41

C. Populasi
1. Populasi
Populasi penelitian ini adalah tikus dewasa jenis Ratus

Norvegicus/Wistar jenis kelamin jantan usia 3-5 bulan dalam kondisi sehat

sebanyak 18 ekor dengan berat badannya rata-rata 150-215 gram,

perhitungan berat badan tikus dilakukan di Laboratorium hewan coba

Fakultas Kedokteran Universitas Wijaya Kusuma Surabaya. Perhitungan

sampel dilakukan dengan menggunakan metode Federer (1955).

2. Kriteria Inklusi :
a. Tikus putih jenis Wistar jenis kelamin jantan
b. Umur 3-5 bulan
c. Berat badan 150-215 gram
d. Kondisi sehat (aktif dan tidak cacat)
3. Kriteria Eksklusi :
a. Tikus mengalami sakit
b. Bobot tikus mengalami penurunan ( kurang dari 150 gram )
c. Tikus mati dalam masa penelitian
D. Sampel

Besar sampel penelitian dihitung dengan rumus Federer (1955):

(n-1) (t-1) ≥ 15

Keterangan:

n = Jumlah sampel

t = Jumlah kelompok

Dalam penelitian ini, tikus dibagi menjadi 3 kelompok yaitu

kelompok kontrol dan kelompok perlakuan 1 bulan dan kelompok

perlakuan 2 bulan sehingga didapatkan perhitungan sebagai berikut :

(n-1) (4-1) ≥ 15
 42

n-1 ≥5

n ≥6

Didapatkan jumlah sampel tiap kelompok sebanyak 6 ekor

sehingga jumlah sampel keseluruhan adalah 18 ekor.

E. Variabel Penelitian
1. Variabel Terikat / akibat (Dependent Variable)

Variabel terikat pada penelitian ini merupakan variabel yang berubah

akibat perubahan variabel bebas. Variabel terikat dalam penelitian ini yaitu

konsentrasi MMP-12 dalam epitel paru-paru dan inflamasi yang terjadi pada

epitel paru-paru.

2. Variabel Bebas / sebab (Independent Variable)

Variabel bebas pada penelitian ini adalah variabel yang bila berubah

akan mengakibatkan perubahan variabel lain. Variabel bebas dalam

penelitian ini adalah paparan asap rokok.

F. Definisi Operasional

1. Asap rokok adalah Asap yang di hembuskan dari sebatang rokok

kretek tanpa filter yang dinyalakan dan dihembuskan ke dalam

kandang kelompok tikus perlakuan.

2. Konsentrasi MMP-12 dalam epitel paru untuk mengevaluasi

Mmeningkatnya jumlah sel yang mengekspesikan MMP-12 dalam

paru hewan coba.

 43

3. Remodeling saluran napas atau perubahan struktur jaringan berupa

fibrotik napas, proliferasi sel otot polos,proliferasi sel epitel dan

proliferasi sel goblet dinding saluran napas.

G. Instrumen Penelitian

Instrumen merupakan suatu alat ukur pengumpulan data agar

memperkuat hasil penelitian. Instrumen yang digunakan dalam penelitian ini

adalah eksperimen yang berisi pemberian perlakuan yaitu paparan asap rokok

yang diberikan untuk tikus dewasa serta lembar checklist peneliti untuk

mengukur peningkatan MMP-12 dan hiperplasi sel saluran pernapasan setelah

pemaparan asap rokok.

1. Jenis Data

Data yang digunakan dalam penelitian ini meliputi data primer dan

data sekunder.

1. Data primer

Data yang diperoleh langsung dari epitel saluran napas

tikus dewasa yang terus-menerus terpapar asap rokok, terutama

akibat dari peningkatan MMP-12 antara lain seperti hiperplasi sel

saluran napas, hipersekresi mukus, serta penyakit yang ditimbulkan

baik akut maupun kronis.

 44

2. Data sekunder

Data tentang gambaran secara umum tentang kondisi tikus

dewasa yang dipapar asap rokok di Laboratorium Hewan FK

UWKS.

2. Bahan Penelitian

Tabel IV.1 : Kandungan partikulat, nikotin dan karbon monoksida

pada rokok

Merk rokok Particulate Nikotin (mg) Karbon monoksida

(mg) (mg)
Djarum 53,7 5,07 19,5

Dji Sam Soe 40,7 5,31 13,0

Gudang 52,0 5,28 18,2

Garam 48,3 5,10 19,7

Wismilak
(Dikutip dari: Cermin Dunia Kedokteran 1990,62:30-32, Rusiawati

Yuyus).

3. Rokok

Berdasar sumber data diambil dari: Rusiawati Yuyus, “Kandungan

partikulat, nikotin dan karbon monoksida pada rokok “Cermin Dunia

Kedokteran 1990,62:30-32, maka rokok yang dipakai dalam penelitian ini

adalah rokok kretek dengan merk yang umum dikonsumsi oleh masyarakat

Indonesia , karena kandungan partikulat, nikotin dan karbon

monoksidanya cukup besar. .

 45

4. Kandang pengasapan

Kandang pengasapan ( smoke chamber) hewan coba adalah

dimodifikasi dari bahan kaca dengan ketebalan 3 mm, ukuran kandang

pengasapan 50X30X30 cm3 dengan penutup dari kaca yang diberi lubang /

ventilasi diatasnya agar udara dari kandang atau dari luar kandang dapat

keluar / masuk ke dalam kandang .

Keterangan cara kerja pengasapan dengan asap rokok:

Tikus yang hendak di papar dengan asap rokok, diletakkan di ruang

tikus. Rokok yang sudah dinyalakan dengan korek api di letakkan pada

tempat pemegang rokok. Kipas angin dihubungkan dengan aliran listrik,

berfungsi menjaga agar rokok terus membara dan berfungsi mengarahkan

aliran udara dari kipas angin masuk kedalam ruang pengasapan dan

diteruskan naik ke lubang ventilasi yang terletak diantara ruang

pengasapan dan ruang tikus, sehingga tikus terpapar asap rokok.Selama

pemapaparan tikus tetap bisa bernapas karena tersedia lubang ventilasi

yang terletak diatas ruang tikus.

 46

E 3

D
C
A

1
B

Gambar IV.1 : Kandang Pengasapan ( Smoke Chamber), (Sumber design :

Int J Clin Exp Pathol (2009) 2,176-181)

5. Bahan Penelitian lain:

1. Binoculer mikroskop ; Alat bedah / incisisi jaringan ;Paraffine

Embedding;Korek api

2. Pisau microtome ;Spuit 1cc dan 3 cc masing- masing sebanyak 34

buah

3. Alcian Blue Periodic Acid Shiff ( AB-PAS) -Hematoxylin-

Eosin(HE)

4. Toluidine Blue ; Resin; Chlor Ethil Eter Spray;Cairan Formalin

4%.

5. Cairan Heparin 1 flx; Cairan fiksasi 4% Glutaraldehide

6. Ketalar 10% dalam 0,9% sodium chloride Injeksi.

7. Rokok kretek 2 batang / hari x 3 ekor tikus x 60 hari kerja = 360

batang rokok kretek.

 47

H. Prosedur Penelitian

TIKUS DEWASA JANTAN

KELOMPOK KELOMPOK
KONTROL PERLAKUAN

I II
DIBUNUH
BULAN BULAN BULAN
KEDUA PERTAMA KEDUA

Pengecatan IHC antibody MMP-12

Intensitas Terdapat Sel

warna Sel Positif atau
positif pada Sel Negatif
perbesaran
Pemilihan berat badan tikus dengan pada
cara menimbang satu-persatu,
400x perbesaran
400x badan 150-215 gram dan
dengan kriteria tikus dewasa jantan dengan berat

umur 3-5 bulan dalam kondisi sehat.

Kelompok tikus dewasa jantan masing-masing dibagi menjadi

kelompok kontrol, perlakuan bulan 1 dan perlakuan bulan 2. Kebutuhan

pakan bagi seekor tikus setiap harinya kurang lebih sebanyak 10% dari bobot

tubuhnya jika pakan tersebut berupa pakan kering dan dapat ditingkatkan

sampai 15% dari bobot tubuhnya jika pakan yang dikonsumsi berupa pakan

basah. Kebutuhan minum seekor tikus setiap hari kira-kira 15-30 ml air.

Jumlah dapat berkurang jika pakan yang dikonsumsi sudah banyak

mengandung air (Smith,1988). Peneliti memberikan pakan BR1 dicampur

 48

dengan nasi yang sudah matang dan diberi minum secukupnya serta

penggantian alas serbuk kayu setiap minggu sekali yang fungsinya untuk alas

tikus di kandang perawatan tikus pada setiap kelompok..

Kemudian setiap tikus kelompok perlakuan bulan 1 dan bulan 2,

dipapar asap rokok dari dua batang rokok kretek perhari dengan merk

“Trubus Coklat” yang mengandung TAR 34mg dan Nikotin 2.1mg, diberikan

pada hari kerja (Senin- Jumat) selama 1 bulan dan 2 bulan. Pada bulan ke 1

pada kelompok perlakuan 1 dan bulan ke 2 pada kelompok perlakuan bulan

ke 2, tikus dikorbankan dengan cara ether. Secepat mungkin organ paru

direndam dalam formalin 10%, kemudian diambil jaringan alveoli dan

bronkiolus untuk dibuat preparat patologi anatomi dan imunohistokimia

dengan cara dimasukkan dalam cairan fiksasi 4% Glutaraldehide, dibekukan

dengan parafine embedding, selanjutnya dipotong menggunakan pisau

mikrotom dengan ketebalan 4µm. Dilakukan pengecatan menggunakan

Hematoxylin- Eosin (HE) untuk preparat patologi anatomi, dan pengecatan

khusus untuk preparat imunohistokimia antibody MMP-12. Preparat yang

telah diproses lengkap kemudian dilihat dengan mikroskop.

Di dalam satu kandang terdiri dari 6 ekor tikus di dalamnya,

apabila salah satu tikus di dalam bertengkar maka tikus akan di pindahkan

ke dalam kandang lain untuk menghindari kematian.

Tikus yang telah dibunuh, bangkai nya dibuang melalui tempat

sampah kemudian dibakar di dalamnya.

 49

Gambar IV.2 Kandang pemeliharaan tikus

yang terdiri dari 6 ekor tikus dalam 1

kandang.

I. Pengumpulan dan Pengolahan Data

Data yang dikumpulkan meliputi infeksi saluran napas akut

maupun kronis, lama paparan asap rokok, peningkatan MMP-12 pada

epitel paru yang dikumpulkan dengan cara :

Metode Pemeriksaan
Pemeriksaan histopatologi ini dimaksudkan untuk mengetahui ekpresi

MMP-12 pada paru-paru tikus. Ekpresi MMP-12 pada setiap sampel

dinilai secara semikuantitatif menurut metode Remmele yang sudah

dimodifikasi (Novak et al., 2007), dimana Indeks skala Remmele

(Immuno Reactive Score/IRS) merupakan hasil perkalian antara skor

persentase sel immunoreaktif dengan skor intensitas warna pada sel

immunoreaktif (tabel IV.2). Data setiap sampel merupakan nilai rata-rata

IRS yang teramati pada 5 (lima) Lapangan Pandang (LP) berbeda pada

pembesaran 400x.
 50

Tabel IV.2 Skala semikuantitatif IRS (Immuno Reactive Score) merupakan hasil

perkalian antara skor persentase sel positif (A) dengan Skor Intensitas reaksi

warna (B), jadi IRS = ( A x B )

A B

Skor 0 : tidak ada sel positif Skor 0 : tidak ada reaksi warna

Skor 1 : Sel positif kurang dari 10% Skor 1 : Intensitas warna rendah

Skor 2 : Sel positif antara dari 11% - 50% Skor 2 : Intensitas warna sedang

Skor 3 : Sel positif antara dari 51% - 80% Skor 3 : Intensitas warna kuat

Skor 4 : Sel positif antara dari lebih dari 80%

J. Analisis dan Pengolahan Data

1. Anova One Way

Tabel IV.3 : Tabel Anova One Way

Jumlah Kuadrat Derajat Kebebasan (db)

N–1
Total
Jumlah total kasus minus satu
k–1
Antar kelompok
Jumlah kelompok minus satu
(n1 - 1) + (n2 – 1) + … (nk – 1)

Dalam kelompok Penjumlahan dari jumlah kasus dalam

tiap kelompok minus satu

 51

Untuk mengetahui perbedaan antar kelompok perlakuan (I, II, III)

menggunakan rumus Anova One Way (Anova Satu Jalur). Anova satu jalur

digunakan untuk menguji signifikansi perbedaan mean lebih dari dua

kelompok yang berlainan akibat penggunaan beberapa perlakuan (treatment

levels) pada satu variabel bebas (X). Berikut penjelasannya:

1. Notasi

Dalam penelitian eksperimen yang melibatkan beberapa kelompok

sampel, setiap sampel diberi perlakuan (treatment) yang berbeda sehingga

ada k kelompok. Jumlah total sampel dalam penelitian eksperimen tersebut

adalah n1+n2+n3+nk=N

2. Jumlah kuadrat total (JKtot)

Satuan ini menunjukkan keseluruhan variasi dalam data yang

diperoleh dan merupakan jumlah kuadrat deviasi seluruh hasil observasi

atau data individu dari mean total.

3. Memilah jumlah kuadrat total

Jumlah kuadrat total dapat dipilah ke dalam dua bagian yang

terpisah namun bisa saling dijumlahkan, yakni jumlah kuadrat dalam

kelompok (JKdal) dan jumlah kuadrat antar kelompok (JKant).

4. Mean kuadrat (MK)

 52

Mean kuadrat adalah variance estimate. Mean kuadrat juga dipilah

menjadi dua yaitu MKdal dan MKant. Diperoleh dengan cara membagi

Jumlah Kuadrat (JK) yang bersangkutan dengan Derajat kebebasan (db)

yang bersangkutan pula.

5. Rasio- F

Untuk menguji hipotesa. Diperoleh dari rasio Mean kuadrat antar

kelompok (MKant) dengan Mean kuadrat dalam kelompok (MKdal).

Tabel IV.4 : Rumus Anova One Way

Sumber
JK Db MK F
variasi
JK ant
k–1
❑
( ∑ X ² ) ( ∑ X tot ² ) db ant
Antar ¿∑ −
❑ n N

(n1 - 1)

+ (n2 – JK dal MK ant

Dalam
(∑ X ² ) db dal MK dal
¿ ∑ X tot ²−∑ 1) + …
n
(nk – 1)

N–1
❑
(∑ X tot ² )
Total ¿ ∑ X tot ²−
❑ N

6. Pengujian hipotesis main effect.

 53

Hipotesis yang diuji, yaitu:

H0: Tidak terdapat perbedaan pengaruh variabel treatment

terhadap variabel kritera, seluruh varians populasi adalah

sama.

H1: Terdapat perbedaan pengaruh variable treatment terhadap

variable kriteria, seluruh varians populasi adalah berbeda.

Dasar dari pengambilan keputusan adalah:

- Jika probabilitas (p) > 0,05, maka H0 diterima

- Jika probabilitas (p) < 0,05, maka H0 ditolak

Kriteria pengujian:

- H0 diterima, jika Fhitung < Ftabel 0,05, dan

- H0 ditolak, jika Fhitung > Ftabel 0,05.

Penelitian ini menggunakan desain faktorial 2x2, maka

digunakanlah analisis varians dua arah (Two Way ANOVA), yaitu cara

yang digunakan untuk menguji perbedaan variansi dua variabel atau lebih.

Unsur utama dalam analisis variansi adalah variansi antar kelompok dan

variansi di dalam kelompok. Variansi antar 28 kelompok dapat dikatakan

sebagai pembilang dan variansi di dalam kelompok sebagai penyebut.

Beberapa asumsi yang harus dipenuhi pada uji ANOVA yaitu:

 54

a) Varians homogen (sama)

b) Sampel kelompok dependent atau independent ketegorikal

c) Data berdistribusi normal

Struktur Informasi pokok analisis ANOVA antara lain:

a) Deskripsi rata-rata dan standar deviasi dari sampel.

Pada tabel Descriptive nilai mean, standar deviasi, dan nilai

minimum serta maksimum dapat diketahui.

b) Uji Homoskedastisitas

Dengan hipotesis:

H0: varians k populasi sama

H1: varians k populasi berbeda

Bila nilai Sig. di dapat > α maka hipotesis nol ditolak dan

hipotesis satu diterima dengan kata lain asumsi kesamaan

ragam terpenuhi.

c) Hasil uji beda rata-rata k populasi ) Terlihat pada tabel ANOVA,

Bila nilai signifikansi atau p-value didapat ≤ α, maka hipotesis

nol ditolak dan hipotesis satu diterima dengan kata lain

minimal ada satu diantara tiap populasi yang memiliki

 55

perbedaan rata-rata. Oleh karena itu uji ANOVA dipenuhi.

(Trihendradi,2005)