Boloiri

Pengenceran mikro atau makro kaldu adalah salah satu metode pengujian kerentanan antimikroba yang
paling dasar. Prosedurnya melibatkan menyiapkan pengenceran dua kali lipat dari agen antimikroba
(misalnya 1, 2, 4, 8, 16 dan 32 mg/mL) dalam media pertumbuhan cair yang dibagikan dalam tabung
mengandung volume minimal 2 mL (pengenceran makro) atau dengan volume yang lebih kecil
menggunakan pelat mikrotitrasi 96-sumur (mikrodilusi) (Gbr. 2). Kemudian, setiap tabung atau sumur
diinokulasi dengan mikroba inokulum disiapkan dalam media yang sama setelah pengenceran suspensi
mikroba standar yang disesuaikan dengan skala 0,5 McFarland (Gbr. 3). Setelah tercampur dengan baik,
tabung yang diinokulasi atau 96-sumur pelat mikrotitrasi diinkubasi di bawah kondisi yang sesuai
tergantung pada mikroorganisme uji (Tabel 1). Metodologi eksperimental untuk melakukan secara
akurat mikrodilusi digambarkan pada Gambar. 4. pengenceran kaldu telah distandarisasi oleh CLSI untuk
menguji bakteri yang tumbuh aerobik ragi dan jamur berserabut. EUCAST metode pengenceran kaldu
pada prinsipnya mirip dengan CLSI dengan modifikasi biasanya mengenai beberapa parameter pengujian
seperti: seperti persiapan inokulum, ukuran inokulum, dan pembacaan MIC metode yang visual dalam
uji CLSI dan spektrofotometri dalam Pedoman EUCAST

MIC adalah konsentrasi agen antimikroba terendah yang sepenuhnya menghambat pertumbuhan
organisme dalam tabung atau sumur mikrodilusi seperti yang terdeteksi oleh mata telanjang. kelemahan
utama pengenceran makro metode adalah pekerjaan manual yang membosankan, risiko kesalahan
dalam persiapan larutan antimikroba untuk setiap tes, dan jumlah reagen yang relatif besar dan ruang
yang dibutuhkan. Dengan demikian, reproduktifitas dan ekonomi reagen dan ruang yang terjadi karena
miniaturisasi tes adalah yang utama keuntungan dari metode mikrodilusi. Penentuan konsentrasi
bakterisida minimum (MBC) adalah yang paling umum estimasi aktivitas bakterisida atau fungisida. MBC
didefinisikan sebagai konsentrasi terendah agen antimikroba yang dibutuhkan untuk membunuh 99,9%
dari inokulum akhir setelah inkubasi selama 24 jam. MBC dapat ditentukan setelah pengenceran makro
kaldu atau mikrodilusi dengan mensubkultur sampel dari sumur atau tabung, menghasilkan
pertumbuhan mikroba negatif setelah inkubasi pada permukaan pelat agar non-selektif untuk
menentukan jumlah sel yang masih hidup (CFU/mL) setelah 24 jam inkubasi. Bakterisida titik akhir (MBC)
telah secara subyektif didefinisikan sebagai konsentrasi terendah, di mana 99,9% dari inokulum akhir
terbunuh.

Metode pengenceran agar melibatkan penggabungan berbagai konsentrasi yang diinginkan dari
agen antimikroba ke dalam agar-agar medium (media agar cair), diikuti dengan penambahan
inokulasi inokulum mikroba tertentu ke permukaan pelat agar. Titik akhir MIC direkam sebagai
konsentrasi terendah agen antimikroba yang sepenuhnya menghambat pertumbuhan di bawah
kondisi inkubasi yang sesuai (Tabel 2).

Teknik ini cocok untuk antibakteri dan antijamur pengujian kerentanan. Metode pengenceran
agar sering direkomendasikan sebagai metode standar untuk organisme rewel [79] seperti
anaerob dan spesies Helicobacter. Metode ini juga digunakan untuk kombinasi agen-obat
antijamur melawan Candida sp., Aspergillus, Fusarium dan dermatofita. Metode pengenceran ini
menyajikan korelasi yang baik dengan Etest untuk pengujian antibakteri terhadap kedua bakteri
Gram-positif dan Gram-negatif.

Scumacher

Metode pengenceran agar digunakan untuk penentuan MIC dari senyawa antimikroba dengan
mengikuti standar pedoman Pada metode ini, bakteri anaerob atau aerobik diunggulkan pada
media agar nutrisi yang ditambahkan dengan konsentrasi agen antimikroba yang berbeda. Koloni
metode ini akan membentuk unit (CFU) yang kemudian dihitung setelah 48 jam inkubasi.
Metode ini memiliki pembacaan yang sederhana dan hemat biaya, tetapi membutuhkan waktu
yang lama untuk memastikan pembentukan CFU.

Metode pengenceran makro kaldu

Salah satu metode AST tertua, juga dikenal sebagai pengenceran tabung metode, memanfaatkan tabung
yang berisi pengenceran serial dua kali lipat agen antibiotik dalam media pertumbuhan cair [15, 24].
Selanjutnya, sejumlah bakteri tersuspensi yang diketahui ditambahkan untuk setiap solusi. Setelah 24
jam inkubasi, pertumbuhan bakteri diukur dengan kekeruhan di dalam tabung, yang memberikan nilai
MIC. Metode ini distandarisasi oleh CLSI untuk bakteri yang tumbuh secara aerobic. Keuntungan utama
dari metode ini adalah kemampuannya untuk mendapatkan nilai MIC kuantitatif [19], serta minimum
konsentrasi bakterisida (MBC), yang merupakan jumlah terendah obat yang membunuh 99,9% bakteri
(bakterisida) titik akhir). Makrodilusi kaldu adalah metode yang andal dan standar untuk tujuan
diagnostik. Kerugian utama adalah bahwa setiap larutan antibiotik harus disiapkan dengan tangan.
Meskipun ini memberikan tingkat fleksibilitas tertentu dalam pilihan obat dan konsentrasi, ini adalah
proses yang sangat memakan waktu, terutama untuk penyelidikan eksperimental yang lebih besar.
OLeh karena itu metode pengenceran mikro digunakan untuk menggantikan metode pengenceran
makro

Upaya mikrodilusi untuk meningkatkan kaldu makrodilusi dengan melakukan satu tes menggunakan 12
agen antibiotik yang berbeda dipelat 96-sumur. Setelah penambahan secara manual atau otomatis
sejumlah kecil bakteri untuk setiap sumur, piring diinkubasi semalam, menghasilkan perubahan warna
yang dapat diamati, bersama dengan pertumbuhan bakteri. Perangkat tampilan otomatis atau manual
dapat digunakan untuk menentukan MIC dengan intensitas fluoresensi atau pengukuran kekeruhan.
Pelat sumur dapat dibeli mengandung konsentrasi bahan kering yang berbeda yang disiapkan di setiap
sumur, meningkatkan standarisasi dan kemudahan menggunakan. Pengenceran mikro distandarisasi
oleh CLSI untuk bakteri anaerob [34] dan aerobik [21]. Manfaat yang paling jelas adalah pengurangan
ruang kerja, reagen dan waktu. Namun, kelemahan utama adalah bahwa pemilihan obat terbatas pada
panel yang tersedia secara komersial. Dengan tingkat otomatisasi yang lebih tinggi, mikrodilusi sekarang
menjadi teknik standar emas yang lebih disukai daripada makrodilusi kaldu.
BENKOVA

Pengenceran makro kaldu

Metode pengenceran makro kaldu (atau pengenceran tabung) adalah salah satu metode AST paling
awal, tetapi harus digantikan dengan teknik pengenceran mikro kaldu (Mor-eno et al. 2013). Kerugian
utamanya termasuk jumlah ruang dan reagen yang relatif besar, sifatnya yang padat karya, dan
kemungkinan kesalahan dalam persiapan larutan antibiotik untuk setiap pengujian. Ferraro 2009).
Prosedur ini dilakukan dengan menyiapkan pengenceran dua kali lipat dari agen antimikroba
(dinyatakan dalam gml1) dalam media pertumbuhan cair yang dibagikan dalam tabung reaksi yang
mengandung volume minimum (2 ml) suspensi mikroba standar yang disesuaikan dengan 0 5 skala
kekeruhan McFarland (Balouiri et al. 2016). Setelah inkubasi semalam pada 37°C selama 24 jam (strain
bakteri) atau pada 25 °C selama 4-10 hari (strain jamur), tabung diperiksa untuk melihat adanya
pertumbuhan mikroba yang terlihat oleh kekeruhan. Konsentrasi agen antimikroba terendah dimana
pertumbuhannya benar-benar terhambat (tidak ada kekeruhan) mewakili KHM (Salem dan Ali 2016).

Mikrodilusi kaldu Karena uji mini, metode mikrodilusi kaldu menjadi lebih praktis dan populer. Teknik ini
dilakukan dengan menggunakan pelat mikrotitrasi polistirena sekali pakai steril kecil, biasanya berisi 96
sumur. Setiap sumur berisi volume antara 01 dan02 ml dan karenanya memungkinkan pengujian
sekitar 12antibiotik pada kisaran 8 pengenceran dua kali lipat pada satu pelat. Baki diisi dengan
pengenceran dua kali lipat dari agen antimikroba, dan kemudian pelat diinokulasi dengan suspensi
mikroba encer yang distandarisasi dengan kepadatan optik 0,5 skala McFarland untuk mencapai
konsentrasi mikroba akhir 1-5 9 105CFU per ml (unit pembentuk koloni per ml) (Brown-Elliott et al.
2012; Brook et al.2013). Sumur dicampur dan pelat diinkubasi dalam kondisi yang sesuai tergantung
pada mikroorganisme yang diuji (Balouiri et al. 2016). MIC ditentukan secara visual atau dengan
perangkat tampilan otomatis, perangkat analisis afotometri pada 620 nm (Moreno et al.2013).
Konsentrasi bakterisida (MBC) dan fungisida (MFC) minimum ditentukan dengan subkultur dari pelat
mikrotitrasi pada agar M€ueller-Hinton (berlaku untuk bakteri, diinkubasi selama 24 jam pada 37°C) dan
pelat agar Sabouraud (berlaku untuk jamur, diinkubasi selama48 jam pada 35°C). Nilai MBC dan MFC
menunjukkan konsentrasi terendah dari senyawa antimikroba yang mengurangi viabilitas inokulum
bakteri atau jamur awal sebesar 999%. Pengujian dilakukan dalam rangkap tiga (de Oliveira et al.
2011).

Keuntungan dari pengenceran mikro kaldu meliputi repro-ducibility, jumlah sampel yang dibutuhkan
sedikit, dan biaya rendah yang memungkinkan sejumlah besar ulangan. Metode tersebut lebih efisien
dan mudah dibandingkan dengan metode makrodilusi (Moreno et al. 2013). Kerugian dari metode ini
termasuk kesulitan dalam mendeteksi kontaminasi, viabilitas inokulum dan efek penghambatan dari
cosolvents yang digunakan (misalnya dimetil sulfoksida) (de Oliveira et al. 2011).
Metode pengenceran agar adalah metode manual yang dilakukan dengan memasukkan konsentrasi
agen antimikroba yang berbeda ke dalam media agar cair, biasanya menggunakan pengenceran dua kali
lipat, diikuti dengan inokulasi inokulum mikroba standar ke permukaan pelat agar (Gbr. 3). Pelat agar
dievaluasi dengan membandingkan secara visual berbagai strain dalam seri. Selanjutnya titik akhir MIC
ditentukan sebagai konsentrasi antibiotik terendah yang menghambat pertumbuhan bakteri. Metode ini
cocok untuk pengujian kepekaan antibakteri dan antijamur dan direkomendasikan sebagai metode AST
standar untuk organisme yang sukar, seperti anaerob dan Helicobacter sp. Teknik pengenceran agar
lebih disukai daripada pengenceran kaldu. Keuntungan dari metode pengenceran agar yaitu dapat
mentransfer antara 32 dan 60 inokulan bakteri yang berbeda ke pelat agar tunggal. Kelemahan dari
metode ini adalah bahwa jika metode ini diotomatisasi maka metode ini akan membutuhkan sumber
daya ekonomi dan teknis.

oie

Tujuan dari metode pengenceran kaldu dan agar adalah untuk menentukan konsentrasi terendah
dari pengujian antimikroba yang menghambat pertumbuhan. (MIC, biasanya dinyatakan dalam
g/ml atau mg/liter). Namun, MIC tidak selalu mewakili nilai absolut. MIC 'sejati' adalah sebuah
poin antara konsentrasi uji terendah yang menghambat pertumbuhan bakteri dan uji berikutnya
yang lebih rendah konsentrasi. Oleh karena itu, penentuan MIC yang dilakukan dengan
menggunakan seri pengenceran dapat dianggap memiliki: variasi yang melekat dari satu
pengenceran. Kisaran antimikroba harus mencakup kedua kriteria interpretatif (rentan, menengah
dan resisten) untuk kombinasi bakteri/antibiotik tertentu dan organisme referensi kontrol kualitas
yang sesuai. Setiap laboratorium yang ingin menggunakan metode pengenceran dan menyiapkan
reagen dan pengenceran antibiotiknya sendiri harus memiliki kemampuan untuk mendapatkan,
menyiapkan, dan memelihara larutan stok yang sesuai dengan tingkat reagen antimikroba dan
untuk menghasilkan pengenceran kerja secara teratur.

Pengenceran kaldu menurut OIE (2015) adalah suatu teknik dimana suspensi bakteri yang telah
ditentukan sesuai konsentrasi diuji terhadap berbagai konsentrasi agen antimikroba (biasanya
pengenceran dua kali lipat serial) dalam media cair. Metode pengenceran kaldu bisa dilakukan
baik dalam tabung yang berisi volume minimal 2 ml (pengenceran makro) atau dalam volume
yang lebih kecil menggunakan pelat mikrotitrasi (mikrodilusi).. Penggunaan lot dalam pelat
identik dengan pengenceran mikro dapat membantu dalam meminimalkan variasi yang mungkin
timbul karena persiapan dan pengenceran antimikroba dari laboratorium yang berbeda. panel uji
antimikroba mikrodilusi kaldu disiapkan secara komersial, sehingga metode ini kurang fleksibel
dibandingkan dengan pengenceran agar atau difusi disk. Selain itu, metode ini jarang digunakan
pada beberapa laboratorium dikarenakan membutuhkan biaya yang banyak untuk pembelian alat
yang dibutuhkan.

• Pengenceran agar

Pengenceran agar merupakan metode yang melibatkan penggabungan berbagai konsentrasi agen
antimikroba ke dalam media agar. Tingkatan pengenceran yang digunakan biasanya pengenceran
dua kali lipat dan ditambahkan inokulum bakteri tertentu ke agar-agar permukaan piring. Hasil
pada metode ini sering dianggap sebagai yang paling tepat untuk penentuan MIC kombinasi
bakteri atau antimikroba uji. Pengenceran agar ini sering direkomendasikan sebagai metode AST
standar untuk organisme rewel, misalnya spesies anaerob dan Helicobacter.

Keuntungan dari metode pengenceran agar meliputi: i) kemampuan untuk menguji beberapa
bakteri, kecuali bakteri yang berkerumun, pada set pelat agar yang sama di waktu yang sama, ii)
potensi untuk meningkatkan identifikasi titik akhir MIC dan memperpanjang konsentrasi
antibiotik jangkauan, iii) kemungkinan untuk semi-otomatisasi metode menggunakan peralatan
replikasi inokulum. Komersial replikator inokulum yang diproduksi tersedia dan ini dapat
mentransfer antara 32 dan 60 berbeda inokula bakteri ke setiap lempeng agar, Metode
pengenceran agar juga memiliki kelemahan tertentu, misalnya: i) jika tidak otomatis, mereka
sangat melelahkan dan membutuhkan sumber daya ekonomi dan teknis yang substansial, ii)
setelah piring disiapkan, piring biasanya harus digunakan dalam waktu seminggu (atau kurang,
tergantung pada antimikroba yang diuji), iii) titik akhir tidak selalu mudah dibaca dan kemurnian
inokulum juga tidak mudah diverifikasi.