada
gambar 2 bagian A yang mengalami perubahan warna yang semula hijau menjadi
kekuningan dan adanya gelembung pada tabung durham. Sedangkan hasil negatif
pada 440 C seperti pada gambar 2 bagian B bahwa warna media akan tetap berwarna
hijau yang disebabkan karena tidak adanya bakteri Coliform yang mampu
memfermentasi laktosa. Hal ini selaras Rahman (2022) yang menyatakan bahwa
media BGLB digunakan untuk mendeteksi Coliform, yang mana hasil positif akan
ditandai dengan perubahan warna media menjadi kuning dan terbentuknya gas yang
menandakan bahwa adanya bakteri coliform pada sampel. BGLB (Brilliant Green
Lactose Bile Broth) memiliki komposisi garam empedu dan laktosa sehingga
mampu membuat bakteri Coliform tumbuh dengan optimal, selain itu media ini juga
mengandung oxbile yang berfungsi sebagai penghambat pertumbuhan bakteri gram
positif, sehingga bakteri yang tumbuh hanya bakteri gram negatif. Laktosa pada
media BGLB hanya dapat difermentasikan oleh bakteri Coliform menjadi asam
suksinat dan fumarat yang diikuti dengan pembentukan O 2 oleh bakteri Coliform
fakultatif anaerob dan CO2 oleh bakteri Coliform aerob. Pembentukan gas O2 dan
CO2 inilah yang dijadikan parameter ada tidaknya bakteri Coliform, sehingga hasil
negatif pada uji ini akan ditandai dengan tidak berubahnya warna media dan tidak
ada gelembung gas karena tidak adanya bakteri yang mampu memfermentasikan
laktosa.
1
Hasil perhitungan = Nilai MPN X
Pengenceran tengah
1
= 3,0 x −2
10
= 300 MPN/gr
Sehingga dari perhitungan tersebut didapatkan nilai MPN Coliform pada
sampel air Jogging Track Undip sebesar 3,0 x 102 Cfu/ml. Hal ini menandakan
bahwa sampel air Jogging Track Undip yang diuji tidak layak untuk dikonsumsi
karena menunjukkan hasil positif pada suhu 370 C mengandung bakteri Coliform,
dan nilai MPN Coliform dari sampel air Jogging Track tersebut melebihi standar
yang telah ditetapkan oleh Permenkes Nomor 492 tahun 2010 tentang Persyaratan
Kualitas Air Minum, keberadaan bakteri E. coli harus bernilai nol, sehingga hasil
sampel tersebut tidak memenuhi syarat. Hal ini selaras dengan pernyataan Agustina
bahwa penentuan nilai MPN Coliform dilakukan berdasarkan jumlah tabung yang
positif dari uji penegasan yang kemudian dicocokkan pada tabel MPN, data yang
didapat kemudian dianalisis menggunakan rumus perhitungan.
VI. KESIMPULAN
Agista, H. R. R., & Purwantisari, S. 2020. Uji Bakteriologis Air Sambungan Rumah Dengan
Metode Most Probable Number (MPN) Quanti-Tray Di Pdam Kabupaten Magelang.
Jurnal Akademika Biologi, 9(1): 18-22.
Agustina, Aita. Citra. 2021. Analisis Cemaran Coliform dan Identifikasi Escherichia coli dari
Depo Air Minum Isi Ulang di Kota Semarang. Journal Life Science, 10(1): 23-32.
Agustin, D., & Rahmawati, E. R. P. 2019. Angka Paling Mungkin (Most Probable
Number/MPN) Coliform Sampel Kue Bingke Berendam di Pontianak. Jurnal Protobiont,
8(1).
Alfiyanti, E., & Putri, D. H. 2020. Precision Enumeration of The Number of Bacterial Cells
With The Spread Plate Method Using Dilution. Serambi Biologi, 5(1).
Hadiansyah, N. K., Junitasari, A., & Gustiana, E. 2021. Analisis Bakteri Coliform Dalam
Sampel Air Minum PAMSIMAS Di Kabupaten Kuningan. Jurnal Kartika Kimia, 4(2):
89-95.
Jufri, E. S., dan Rahman, I. 2022. Analisis Cemaran Bakteri Coliform Pada Minuman Jajanan
Dengan Metode MPN (Most Probable Number). Journal Syifa Sciences and Clinical
Research, 4(1).
Rubiani, R., Rosanty, A., & Yunus, R. 2022. Analisis Most Probable Number (MPN) Pada
Air Minum Isi Ulang Di Wilayah Nambo Kota Kendari. Jurnal Poltekkes Kemenkes
Kendari, 1(1).
Rosmania, R., & Yanti, F. 2020. Perhitungan Jumlah Bakteri Di Laboratorium Mikrobiologi
Menggunakan Pengembangan Metode Spektrofotometri. Jurnal Penelitian Sains, 22(2):
76-86.
Sampulawa, I., & Tumanan, D. 2016. Analisis Kualitas Air Minum Isi Ulang Yang Dijual Di
Kecamatan Teluk Ambon. Jurnal Arika, 10(1): 41-56.
Sari, D., Rahmawati., Rsumiyanto, E. 2019. Deteksi dan Identifikasi Genera Bakteri Coliform
Hasil Isolasi dari Minuman Lidah Buaya. Jurnal labora Medika, 3(1): 29-35.
Utami, Fadilasani. 2020. Metode Most Probable Number (MPN) Sebagai Dasar Uji Kualitas
Air Sungai Rengganis dan Pantai timur Pangandaran Dari Cemaran Coliform dan
Escherichia coli. Jurnal Kesehatan Bakti Tunas Husada: Jurnal Ilmu-ilmu Keperawatan,
Analis Kesehatan dan Farmasi, 20(1): 21-30.
LEMBAR PENGESAHAN
Mengetahui,
Asisten Praktikan