Metode penelitian

1. Optimasi
a. Perbandingan fase gerak
b. Laju alir
c. Penentuan panjang gelombang
2. Validasi
a. Linearitas
Pembuatan kurva baku
b. Spesifitas
Placebo
c. Presisi
Sd,cv ,replikasi sampel
d. LOD LOQ

e. Reprodusibilitas
Sampel replikasi 3x, diukur puncaknya

1. Optimasi dan validasi

a. Pembuatan fase gerak dan penentuan laju alir
Fase gerak dibuat dalam 2 perbandingan antara metanol : aquabides yaitu 50:50 dan 40:60

Fase gerak dibuat dalam 100 ml, untuk perbandingan 50:50 diambil 50 ml metanol PA
kemudian disaring menggunakan saringan organik dan dimasukkan ke dalam labu takar 100
ml

Diambil 50 ml aquabides kemudian disaring menggunakan saringan non organik dan

ditambahkan ke dalam labu takar yang berisi metanol, lalu digojog.

Untuk perbandingan 40:60 diambil 40ml metanol PA kemudian disaring menggunakan

saringan organik dan dimasukkan ke dalam labu takar 100 ml

Diambil 60 ml aquabides kemudian disaring menggunakan saringan non organik dan

ditambahkan ke dalam labu takar yang berisi metanol, lalu digojog.

Masing-masing didegassing selama 5 menit

 Ditimbang parasetamol dan kafein masing-masing 120 mg dan 10 mg (penimbangan
dilakukan 2x), kemudian dilarutkan ke dalam fase gerak (dibuat 2 larutan untuk 2
perbandingan fase gerak)

Larutan diinjeksikan ke dalam sistem HPLC dengan fase gerak dan laju alir yang berbeda
yaitu 1 mL/menit dan 1,5 mL/menit.

Waktu tambat dan tekanan kolom dicatat pada tiap penyuntikan dengan berbagai
perbandingan fase gerak dan laju alir

b. Pembuatan larutan stok parasetamol (konsentrasi 1000 ppm)

Sebanyak 25 mg baku PCT ditimbang dengan seksama.

Dilarutkan dengan pelarut fase gerak, dituang ke labu takar 25 mL lalu

ditambahkan pelarut hingga tanda batas dan digojog.

c. Pembuatan larutan stok kafein (konsentrasi 1000 ppm)

Sebanyak 10 mg kafein ditimbang dengan seksama.

Dimasukkan ke dalam labu takar 10 mL lalu ditambahkan dengan pelarut fase gerak
hingga tanda batas dan digojog.

d. Pembuatan larutan seri campuran antara parasetamol (konsentrasi 120 ; 180 ;

240 ; 300 ; 360 ; dan 420 ppm) dan kafein (konsentrasi 10 ; 15 ; 20 ; 25 ; 30 dan
35 ppm)
Dari larutan stok parasetamol diambil 1,2 ; 1,8 ; 2,4 ; 3,0 ; 3,6 dan 4,2 mL masing-
masing dimasukkan ke dalam labu takar 10 mL.

Dari larutan stok kafein diambil 0,1 ; 0,15 ; 0,2 ; 0,25 ; 0,3 ; 0,35 mL masing-masing
dimasukkan ke dalam labu takar 10 mL yang berisi larutan stok parasetamol.
 Ditambahkan pelarut fase gerak hingga volume total larutan di dalam labu takar
mencapai tanda batas lalu digojog.

Larutan disaring menggunakan saringan nylon membrane dengan ukuran pori 0,45
μm.

Dilakukan degassing selama 5 menit.

e. Penentuan panjang gelombang maksimum

Dari larutan stok parasetamol diambil 1,2 mL dan 1,8 mL, kemudian masing-masing
dimasukkan ke dalam labu takar 10 mL.

Dari larutan stok kafein diambil 0,1 mL dan 0,15 mL, masing-masing dimasukkan ke
dalam labu takar 10 mL yang sudah berisi larutan seri parasetamol.

Pada masing - masing labu ditambahkan pelarut fase gerak hingga volume total larutan di
dalam labu takar mencapai tanda batas lalu digojog.

Larutan disaring menggunakan saringan nylon membrane dengan ukuran pori 0,45 μm.

Dilakukan degassing selama 5 menit.

Diambil larutan seri dengan konsentrasi 120ppm dan 180 ppm

Larutan diinjeksikan pada perangkat HPLC dengan fase gerak dan laju alir yang sudah

dioptimasi

Larutan dibaca serapannya pada panjang gelombang 200 nm - 300 nm, kemudian dilihat
serapan maksimumnya
 f. Pengukuran linearitas

Larutan seri campuran antara parasetamol (konsentrasi 120 ; 180 ; 240 ; 300 ; 360 ; dan 420 ppm)
dan kafein (konsentrasi 10 ; 15 ; 20 ; 25 ; 30 dan 35 ppm) disuntikkan dalam injector port
menggunakan HPLC syringe dengan fase diam kolom C 18 , fase gerak dan flow rate yang
telah dioptimasi. Kromatogram yang telah dihasilkan kemudian diamati.

Dengan metode regresi linier, memplotkan kadar (μg/mL) terhadap harga AUC dari seri
larutan kadar sehingga didapat persamaan y = bx + a (y = harga AUC, x = konsentrasi, b =
slope, a = intersept).
g. Pembuatan Larutan Sampel
Sebanyak 20 tablet Bodrex® ditimbang dan dihitung bobot rata-ratanya.

Tablet-tablet tersebut digerus hingga homogen.

Tablet yang telah digerus dibagi menjadi 5 bagian, masing-masing sebanyak 3330,6
mg.

Masing-masing bagian dilarutkan dalam pelarut (fase gerak) sebanyak 2 mL.

Dari larutan sampel dipipet 2,0 mL dan diencerkan dengan metanol hingga
didapatkan volume 10,0 mL.

Disaring dengan milipore dan di degassing selama 15 menit.

h. Penetapan kadar parasetamol dan kafein dalam sampel

Larutan sampel disuntikkan dalam injector port dengan menggunakan HPLC syringe
dengan fase diam kolom C 18 , panjang gelombang, fase gerak dan laju alir yang telah
dioptimasi

Kromatogram yang dihasilkan diamati.

 Dimasukkan harga AUC sampel dalam masing-masing persamaan kurva baku PCT dan
kafein sehingga didapatkan kadar PCT dan kafein dalam sampel (μg/mL).

Data disajikan dalam bentuk Χ ± SD dengan satuan mg/tablet.

Dilakukan replikasi sebanyak 3 kali.

i. Perhitungan Kadar Sampel

Setelah memperoleh AUC dari sampel kemudian di masukan dalam persamaan
regresi liniear kurva baku parasetamol dan kafein (y = bx + a).

Kemudian akan diperoleh nilai x yang merupakan kadar sampel

j. Pengujian akurasi dan presisi

1.sampel
2.tahap murni dan plasebo
Untuk menguji akurasi, dilakukan perhitungan % perolehan kembali dengan rumus:

Untuk menguji presisi, dilakukan perhitungan RSD atau CV dengan rumus:

k.