Kuliah media

Bahan-bahan media pertumbuhan

1. Bahan dasar
a. Air (H2O) sebagai pelarut
b. Agar (dari rumput laut) yang berfungsi untuk pemadat media. Agar sulit didegradasi oleh
mikroorganisme pada umumnya dan mencair pada suhu 45⁰C.
c. Gelatin adalah polimer asam amino yang diproduksi dari kolagen. Kekurangannnya adalah lebih
banyak jenis mikroba yang mampu menguraikannya dibanding agar.
d. Silica gel, yaitu bahan yang mengandung natrium silikat. Fungsinya juga sebagai pemadat media.
Silica gel khusus digunakan untuk memadatkan media bagi mikroorganisme autotrof obligat.
2. Nutrisi atau zat makanan
a. Nikroba dapat menggunakan sumber N anorganik seperti urea. Media harus mengandung unsur-
unsur yang diperlukan untuk metabolisme sel yaitu berupa unsur makro seperti C, H, O, N, P;
unsur mikro seperti Fe, Mg
b. Sumber karbon dan energi yang dapat diperoleh berupa senyawa organik atau anorganik sesuai
dengan sifat mikrobanya. Jasad heterotrof memerlukan sumber karbon organik antara lain dari
karbohidrat, lemak, protein dan asam organik.
c. Sumber nitrogen mencakup asam amino, protein atau senyawa bernitrogen lain dan sejumlah
vitamin.
3. Bahan tambahan
Bahan-bahan tambahan yaitu bahan yang ditambahkan ke medium dengan tujuan
tertentu, misalnya phenol red (indikator asam basa) ditambahkan untuk indikator perubahan pH
akibat produksi asam organik hasil metabolisme. Antibiotik ditambahkan untuk menghambat
pertumbuhan mikroba nontarget/kontaminan.
4. Bahan lain yang sering digunakan dalam pembuatan media
a. Peptone, peptone adalah produk hidrolisis protein hewani atau nabati seperti otot, liver, darah,
susu, casein, lactalbumin, gelatin dan kedelai.Komposisinya tergantung pada bahan asalnya dan
bagaimana cara memperolehnya.
b. Meat extract. Meat extract mengandung basa organik terbuat dari otak,limpa, plasenta dan daging
sapi.
c. Yeast extract. Yeast extract terbuat dari ragi pengembang roti atau pembuat alcohol. Yeast extract
mengandung asam amino yang lengkap & vitamin (Bcomplex).
d. Karbohidrat. Karbohidrat ditambahkan untuk memperkaya pembentukan asam amino dan gas dari
karbohidrat. Jenis karbohidrat yang umumnya digunakan dalam amilum, glukosa, fruktosa,
galaktosa, sukrosa, manitol, dll.Konsentrasi yang ditambahkan untuk analisis fermentasi adalah
0,5-1%.
Klasifikasi dan fungsi media:
1. Medium berdasarkan sifat fisik
 Medium padat yaitu media yang mengandung agar 15% sehingga setelahdingin media menjadi
padat..
 Medium setengah padat yaitu media yang mengandung agar 0,3-0,4% sehingga menjadi sedikit
kenyal, tidak padat, tidak begitu cair. Media semisolid dibuat dengan tujuan supaya pertumbuhan
mikroba dapat menyebar ke seluruh media tetapi tidak mengalami percampuran sempurna jika
tergoyang. Misalnya bakteri yang tumbuh pada media NfB (Nitrogen free Bromthymol Blue)
semisolid akan membentuk cincin hijau kebiruan di bawah permukaan media, jika media ini cair
maka cincin ini dapat dengan mudah hancur. Semisolid juga bertujuan untuk mencegah/menekan
difusi oksigen, misalnya pada media Nitrate Broth, kondisi anaerob atau sedikit oksigen
meningkatkan metabolisme nitrat tetapi bakteri ini juga diharuskan tumbuh merata diseluruh
media.
 Medium cair yaitu media yang tidak mengandung agar, contohnya adalah NB (Nutrient Broth),
LB (Lactose Broth),TSB (Trypticase Soy Broth)
2. Medium berdasarkan komposisi
 Medium sintesis yaitu media yang komposisi zat kimianya diketahui jenis dan takarannya secara
pasti, misalnya Glucose Agar, Mac Conkey Agar.
 Medium semi sintesis yaitu media yang sebagian komposisinya diketahui secara pasti, misanya
PDA (Potato Dextrose Agar) yang mengandung agar, dekstrosa dan ekstrak kentang. Untuk
bahan ekstrak kentang, kita tidak
dapat mengetahui secara detail tentang komposisi senyawa penyusunnya.
 Medium non sintesis yaitu media yang dibuat dengan komposisi yang tidak dapat diketahui secara
pasti dan biasanya langsung diekstrak dari bahandasarnya, misalnya Tomato Juice Agar, Brain
Heart Infusion Agar, Pancreatic Extract.
 3. Medium berdasarkan tujuan
 Media untuk isolasi
Media ini mengandung semua senyawa esensial untuk pertumbuhan mikroba, misalnya Nutrient
Broth, Blood Agar.
 Media selektif/penghambat
Media yang selain mengandung nutrisi juga ditambah suatu zat tertentu sehingga media tersebut
dapat menekan pertumbuhan mikroba lain dan merangsang pertumbuhan mikroba yang
diinginkan. Contohnya adalah Luria Bertani medium yang ditambah Amphisilin untuk
merangsang E.coli resisten antibotik dan menghambat kontaminan yang peka, Ampiciline.
Saltbroth yang ditambah NaCl 4% untuk membunuh Streptococcus agalactiae yang toleran
terhadap garam.
 Media diperkaya (enrichment)
Media diperkaya adalah media yang mengandung komponen dasar untuk pertumbuhan mikroba
dan ditambah komponen kompleks seperti darah,serum, kuning telur. Media diperkaya juga
bersifat selektif untuk mikroba tertentu. Bakteri yang ditumbuhkan dalam media ini tidak hanya
membutuhkan nutrisi sederhana untuk berkembang biak, tetapi membutuhkan komponen
kompleks, misalnya Blood Tellurite Agar, Bile Agar, Serum Agar, buffer charcoal yeast extract
agar yang mengandung L-cystein dan bahan gizi lain untuk pertumbuhan legionella pneumophila
penyebab penyakit legionnair.
 Media untuk menentukan kebutuhan nutrisi spesifik.
Media ini digunakan unutk mendiagnosis atau menganalisis metabolism suatu mikroba.
Contohnya adalah Koser’s Citrate medium, yang digunakanuntuk menguji kemampuan
menggunakan asam sitrat sebagai sumber karbon.
 Media untuk karakterisasi bakteri
Media yang digunakan untuk mengetahui kemampuan spesifik suatu mikroba. Kadang-kadang
indikator ditambahkan untuk menunjukkan adanya perubahan kimia. Contohnya adalah Nitrate
Broth, Lactose Broth,Arginine Agar.
 Media diferensial
Media ini bertujuan untuk mengidentifikasi mikroba dari bakteri lainnya yang sama-sama
tumbuh dalam media perbenihanberdasar karakter spesifik yang ditunjukkan pada media
diferensial,misalnya TSIA (Triple Sugar Iron Agar) yang mampu memilih Enterobacteria
 berdasarkan bentuk, warna, ukuran koloni dan perubahan warna media di sekeliling koloni,
media Mac conkey agar merupakan media diferensial dan slektif karena tidak dapat
menumbuhkan bakteri gram positif.
Dari sekian banyak macam media, media yang paling sering digunakan untuk identifikasi
bakteri adalah :
1. Brain-Heart infusion (BHI) / perbenihan cair.
BHI adalah media penyubur yang berguna untuk pertumbuhan berbagai macam bakteri baik
bentuk cair maupun agar. Bahan utama terdiri dari beberapa jaringan hewan ditambah pepton,
buffer posfat, dan sedikit dekstrosa. Penambahan karbohidrat memungkinkan bakteri dapat
menggunakan langsung sebagai sumber energi. BHI biasanya digunakan untuk media
pertumbuhan spesimen darah
2. Perbenihan cair Gram negative (GN broth).
Media selektif gram negatif digunakan untuk pembiakan bakteri patogen saluran pencernaan (
salmonella spp dan shigella spp) dari spesimen faeces dan rectal swab. Larutan berisi beberapa
bahan aktif termasuk natrium sitrat dan natrium deoksikolat yang menghambat pertumbuhan
organisme gram positif dan mempercepat pertumbuhan bakteri gram negatif. Untuk
mengoptimalkan selektfitas media, GN broth setelah diinkubasi 6-8 jam setelah penanaman
pertama harus diisolasi ulang dan diinkubasikan kembali, apabila melewati waktu tersebut
bakteri nonenterik patogen akan tumbuh melampaui pathogen
3. Columbia CNA mengandung darah
Agar Columbia CAN adalah media dasar yang mengandung tiga komponen sumber pepton dan
darah domba 5% yang tidak mengandung fibrin. Media ini juga dapat membedakan reaksi
bakteri berdasarkan kemampuan dalam menghemolisa darah. CNA adalah merupakan antibiotic
Colistin (C) dan Nalidixic acid (NA) yang ditambahkan ke dalam media untuk menghambat
mikroorganisme gram negatif dan menumbuhkan bakteri gram positif. Contohnya untuk
perbenihan Lactobacillus spp dari specimen secret vagina, streptococcus yang menyebabkan
infeksi pada vagina dan wanita hamil.
4. Hektoen Enteric agar (HE)
Terdiri dari garam empedu dan zat warna indikator (brom thymol blue dan fuchsin acid) untuk
memperlambat bakteri non patogenik gram negatif batang yang terdapat di saluran pencernaan
dan memberi kesempatan salmonella dan shigella tumbuh. Media HE juga merupakan media
 differensial karena bakteri non enterik patogen akan tumbuh koloni berwarna oranye sampai
merah muda kekuningan. Koloni ini timbul dari organisme yng memiliki kemampuan
menfermentasi laktosa dalam media, kemampuan meragi menghasilkan asam yang akan
menurunkan pH media dan meyebabkan perubahan indikator bromthymol blue. Shigella tidak
meragi laktosa sehingga sehingga warna media biru kehijauan tidak berubah seperti karakteristik
media diferensial, media mengandung feri ammonium sitrat yang mendeteksi adanya produksi
gas H2S seperti salmonella spp. Dapat terlihat melalui adanya presipitasi warna hitam pada
media.
5. Mac conkey agar
Mac conkey agar adalah media selektif dan differensial yang paling sering digunakan. Media ini
terdiri dari zat warna Kristal violet untuk menghambat pertumbuhan bakteri gram positif dan
jamur dan memungkinkan beberapa macam bakteri gram negatif batang tumbuh , netral red
sebagai pH indikator memberikan warna pink sampai merah pada koloni misalnya salmonella
spp. Untuk bakteri yang tidak meragikan laktosa misalnya shigella spp memberikan warna
koloni jernih transparan
Gambar 1. Media Mac conkey (meragi laktosa/kiri) dan (tidak meragi laktosa/kanan)
6. Phenyl ethyl alcohol (PEA)
PEA adalah agar darah domba yang ditambahkan phenyl etil alcohol untuk menghambat
pertumbuhan bakteri gram negatif darah domba 5% dalam PEA menyediakan kebutuhan nutrisi
untuk bakteri gram positif coccus seperti enterococcus, streptococcus dan staphylococcus
7. Perbenihan cair tioglikolat
Perbenihan cair tioglikolat adalah media penyubur, yang mengandung bahan-bahan nutrisi
seperti casein, ragi dan ekstrak daging sapi serta vitamin untuk mempercepat pertumbuhan ,
bahan lain yang ditambahkan indikator oksidasi-reduksi (resazurin), dextrose, vitamin K1 dan
hemin biasa ditambahkan pada media modifikasi thayer martin sebagai tambahan pada media
ditambahkan 0,075% untuk mencegah pengaruh oksigen langsung terhadap larutan , bahan
tambahan ini diberikan untuk memberikan suasasana anaerob pada bagian dasar tabung sehingga
bakteri anaerob dapat tumbuh
8. Agar darah
Gambar 2. Agar darah steril (kiri), α- hemolisa (tengah) dan β-hemolisa (kanan)
 Agar darah merupakan media yang paling banyak digunakan unuk penanaman bakteri yang
sukar tumbuh karena pada agar darah domba mengandung nutrisi yang dibutuhkan bakteri.
Kemudian pula koloni yang tumbuh pada media ini biasanya spesifik dan mudah dikenali. Media
pada dasarnya terdiri dari sumber protein(pepton), protein kedelai olahan (mengandung
KH),NaCl, agar dan darah domba 5%. Bakteri penghasil enzim ekstraseluler yang dapat
melisiskan sel darah merah domba pada agar (hemolisis). Aktifitas ini ditandai dengan adanya
zona jernih disekeliling koloni (beta hemilisis), kehijauan (alpha hemolisis) dan untuk bakteri
yang tidak menghemolisa darah tidak terjadi perubahan pada sekeliling koloni bakteri ( gamma
/non hemolisis)
9. Agar coklat dan Thayer martin
Agar coklat sama seperti agar darah tetapi pada agar coklat darah yang digunakan di lisiskan
terlebih dahulu sebelum dimasukan ke larutan agar. Setelah darah lisis sel eritrosit mengeluarkan
bahan-bahan intraseluler seperti haemoglobin, hemin,dan koenzim nicotinamide adenine
dinucleotida (NAD) yang dapat digunakan oleh bakteri yang sukar tumbuh. Darah yang lisis
memberikan warna coklat pada media sehingga disebut dengan agar coklat. Biasanya bakteri
patogen yang tumbuh pada media agar coklat yaitu: Neisseria meningitidis ,Haemophilus spp
(terlibat dalam infeksi saluran pernafasan dan telinga)
Agar Thayer martin
Thayer martin agar adalah media diperkaya dan selektif untuk isolasi Neisseria gonorhoeae.
Penambahan antibiotik colistin bertujuan untuk menghambat bakteri gram negatif, vancomisin
untuk menghambat bakteri gram positif dan nistatin menghambat pertumbuhan ragi. Antibiotik
trimetropin jugsa ditambahkan untuk menghambat perumbuhan Proteus spp, dan bakteri lainnya
yang akan tumbuh menyebar di seluruh permukaan agar dan dapat meghalangi koloni bakteri
yang akan diidentifiasi Neisseria spp. pada mredia modifkasi Thayer martin lewis, antibiotik
nistatin diganti dengan ansamisin
Gambar 3. Perumbuhan pada agar coklat dan thioglykolat
Sterilisasi media
Bahan media yang telah dilarutkan , baik media cair maupun untuk meda pdat harus dilakukan
terlebih dahulu melalui proses sterilisasi menggunakan Autoclave yaitu alat untuk mensterilkan
berbagai macam alat dan bahan yang digunakan dalam mikrobiologi menggunakan uap air panas
bertekanan. Tekanan yang digunakan pada umumnya 15 Psi atau sekitar 2 atm dan dengan suhu
 121⁰C (250⁰F). Jadi tekanan yang bekerja ke seluruh permukaan benda adalah 15 pon tiap inchi2
(15 Psi = 15 pounds per square inch). Lama sterilisasi yang dilakukan selama 15 menit. dan
waktu harus dihitung dimulai ketika suhu telah mencapai 121⁰ C . Setelah di autoclave media
harus mencapai suhu sekurangnya 50 ⁰C sebelum dituang ke dalam cawan petri steril (biasanya
25 ml untuk satu cawan petri) sedangkan untuk penambahan bahan-bahan seperti darah,
antibiotik, vitamin dan mineral harus ditambahkan pada saat agar dingin sebelum dituang ke
cawan petri. Untuk komponen media yang tidak tahan panas dapat dilakukan sterilisasi dengan
cara filtrasi membran
Lingkungan yang dibutuhkan untuk pertumbuhan mikroba
Kondisi lingkungan yang optimal akan mendukung pertumbuhan bakteri pada media
pembiakan, empat faktor lingkuangan yang paling penting, yaitu:
a) Tersedianya oksigen atau karbondioksida
Kebanyakan bakteri klinik adalah terdiri dari bakteri aerob, anaerob fakultatif atau anaerob
obligat. Bakteri aerob adalah bakteri yang menggunakan oksigen sebagai reseptor elektron.
Bakteri anaerob fakultatif dapat tumbuh pada kondisi aerob dan anaerob. Tetapi untuk bakteri
seperti Pseudomonas spp, Neisseria spp, Bordetela spp, Brucella spp dan Francisella spp adalah
bakteri obligat aerob yaitu bakteri yang tidak dapat tumbuh tanpa ada oksigen. Sedangkan
bakteri yang membutuhkan oksigen dalam jumlah sedikit disebut bakteri mikroaerofilik
b) Suhu
Bakteri pathogen biasanya tumbuh sangat baik pada suhu yang sama dengan suhu jaringan
dan organ tubuh hospes yaitu 37C walaupun demikian suhu pembiakan biasanya berada pada
rentang 35-37C. akan tetapi beberapa bakteri memerlukan suhu tertentu untuk inkubasinya
mislnya: campylobacter jejuni (42 C), listeria monocytogenes dan yersinia enterocolitica (dapat
tumbuh pada suhu 0 C tapi suhu optimum antara 20 dan 40 C
c) pH
pH adalah pengukuran konsentrasi ion hydrogen pada lingkungan mikroorganisme.nilai pH 7
menunjukkan kondisi netral, sedangkan pH lebih kecil dari 7 disebut asam dan lebih besar dari 7
disebut basa. Kebanyakan bakteri klinik menyukai kondisi pH diantara pH netral sekitar 6,7-7,5,
kebanyakan media yang diperjualbelikan telah mengandung buffer sehingga pengecekan ph
sudah tidak diperlukan lagi
d) Kelembaban
 Air merupakan komponen yang sudah terdapat dalam media, baik pada media padat
ataupun cair tapi untuk penyimpanan dalam jangka waktu yang lama saat pembiakan bakteri
akan menyebabkan kehilangan sebagian besar kadar air yang timbul karena proses evaporasi.
Kehilangan air dari media dapat mengganggu petumbuhan bakteri melalui dua cara yaitu:
o berkurangnya air yang merupakan komponen penting yang akan digunakan untuk metabolisme
bakteri
o dengan berkurangnya air maka konsentrasi zat terlarut dalam media akan meningkat, dengan
meningkatnya konsentrasi zat terlarut akan meningkatkan tekanan osmotik sehingga akan
menekan sel bakteri dan sel akan lisis
Isolasi bakteri
Isolasi atau pembiakan adalah proses menumbuhkan mikroorganisme dari tempat infeksi
(lingkungan in vivo) melalui berbagai spesimen dan menumbuhkan dalam lingkungan tiruan di
laboratorium (lingkungan invitro). Ketika bakteri tumbuh pada media, pada umumnya populasi
bakteri akan mudah diamati tanpa mikroskop karena berada dalam jumlah yang banyak berupa
koloni bakteri sehingga memungkinkan untuk identifikasi laboratorik selanjutnya . Keberhasilan
pemindahan bakteri dari lingkungan in vivo ke in vitro memerlukan nutrisi dan lingkungan yang
dibutuhkan oleh bakteri patogen tersebut. Karena pada lingkungan in vivo bakteri dapat
menggunakan berbagai hasil metabolik dan jalur fisiologik untuk pertumbuhan selama berada di
dalam tubuh hospes kemudian secara tiba-tiba harus dapat menyesuaikan diri dengan kondisi
tiruan di laboratorium. Dengan demikian sangatlah penting untuk menyediakan nutrisi yang
dibutuhkan dan lingkungan yang sesuai untuk pertumbuhan bakteri
Di dalam tubuh, populasi mikroba tidak terpisah sendiri menurut jenisnya, tetapi terdiri
dari campuran berbagai macam jenis bakteri untuk memisahkan bakteri patogen perlu dilakukan
isolasi di laboratorium populasi bakteri ini dapat diisolasi menjadi kultur murni yang terdiri dari
satu jenis yang dapat dipelajari morfologi, sifat dan kemampuan biokimiawinya.
Untuk memperoleh hasil yang baik dalam pertumbuhan bakteri maka perlu cara kerja
yang aseptik, dan sterilisasi ose sebelum digunakan mengambil koloni yang dicurigai sebagai
penyebab infeksi.
Inkubasi
Metode-metode yang digunakan untuk mengoptimalkan kondisi inkubasi :
 inkubasi dilakukan pada suhu optimum untuk pertumbuhan bakteri (35⁰C-37⁰C) dan kelembaban
udara yang mengandung CO2 sekitar 3-5%
untuk pertumbuhan bakteri yang memerlukan CO2 lebih banyak diperlukan inkubasi pada tempat
khusus yang mengandung CO2 (tablet natrium bikarbonat dengan kelembaban dan penutupan
yang sangat erat akan menghasilkan CO2 yang cukup , sebagai alternatif dapat juga dilakukan
inkubasi pada sungkup lilin yang dapat menghasilkan CO2 3%
Identifikasi bakteri
Setelah isolasi, bakteri yang tumbuh pada media perbenihan dilakukan identifikasi
dengan tahapan sebagai berikut:
1) Evaluasi morfologi koloni
Evaluasi morfologi koloni dengan memperhatikan warna koloni, bentuk koloni (seperti titik,
bundar, berfilamen,atau tidak beraturan), elevasi koloni (cembung, cekung, datar), serta batas
koloni (halus atau tidak beraturan)
2) Pemeriksaan mikroskopis
Pemeriksaan mikroskopis dengan cara pewarnaan gram dengan melihat diferensiasi (termasuk
bakteri gram positif atau negatif), bentuk (coccus, batang, koma, atau pleimorf), susunan
(sendiri-sendiri, diplo, berantai, atau seperti anggur)
3) Uji biokimia
Uji biokimia dilakukan untuk melihat karakteristik bakteri melalui reaksi biokimia, yang biasa
dilakukan diantaranya:
1. TSIA (Tripel Sugar Iron Agar)
Digunakan untuk identifikasi bakteri gram negatif batang, untuk melihat kemampuan meragi
glukosa dan sukrosa atau laktosa. Contohnya hasil untuk Escherichia coli (acid/acid), Salmonella
thypii (alkali/acid+H2S) sedangkan Pseudomonas aerugenosa (alkali/alkali)
Gambar 5. Hasil uji pada TSIA
2. Fermentasi karbohidrat/gula-gula
Gambar 6. Hasil positif (tabung berwarna kuning) fermentasi gula-gu
3. MR/VP (methyl red /voges proskauer)
Uji ini dilakukan untuk menentukan organisme yang memproduksi dan mengelola asam dan
produk-produknya dari hasil fermentasi glukosa, memperlihatkan kemampuan sistem buffer dan
 menentukan organism yang menghasilkan prosuk netral (asetil metal karbinol atau aseton) dari
hasil fermentasi glukosa
Gambar.7 hasil uji MR(kiri) dan VP(kanan)
4. SIM(sulfur, indol, motility)
Uji ini untuk mengetahui pergerakkan bakteri, produksi indol dan pembentukkan gas H2S
Gambar 8. Hasil uji pada media SIM
5. Simon citrate
Uji ini dilakukan untuk menentukkan bakteri yang menggunakan sitrat sebagai sumber karbon