THE Journal of Biological Chemistry VOL. 285, NO. 13, hlm.
9339 -9345, 26 Maret 2010
Karakterisasi biokimia dari oksigenasi dari Lemak Tak
Jenuh Asam oleh dioksigenase dan hidroperoksida
Isomerase dari Pseudomonas aeruginosa 42A2□
Diterima untuk publikasi, 22 Oktober, 2009, dan dalam bentuk direvisi, 23 Desember 2009 Diterbitkan, Makalah JBC di Tekan, 14 Januari 2010, DOI 10,1074 /
jbc.M109.078147
Eriel Martínez‡ § 1. mats Hamberg¶2. Montse Busquets", Pilar Díaz**. Angeles Manresa§ 3. dan Ernst H. Oliw‡ 4
Dari ‡ Divisi Biokimia Farmakologi, Departemen Farmasi Bioscience, Uppsala Biomedis Pusat,
PO. box 591. SE-751 24 Uppsala. Swedia. the §Laboratorsaya de Mikrobiologi. Facultat de Farma`cia, itu ** Laboratori de Mikrobiologi,
Facultat de Biologia, dan "Departament de Bioquimica i Biologia Molekuler, Universitat de Barcelona, Barcelona E-08028,
Spanyol, dan ¶Department Medis Biokimia dan Biofisika, Karolinska Institutet, S-171 77 Stockholm, Swedia
Kami telah mempelajari oksigenasi asam lemak oleh
ekstrak sel dari Pseudomonas aeruginosa 42A2. Asam oleat
((9z) -18: 1) diubah ke (10S) -hydroperoxy- (8E) asam -
octadecenoic ((10S) -HPOME) dan (7S, 10S) -dihydroxy- (8E)
-octadece- noic acid (7,10-DiHOME). Percobaan di bawah
oksigen-18 menunjukkan bahwa 7,10-DiHOME terkandung
oksigen dari udara dan dibentuk secara berurutan dari (10S) -
HPOME dengan isomerisasi. (10R) -HPOME tidak
diisomerisasi. The (10S) -dioxygenase dan isomerase
hidroperoksida kegiatan co-dielusi pada kromatografi
pertukaran ion dan filtrasi gel dengan ukuran lar molecu-
jelas~ 50 kDa. 16: 1n-7, 18: 2n-6, dan 20: 1n-11
juga oksigen untuk 7,10-dihidroksi asam lemak, dan
(8z) -18: 1 itu oksigen ke 6,9-dihydroxy- (7E) asam
-octadecenoic. Serangkaian asam lemak dengan
ikatan ganda diposisikan dekat dengan ((6Z) -18: 1,
(5Z, 9z) -18: 2) atau lebih jauh dari gugus karboksil
((11Z) -, (13z) -, dan (15Z) -18: 1) adalah substrat
miskin. Mekanisme oksigenasi dipelajari dengan
[7S-2H] 18: 1n-9, [7R-2H] 18: 2n-6, dan [8R-2H] 18: 2n-6
sebagai substrat. Pro-R hidrogen pada C-8 hilang dalam
biosintesis (10S) -HPODE, sedangkan hidrogen pro-S hilang
dan pro-R hidrogen dipertahankan pada C-7 selama
biosintesis dari 7,10-dihidroksi metabolisme. Analisis
komposisi asam lemak dari P. aeruginosa mengungkapkan
jumlah yang relatif besar (9E / Z) -16: 1 dan (11E / Z) -18: 1
dan hanya jejak 18: 1n-9. Kami menemukan bahwa (11Z) -18:
1 (asam vaccenic) telah trans dibentuk untuk (11S, 14S) -
dihydroxy- (12E) asam -octadecenoic dan campuran 11- dan
12-HPOME, mungkin karena untuk membalikkan orien - tasi
dari (11Z) -18: 1 di situs aktif dibandingkan dengan asam
oleat. Mekanisme reaksi dari gests yang isomerase
hidroperoksida nyarankan- kesamaan katalitik untuk
sitokrom P450.
asam lemak tak jenuh dapat beroksigen ke array yang luas
dari mediator lipid oleh lipoxygenases, asam lemak heme yang
mengandung
□
S
Itu online versi dari ini artikel (tersedia di http://www.jbc.org)
mengandung Gambar tambahan. S1-S7.
1
didukung oleh Sebuah beasiswa dari Comisio'n antar kementerian de
Ciencia y Tec-
nología, Spanyol (CICYT) Proyek CTQ2007-60749 / PPQ.
26 Maret 2010 • VOLUME 285 • NOMOR 13
© 2010 oleh The American Society for Biochemistry and Molecular Biology, Inc. Dicetak di Amerika Serikat
S
oksigease, dan P450.5 Lipoxygenases terjadi pada tanaman
dan mamalia dan mengubah asam lemak tak jenuh ganda
untuk hidroperoksida, yang dapat lebih diubah menjadi triena
leuko-, asam jasmonat, dan produk lainnya bersifat signifikan
biologis (1-3). Cyclooxygenases dan Sintase diol jamur juga
membentuk hidroperoksida, yang diisomerisasi untuk
endoperoxides prostaglandin dan dihidroksi asam lemak,
masing-masing (4, 5). P450 mengkatalisis hidroksilasi dari m-
akhir asam lemak, dation epoxi- ikatan ganda, dan hidroksilasi
dengan migrasi ikatan ganda (6). Oksigenasi asam lemak
terutama telah stud- ied pada eukariota, tetapi banyak
penelitian sekarang menunjukkan bahwa Pseudomo- nas
aeruginosa dapat mengoksidasi asam lemak tak jenuh untuk
hydroper- oxy dan metabolit dihidroksi (7-15).
P. aeruginosa adalah patogen oportunistik penting
pasien immunocompromised, membakar korban, dan pasien
dengan fibrosis kistik (16, 17). Infeksi yang sulit diobati
dengan biotics anti karena bakteri Gram-negatif ini juga
membentuk racun dan faktor virulensi lainnya. Pada tahun
1988, P. aeruginosa 42A2 ditunjukkan untuk mengoksidasi
asam oleat untuk surfaktan baru, droxy metabolit asam lemak
dihy- (7). Produk ini kemudian diidentifikasi sebagai (7S, 10S)
-dihydroxy- (8E) asam -octadecenoic ((7S, 10S) -Di- HOME)
oleh Hou dan rekan kerja menggunakan P. aeruginosa
ketegangan PR3 (8, 10, 15 ). Kita sekarang tahu bahwa
produksi (7S, 10S) - DiHOME merupakan karakteristik dari P.
aeruginosa (13). Strain 42A2 dan PR3 juga membentuk 10-
hidro (per) oxy- (8E) asam -octadecenoic (10-H (P) OME)
(18), dan chirality itu bertekad untuk menjadi 10S (11). asam
palmitoleat dan risinoleat juga ditemukan oxy- genated dalam
cara yang sama seperti asam oleat (9,
Mekanisme biosintesis dari (10S) -HPOME dan
(7S, 10S) -DiHOME tidak dipahami dengan baik. Genom
P. aeruginosa dibariskan pada tahun 2000, dan ini memberikan impor-
Informasi tant. Satu urutan (PA1169 dari Pseudomonas
data base genom (19)) ditetapkan sebagai lipoxygen- diduga
2
Didukung oleh Vetenskapsrådet Natur och Teknik.
3
didukung oleh CICYT Proyek CTQ2007- 60.749 / PPQ dan Comissio' Interde-
partamental de Recerca i Tecnologia Proyek 2005GR00143.
4
Didukung oleh Vetenskapsrådet Medicin (proyek 3X-06.523), Formas (222- 2005-
1733), dan The Knut dan Alice Wallenberg Foundation (2004,0123). Untuk siapa
Jurusan Kimia HAYATI 9339
 korespondensi harus ditangani. Tel .: 46-18-4714455; Fax:46-18-
4714847; E-mail:Ernst.Oliw@farmbio.uu.se.
9340 Jurusan Kimia HAYATI
5
Singkatan yang digunakan adalah: P450, P450; CP, fase kiral; 7,10-
DiHOME, (7S, 10S) -dihydroxy- (8E) asam -eicosenoic; (7S, 10S)
RUMAH -Di-, (7S, 10S) -dihydroxy- (8E) asam -octadecenoic;
DiHOME, asam cosenoic dihydroxyei-; (7S, 10S) -DiHOME, (7S,
10S) -dihydroxy- (8E) asam -octadecenoic; (11S, 14S) -DiHOME,
(11S, 14S) -dihydroxy- (12E) asam -octadecenoic; DOX,
dioksigenase; GC, kromatografi gas; MS, spektrometri massa; MS /
MS, tandem MS; (10S) -Rumah, (10S) -hydroxy- (8E) asam -
octadecenoic; 8-Hode, asam 8-hydroxylinoleic; HPLC, kinerja tinggi
chro- cair matography; (10S) -HPOME, (10S) -hydroperoxy- (8E)
asam -octadecenoic; 11-HPOME, 11-hydroperoxy- (12E) asam -
octadecenoic; 12-HPOME, 12-hy- droperoxy- (10E) asam -
octadecenoic; LC, kromatografi cair.
VOLUME 285 • NOMOR 13 • 26 Maret 2010
 Dioksigenase dan hidroperoksida Isomerase dari P.
aeruginosa
pepton, 2,5 g glukosa, 5 g NaCl, dan 2,5 g KH2PO4.
ase. Sebuah lipoxygenase kemungkinan juga terdeteksi dalam
6
genom bakteri kedua, Sorangium cellulosom (20). Vance et al. Jernere'n,F., Sesma, A., Francheschetti, M., Hamberg, M., dan Oliw, EH, (2010)
(21) menemukan bahwa P. aeruginosa disekresikan sebuah J. Biol. Chem. 285, 5308 -5316.
arakidonat 15-Li poxygenase dan dinyatakan protein ini
dengan bantuan dari urutan PA1169. Sejauh yang diketahui,
lipoxygenases hanya mengoksidasi asam oleat perlahan (22).
Di sisi lain, oksigease asam lemak heme yang
mengandung dapat mengoksidasi asam oleat untuk
hydroperoxy asam lemak, tetapi tidak ada homolog yang
jelas untuk cyclooxygenases, (10R) -DOX, lino- leate diol
synthase, atau-DOX dalam genom P . aeruginosa. P450
dapat mengoksidasi asam lemak dan asam lemak isomerize
hydroperoxy (6, 23). Menariknya, genom
P. aeruginosa berisi dua gen dengan homologi P450 (PA2475
dan PA3331). (10S) -Rumah telah disarankan untuk diubah ke
(7S, 10S) -DiHOME oleh hidroksilasi (11, 15), tetapi
isomerisasi 10S-HPOME ke 7,10-diol juga kemungkinan
karena dinilai dari isomerase hidroperoksida ity activ- dari
linoleat diol synthase (5, 23, 24).
Tujuan dari penelitian ini adalah untuk menentukan NISM-
mekanisme biosintesis dari 7,10-DiHOME. Tujuan pertama
kami adalah untuk memurnikan sebagian aktivitas sintase diol
dan untuk menentukan berat molekul jelas. Kedua, mekanisme
sintesis bio metabolit 7,10-dihidroksi diselidiki dengan
(I) stereospecifically deuterated asam lemak atau (ii) (10S) -
dan (10R) -HPOME sebagai substrat dan dengan (iii)
eksperimen di bawah oksigen-18 gas. Kami juga melakukan
penyelidikan sistematis kekhususan substrat dan produk
dengan serangkaian 18 meric regioiso-: asam lemak 1.
Akhirnya, kami menemukan bahwa P. aeruginosa adalah kaya
akan asam vaccenic, dan oleh karena itu kita diselidiki asi
oksigen sebesar P. aeruginosa 42A2 oleh ekstrak sel
semipurified.
PROSEDUR PERCOBAAN
bahan-Fatty asam dilarutkan dalam etanol dan disimpan
dalam larutan stok (50 -100 mM) pada -20 ° C. 18: 1n-9
(99%), 18: 1n-7, 18: 2n-6 (99%), 18: 3n-6 (99%), dan 18: 3n-3
(99%) adalah
dari Sigma; semua asam lemak lainnya (98 -99%) berasal dari
Larodan (Malmo, Swedia) atau Lipidox (Stockholm, Swedia).
oleat acid (90%) dari Fluka digunakan untuk menginduksi
ekspresi enzim. Pip- eronyl butoksida (Fluka) dan 1-
aminobenzotriazole (Fluka) dilarutkan dalam etanol (1 M
saham solusi). [(8R) -2H] 18: 2n-6 (64% 2H) dan [(7R) -2H]
18: 2n-6 (41% 2H) dibuat seperti yang dijelaskan (5, 25) 6;
[(7S) -2H] 18: 1 (~ 70% 2H) diperoleh dengan metode yang
sama. Oksigen-18 (99%) berasal dari Icon (Summit, NJ).
P. aeruginosa (42A2) ditumbuhkan seperti yang dijelaskan
(27). Precoated TLC piring (0,25-mm Silica Gel 60A, 20 × 20
atau 5 × 20 cm), asam Molybdatophosphoric, dan pepton dari
kasein dan kedelai makan yang dari Merck. SepPak / C18
cartridge berasal dari Waters (Milford, MA).
Persiapan dan Pemurnian dari diol Synthase Sel Fraksi-
P. aeruginosa 42A2 ditumbuhkan semalam di piring agar (30
g / liter TSA: 15 g tryptone (mencerna kasein), 5 g NaCl, 5 g
soytone, dan 15 g agar-agar per liter) dan dikumpulkan. Sel-sel
disentrifugasi dan ditangguhkan dalam larutan Ringer (OD ~
2), dan 1 ml dipindahkan ke 50 ml TSB: 17 g pepton, 3 g
26 Maret 2010 • VOLUME 285 • NOMOR 13 Jurusan Kimia HAYATI 9339
Dioksigenase dan hidroperoksida Isomerase dari P. min) diresapi untuk tuning. Produk terbentuk dari
aktivitas enzim diinduksi oleh tumbuh dengan 1%
aeruginosa stereospecifically deuterated 18: 2n-6 dianalisis seperti
asam oleat (18 jam, 30 ° C; 250 rpm). Sel-sel dicuci
yang dijelaskan (5) 0,6 Isi rium deute- dari [2H] 18: 2n-6
dua kali dengan Ringer, disuspensi kembali dalam
ditentukan dengan LC-MS / MS analisis (m / z 276 -282 3
0,05 M Tris-HCl (pH 7,0; 4 ° C), dan disonikasi (tiga
full scan) atau dengan analisis GC-MS.
kali selama 1 menit masing-masing) di atas es
Yang normal fase-HPLC dengan analisis MS / MS
(Branson Sonifier B-15). Setelah sentrifugasi (8000 ×
dilakukan dengan kolom asam silikat (5 m; Kromasil 100SI,
g, 5 menit, 4 ° C), supernatan disaring dan kemudian 250 × 2 mm, Dalco Chromtech) menggunakan 1-3% isopropil
dipekatkan dan dicuci dengan diafiltrasi (Amicon, alkohol dalam heksana untuk
Millipore-15 Ultra, volume akhir, 1 ml). Sebuah
alikuot persiapan ini (10 -20 ml) digunakan untuk
sebagian besar studi tentang aktivitas enzim dan
disebut sebagai ekstrak sel semipurified. protein
dimurnikan dengan filtrasi gel (tricorn Superdex 200
10/300 GL (GE Healthcare)), dielusi dengan 0,05 M
Tris-HCl (pH 7,0) pada 1 ml / menit (0,5 megapascal)
di tography chroma- sistem (A KTA FPLC, GE
Healthcare). standar massa molekul yang BSA (66 kDa),
ovalbumin (45 kDa), sinogen tryp- (24 kDa), dan
lisozim (14,3 kDa) dari Sigma. Fraksi dengan aktivitas
enzim digabungkan dan dimurnikan dengan
kromatografi pada Mono-Q 5/50 dengan gradien di 0,05
M Tris-HCl (pH 7,0) dari 0 ke 1 M NaCl dalam 20
menit (mengalir 2 ml / menit). Sebuah alikuot (10 ml)
dari masing-masing fraksi (0.5- 0,3 ml) diuji untuk
aktivitas diol sintase menggunakan asam oleat sebagai
substrat, dan produk-produk yang dirilis dianalisis
dengan KLT (heksana / dietil eter / asam asetat;
75:15:10) . Lempeng disemprot dengan asam
Molybdatophosphoric dan dipanaskan untuk
memvisualisasikan produk.
biokonversi Tes-Fatty asam (1-5 mM) di 0,05 M
Tris- HCl (pH 7,0) dibuat dari larutan stok dalam
etanol, dan diinkubasi dengan 0,02 volume
persiapan enzim semipurified dijelaskan di atas
(biasanya 0,5 mg protein / ml, uji Bradford (28))
sampai to1h pada 37 ° C dengan sesekali vor-
texing. reaksi diakhiri oleh pengasaman sampai pH
2-3 dengan 0,5 M HCl dan kemudian diekstraksi
dengan etil asetat atau pada cartridge C18 (SepPak
/ C18). Produk biasanya dianalisis dengan pra
parative TLC, diikuti dengan analisis LC-MS / MS.
The Km dari fraksi semipurified ditentukan dalam
rangkap tiga dengan Measures suring jumlah 7,10-
diol (analisis LC-MS / MS) terbentuk dari 0,7, 1,1,
1,5, dan 1,9 mM asam oleat (10 menit, 37 ° C).
Pengaruh CO pada oksigenasi asam oleat dinilai
dalam buffer dengan CO terlarut dan di bawah
atmosfer CO parsial.
LC- dan GC-MS Analisis-Reversed fase-HPLC
dengan analisis MS / MS dilakukan dengan pompa
Surveyor MS (ThermoFisher) dan kolom analitis
oktadesil silika (5 m; 2,0 × 150 mm; Phenomenex),
yang biasanya dielusi dengan metanol / air / asam
asetat, 800: 200: 0,05, 0,3 ml / menit. limbah itu
tunduk ionisasi electrospray dalam spektrometer
massa ion trap (LTQ, ThermoFisher). Transfer
kapiler dipanaskan diatur pada 315 ° C, lebar ion
isolasi ditetapkan pada 1,5 unit massa atom, dan
energi tabrakan ditetapkan pada 25-35 (skala
sewenang-wenang). Prostaglandin F1A (100 ng /

9340 Jurusan Kimia HAYATI VOLUME 285 • NOMOR 13 • 26 Maret 2010

 Dioksigenase dan hidroperoksida Isomerase dari P.
aeruginosa
SEBUAH

Absorbansi 280 nm (MAU)

400 TLC

300

200

100

0
510 152.025
Waktu (min)
B

Absorbansi 280 nm (MAU)

80 TLC

60
GAMBAR 1. Analisis LC-MS / MS dari produk yang terbentuk dari asam
oleat dengan diol persiapan synthase. Puncak, Kromatogram
menunjukkan elusi (10S) -Rumah (m / z 297 3 full scan). Bawah, elusi 40
7,10-DiHOME dan (10S) - HPOME (m / z 313 3 full scan). C18 kolom
dielusi dengan metanol 80%.
20

pemisahan asam lemak hidroksi dan 5-7% isopropil alkohol

0
dalam heksana untuk pemisahan DiHOME (0.3- 0,5 ml /
menit; Constra- metrik 3200 pompa, LDC / MiltonRoy). 2,5 5.0 7.510.012.5
Efluen com- dikombinasi dengan isopropil alkohol / air (3: 2; Waktu (min)
0.2- 0,3 ml / menit) dari pompa kedua (Surveyor MS pompa)
(5). efflu- gabungan
Ent diperkenalkan oleh ionisasi electrospray ke spektrometer 7.0, dan laju reaksi adalah optimal pada suhu 37 ° C (suplemen Gambar.
massa ion trap (LTQ, ThermoFisher). analisis sterik dari 8- S1)
Hode dilakukan oleh CP-HPLC-MS / MS (Chiralcel- OBH)
(29), sedangkan hidroperoksida terbentuk dari (9z) -18: 1 dan
(11Z) -18: 1 oleh fotooksidasi dipisahkan oleh CP -HPLC
(Reprosil kiral NR atau NR-R) (30).
analisis GC-MS dan sintesis metil ester asam lemak dan
turunannya eter trimethylsilyl dilakukan seperti yang
dijelaskan (31). nilai karbon diperkirakan dari waktu retensi
dari asam lemak jenuh metil ester (31). analisis sterik dari
11,14- DiHOME dilakukan setelah ozonolysis dari (-) -
derivatif menthoxycar- bonyl seperti yang dijelaskan (32).

HASIL
Kegiatan Diol Synthase oleat
Minyak mentah atau sel semipurified ekstrak P. aeruginosa
cepat berubah 18: 1n-9 ke (7S, 10S) -DiHOME dan (10S) -
HPOME (Gambar 1.). (10S) -Rumah juga terdeteksi bersama
dengan sejumlah kecil 8-HOME oleh analisis LC-MS / MS.
Persiapan dan pemurnian jumlah 1-mg produk enzimatik
utama dalam budaya P. aeruginosa dijelaskan dalamtambahan
bahan. (10S) -HPOME adalah substrat miskin dibandingkan
dengan asam oleat, sedangkan transformasi (10S) -Rumah ke
7,10-diol tidak dapat dideteksi. Perbandingan oksidasi asam
oleat dan jumlah yang sama dari asam oleat plus (10S) -
HPOME menunjukkan bahwa yang terakhir bukan dihambat
daripada aug- mented biosintesis dari 7,10-diol (analisis TLC).
Kegiatan diol sintase ini menunjukkan optimum pH sekitar pH

26 Maret 2010 • VOLUME 285 • NOMOR 13 Jurusan Kimia HAYATI 9341

Dioksigenase dan hidroperoksida Isomerase dari P.
GAMBAR 2. pemurnian parsial dari aktivitas diol sintase dari
aeruginosa
P. aerugi- nosa. SEBUAH, Gel filtrasi dengan analisis TLC
aktivitas enzim. Enzim dielusi antara 15 dan 17 menit,
menunjukkan ukuran molekul~50 kDa berdasarkan waktu elusi
standar protein. B, kromatografi pertukaran ion. The
NaClgradien dimulai pada 5 menit, dan aktivitas diol
synthase terelusi setelah 7,5 menit (analisis TLC) di ~0,3 M
NaCl dalam buffer elusi.

dan adalah linear untuk setidaknya 10 menit (data

tidak ditampilkan). The Km diperkirakan 1,7 mM
(bahan tambahan). Pembentukan DiHOME
tampaknya berkurang ~ 30 dan ~ 50% oleh 1 dan 5
mM 1-aminobenzotriazole (a nonspesifik dan
ireversibel P450 inhibitor) (33), masing-masing,
sedangkan tidak CO maupun butoksida P450
inhibitor piperonil (5 mM) ( 34) muncul untuk
menghambat kegiatan diol synthase.

Parsial enzim Pemurnian

Kegiatan diol synthase tunduk sekuensial tion
purifica- dengan filtrasi gel dan dengan
kromatografi pertukaran ion (Mono-Q), seperti
yang ditunjukkan pada Gambar 2. Analisis SDS-
PAGE menunjukkan multitafsir, pita protein tiple
pada tahap ini.; analisis TLC menunjukkan bahwa
aktivitas dioksigenase dijelaskan di bawah itu tak
lepas dari aktivitas isomerase hidroperoksida. Elusi
aktivitas enzim pada filtrasi gel dalam
hubungannya dengan standar protein (ovalbumin,
45 kDa; bovine serum albumin, 66 kDa)
menyarankan massa molekul jelas ~ 50 kDa.

substrat Kekhususan
Kami selanjutnya memeriksa kekhususan substrat
thase diol syn dari ekstrak sel semipurified. Kami
pertama kali mempelajari serangkaian regioisomeric
18: 1 asam lemak. Hasilnya dirangkum dalam

9342 Jurusan Kimia HAYATI VOLUME 285 • NOMOR 13 • 26 Maret 2010

 Dioksigenase dan hidroperoksida Isomerase dari P.
aeruginosa
TABEL 1
Ringkasan oksigenasi asam lemak untuk diol oleh
aktivitas diol synthase dari ekstrak P. aeruginosa
Berlemak acidsDiols
16: 1
(9z) -16: 1 (7 S, 10S) -Dihydroxy- (8E) asam -hexadecenoicSebuah
18: 1
(8z) -18: 1 (6 S, 9S) -Dihydroxy- (7E) -octadecenoic asamb
(9z) -18: 1 (7 S, 10S) -Dihydroxy- (8E) asam -
c
octadecenoic (9E) -18: 1ND
(11Z) -81: 1 (11 S, 14S) -Dihydroxy- (12E) asam -octadecenoic
(13z) -18: 1ND
risinoleat Asam (7 S, 10S, 12R) -trihydroxy- (8E) asam -octadecenoicd
18: 2
(9z, 12z) -18: 2 (7 S, 10S) -Dihydroxy- (8E, 12z) asam -octadecadienoice
(5Z, 9z) -18: 2ND
C20-C24 GAMBAR 3. analisis LC-MS dari anion karboksilat dari 7,10-DiHOME
(9z) -20: 1 (7 S, 10S) -Dihydroxy- (8E) asam - dibentuk di bawah suasana oksigen-18. MS spektrum [7,10-16O] 7,10-
eicosenoic (13z) -22: 1ND
DiHOME menunjukkan anion karboksilat pada m / z 313, sedangkan
18
(15 Z) -24: 1ND [7,10-
2
Sebuah
Ref. 14. HAI2] 7,10-DiHOME memiliki yang sesuai ion pada m / z 317. Kita tidak
b
Struktur dikonfirmasi dengan analisis GC-MS dari turunan trimethylsilyl eter metil
bisa mendeteksi [7,10-16O18O] 7,10-DiHOME pada m / z 315,
ester (data tidak ditampilkan).
menunjukkan bahwa kedua hidroksil oxy- gens berasal dari molekul
c yang sama dari O2. Spectra dicatat dengantampilannya resolusi pindai.
ND, transformasi yang signifikan tidak dapat
terdeteksi. d Ref. 9.
e
Struktur dikonfirmasi dengan analisis GC-MS.7 Metabolit lainnya diidentifikasi SEBU B
dengan 100 AH 314,3 100 313,3
analisis LC-MS / MS.

Kelimpahan relatif
Kelimpahan relatif
Tabel 1 bersama dengan data sebelumnya pada oleat,
palmitoleat, dan ric- asam inoleic. Dengan pengecualian
asam vaccenic, common denominator substrat adalah rantai
karbon tak jenuh dari gugus karboksil pada ikatan rangkap 50 50
cis pada posisi 9,10, sedangkan ikatan ganda di 8,9
mengakibatkan lambat tapi signifikan konversi. ikatan 313,3
314,3
ganda tambahan antara gugus karboksil dan 9z ikatan ganda 315,3
transformasi terhambat. 7,10- DiHOME menunjukkan
fragmentasi tak terduga selama MS / MS analisis karena 316.3 315,3
0 0
fragmen dengan biaya migrasi ke m-end; sebuah studi
sistematis yang spektrum MS / MS dilaporkan
elsewhere.7 313 314 317 313 315
Kami juga menyelidiki 18: 2n-6, 20: 1n-9, 20: 1n-11, dan isomerase hidroperoksida.
20: 2n-6 (Tabel 1) dan menemukan bahwa 18: 2n-6 (suplemen
Gambar. S4) Dan 20: 1n-11 yang teroksidasi, sedangkan
metil ester asam oleat tidak substrat. Hasil penelitian
menunjukkan bahwa substrat mungkin mengikat 'kepala'
situs aktif pertama karena jarak dari gugus karboksil pada
ikatan rangkap pertama kali muncul untuk menjadi kritis
dan tidak jarak dari m-end ke ikatan rangkap. Kami
menemukan satu pengecualian. Oksigenasi asam vaccenic
mungkin disebabkan karena untuk membalikkan orientasi
pada situs aktif (lihat di bawah).

Mekanisme oksigenasi
The hidroperoksida Isomerase Kegiatan-Experiments per-
dibentuk di bawah oksigen 18-suasana dengan asam oleat
sebagai Strate sub mengungkapkan bahwa kedua kelompok
hidroksil dari 7,10-DiHOME terkandung baik oksigen-18 atau
oksigen-16, tapi kami tidak bisa mendeteksi formasi yang
signifikan dari diol dengan kedua isotop Pres- ent (Gambar. 3).
Dalam sebuah percobaan terpisah di bawah oksigen-18, kami
mampu mengisolasi [18O2] (10S) -HPOME (> 95% 18O2).
Yang terakhir diubah oleh enzim untuk [18O2] 7,10-DiHOME
(bahan tambahan). Kami menyimpulkan bahwa 7,10-
DiHOME dibentuk dari (10S) -HPODE dalam reaksi
26 Maret 2010 • VOLUME 285 • NOMOR 13 Jurusan Kimia HAYATI 9341
Dioksigenase dan m/z
hidroperoksida Isomerase m/z dari P. 10S-HPOME itu diisomerisasi ke
aeruginosa
GAMBAR analisis 4. LC-MS produk terbentuk selama oksidasi [(7S) -
2
H] 18: 1 (~70% 2H) ke (10S) -HPODE dan (7S, 10S) -DiHOME. SEBUAH,
Parsial MS
spektrum pada waktu retensi (10S) -HPODE. Sinyal utama
dari anion boxylate mobil- pada m / z 314 menunjukkan
bahwa [7S-2H] dipertahankan. B, parsial MS spec- trum
pada waktu retensi 7S, 10S-DiHOME. Intensitas sinyal pada
m / z 313 dan m / z 314 menunjukkan bahwa hidrogen
dihilangkan, menunjukkan abstraksi dari pro-S hidrogen
pada C-7. Spectra direkam dengan resolusi zoom scan.
Kami selanjutnya disiapkan (10R) -HPOME oleh
fotooksidasi dan dimurnikan stereoisomer ini
dengan CP-HPLC. (10R) -HPOME tidak substrat
(analisis TLC;suplemen Gambar. S2), Sedangkan
7
Nilsson, T., Martinez, E., Manresa, A., dan Oliw, EH (2010) cepat
Commun. massa Spectrom. 24, 777-783.
9342 Jurusan Kimia HAYATI
7,10-DiHOME di bawah
kondisi yang sama.
Mekanisme reaksi dipelajari dengan [(7S) -2H] 18: 1n-9
sebagai substrat. Seperti ditunjukkan dalam Gambar. 4, label
deuterium dipertahankan dalam 10-hidroperoksida namun
kalah di 7,10-diol. Hasil ini menunjukkan oksigenasi
suprafacial di C-7. Hal ini dikonfirmasi oleh biokonversi [(7R)
-2H] 18: 2n-6, yang mengakibatkan [(7R) -2H] 7,10-DiHOME
(mate- tambahan rial). Label ini juga dipertahankan di 13-
Hode, dibentuk oleh aktivitas lipoxygenase persiapan ini (21).
The (10S) Kegiatan -DioxygenaseAsam -Linoleic dioksidasi
lambat dibandingkan dengan asam oleat. Kami menemukan
bahwa deuterium
label [(8R) -2H] 18: 2n-6 hilang di 10-Hode dan juga di 7,10-
dihydroxy- (8E, 12z) asam -octadecadienoic, tapi kami
menegaskan bahwa label dipertahankan dalam produk
lipoxygenase
VOLUME 285 • NOMOR 13 • 26 Maret 2010
 Dioksigenase dan hidroperoksida Isomerase dari P.
aeruginosa
menyarankan bahwa 10S-hidroperoksida dibentuk oleh abstraksi dari
pro-R hidrogen pada C-8 dan antarafacial

GAMBAR 5. Analisis cis dan trans konfigurasi asam lemak tak jenuh
tunggal di P. aeruginosa setelah trans hidroksilasi untuk asam lemak
vicinal dihidroksi ing correspond-. asam palmitoleat dan vaccenic yang
iDEN- tified sebagai produk utama, dan hanya jejak asam oleat dapat
dideteksi. asam lemak dengan konfigurasi cis diol bentuk threo.

13-Hode dari persiapan yang sama (suplemen Gambar. S5).

Akhirnya, sejumlah kecil 8-Hode juga terdeteksi. Analisis
sterik oleh CP-HPLC menunjukkan bahwa 8-Hode adalah
campuran dari stereoisomer S dan R dalam ~ 3: 7 rasio dan
bisa di bagian diproduksi secara enzimatik.

Oksigenasi Asam Vaccenic

Lemak analisis asam menunjukkan bahwa membran sel P.
aeruginosa mengandung palmitoleat ((9z) -16: 1),
palmitelaidic ((9E) -16: 1), dan cis dan asam trans vaccenic
(18: 1n-7), seperti yang ditunjukkan pada Gambar. 5. Hanya
jejak asam oleat dapat dideteksi (data tidak ditampilkan).
Hal ini diketahui bahwa (9z) -16: 1 teroksidasi oleh sintase
diol dari
P. aeruginosa (14), tetapi asam vaccenic cis belum investigasi
terjaga keamanannya. Kami menemukan bahwa asam lemak
ini beroksigen tetapi untuk sebuah metabolit yang tak terduga,
(11S, 14S) -DiHOME. Yang terakhir ini diidentifikasi dengan
analisis GC-MS (Gambar. 6A) setelah pemurnian dengan
TLC. Nilai C adalah 20,8. Posisi ikatan ganda ditentukan oleh
ozonolysis, dan konfigurasi alkohol dengan pemisahan (-) -
turunan menthoxycarbonyl produk biologi dan standar otentik
pada GC-MS (Gambar 6B.).
LC-MS / MS analisis mengungkapkan bahwa biosintesis
(11S, 14S) - DiHOME didampingi oleh pembentukan
campuran 11-HPOME dan 12-HPOME (suplemen Gambar.
S6). The 11- dan 12-hidroperoksida dari (11Z) -18: 1 disusun
oleh tooxidation pho- dengan biru metilen di metanol (35),
dipisahkan, dan dianalisa oleh CP-HPLC-MS. spektrum massa
triple (dukungan- plemental Gambar. S7) Menegaskan bahwa
campuran 11-HPOME dan 12-HPOME terbentuk dari (11Z) -
18: 1. Nampaknya (11S) -HPOME adalah diisomerisasi ke
(11S, 14S) -DiHOME, tapi ini tidak diteliti lebih lanjut.

DISKUSI
Kami melaporkan bahwa P. aeruginosa mengungkapkan
asam lemak diol syn thase bertanggung jawab untuk
transformasi berurutan asam oleat ke (10S) -HPOME dan (7S,
10S) -DiHOME. Enzim ini juga oxygenates, meskipun lambat,
asam linoleat dan beberapa asam lemak lainnya. Transformasi
stereospecifically deuterated asam oleat dan linoleat
26 Maret 2010 • VOLUME 285 • NOMOR 13 Jurusan Kimia HAYATI 9343
Dioksigenase dan hidroperoksida Isomerase dari P.
aeruginosa ditransformasikan ke (11S, 14S) -DiHOME dan 11- HPOME,
mungkin dengan orientasi terbalik di situs aktif (Gambar 8
dan.suplemen Gambar. S6).
Sebuah pertanyaan yang jelas adalah sifat (10S) -DOX dan
aktivitas enzim isomerase hidroperoksida. The ide isomerase
hydroperox- menunjukkan fitur tak terduga; (10S) -HPOME
perlahan-lahan berubah ke 7,10-diol dibandingkan dengan
oleat

GAMBAR analisis 6. GC-MS dari 11,14-DiHOME dan

analisis sterik setelah ozonolysis. A, elektron berdampak
spektrum massa trimethylsilyl eter metil ester turunan dari
11,14-DiHOME. Nilai C adalah 20,8. B, ysis anal- sterik dari
gugus hidroksil dari 11,14-DiHOME. 11,14-DiHOME itu
diderivatisasi dengan (-) -menthoxycarbonyl klorida dan
tunduk ozonolysis, yang menghasilkan 2-hydroxyhexanoic
dan asam 2-hydroxydodecane-1,12-dioic cara derivatisasi.
Top, ion kromatogram direkonstruksi menunjukkan bahwa
turunan dari asam 2-hydroxyhexanoic memiliki waktu retensi
yang sama seperti 2S stereo- isomer (co-injection dengan
turunan ini (2R, 2S) asam -hydroxyhexanoic). Bawah, ion
kromatogram direkonstruksi menunjukkan bahwa turunan
dari asam 2-hydroxydodecane-1,12-dioc memiliki waktu
retensi yang sama dengan stereoisomer 2S (co-injection
dengan (2R, 2S) asam -hydroxydodecane-1,12-dioic) .
Analisis produk biologi saja menghasilkan puncak tunggal
(data tidak ditampilkan). Hasil penelitian menunjukkan
bahwa (11S, 14S) -dihydroxy- (12E) asam -octadecenoic
dibentuk. Kondisi adalah sebagai berikut: oven GC pada 260
° C, isotermal.

oksigenasi, sedangkan 7,10-diol terbentuk oleh tion

abstrac- pro-S hidrogen pada C-7 dan oksigenasi
suprafacial. Mekanisme reaksi diuraikan dalam
Gambar. 7.
Sebuah penyelidikan sistematis kekhususan
substrat nyarankan- gested bahwa enzim yang
diperlukan rantai karbon jenuh dari gugus karboksil
ke cis ikatan ganda pertama antara C-8 dan C-9 atau
antara C-9 dan C-10, sedangkan asam lemak dengan
rantai karbon yang lebih panjang ((13z) -18: 1 dan
(15Z) -18: 1) tidak teroksidasi (Tabel 1). Pengamatan
dan studi dari (9z) -16: 1, (9z) - 20: 1, dan (11Z) -20:
1 menyarankan bahwa asam lemak oksigen terikat
pada enzim dengan gugus karboksil mereka di
mempunyai posisi relatif tetap ke situs katalitik. Kami
menemukan satu pengecualian; (11Z) -18: 1
9344 Jurusan Kimia HAYATI VOLUME 285 • NOMOR 13 • 26 Maret 2010
 Dioksigenase dan hidroperoksida Isomerase dari P.
aeruginosa
GAMBAR 7. Mekanisme biosintesis dari asam oleat diol synthase dari
P. aeruginosa. Sifat enzim (10S) -DOX tidak diketahui, sedangkan
mekanisme reaksi dari isomerase hidroperoksida konsisten dengan P450
katalisis.
GAMBAR 8. Skema pandangan oksidasi asam vaccenic ((11Z) -18: 1) oleh
P. aeruginosa. The 11,14-diol dapat divisualisasikan sebagai terbentuk
dari (11S) -HPOME oleh orientasi kebalikan dari asam lemak di dua
situs aktif dibandingkan dengan orientasi asam oleat (lih Gambar. 7).
12-HPOME juga dibentuk (luwes- jiwa Gambar. S6), Namun senyawa
ini tampaknya tidak diisomerisasi untuk diol.
asam dan juga mengurangi tingkat oksigenasi asam oleat.
Sejauh yang diketahui, isomerase hidroperoksida milik
keluarga dari P450, dan suprafacial hidrogen abstraksi dan
oksigenasi khas untuk keluarga enzim ini (23). Genom P.
aerugi- nosa pao1, yang berkaitan erat dengan 42A2 dan sering
digunakan untuk perbandingan, hanya dua P450 homolog.
Apakah
26 Maret 2010 • VOLUME 285 • NOMOR 13
dua P450s ini memiliki aktivitas isomerase hidroperoksida jelas
manfaat penyelidikan lebih lanjut.
The (10S) kegiatan -DOX yang menarik di kanan mereka
sendiri. Genom P. aeruginosa tidak mengandung homolog
yang jelas untuk oksigease heme yang mengandung asam
lemak (cyclooxygenases, Sintase diol linoleat, 10-DOX,
dan-DOX), dan monoun- asam lemak jenuh yang substrat
miskin untuk lipoxygenases (22). Selanjutnya, pemurnian
parsial dari (10S) -DOX dan kegiatan isomerase
hidroperoksida menyarankan bahwa mereka terkait. Massa
molekul diperkirakan dengan filtrasi gel untuk menjadi
~ 50 kDa. Pengamatan bahwa (10S) -HPODE diubah
dengan 7,10-diol kurang efisien dari prekursor, asam oleat,
menyarankan bahwa (10S) -DOX dan isomerase
hidroperoksida ities activ- secara fungsional ditambah. The
(10S) aktivitas -DOX mungkin melibatkan abstraksi
hidrogen pada C-8 oleh logam katalitik sehingga bermigrasi
ganda obligasi (9z 3 8E), dan karbon radikal berpusat di C-
10 bereaksi dengan molekul oksigen dan membentuk
hidroperoksida di analogi dengan (10R) -DOX dari
aspergilli (26). Penentuan apakah 7,10-diol synthase terdiri
dari satu enzim dengan kedua dioksigenase dan kegiatan
ase isomer- hidroperoksida atau dua enzim terpisah menanti
studi lebih lanjut.
Apa fungsi biologis dari synthase diol dari
P. aeruginosa? Asam oleat adalah substrat disukai, dan enzim
yang ekspresi diinduksi dengan menumbuhkan P. aeruginosa
di hadapan asam oleat. Bakteri ini mengandung asam oleat
sedikit dibandingkan dengan asam palmitoleat dan vaccenic.
Enzim prokariota langka ini mungkin berhubungan dengan
modifikasi dari lipid mem- brane dan / atau berhubungan
dengan modifikasi lipid. Atau, gabungan (10S) -DOX dan diol
kegiatan synthase bisa berkontribusi untuk detoksifikasi asam
lemak dalam lingkungan bakteri, mempromosikan kolonisasi
dan pertumbuhan. biokonversi ini mungkin juga berkontribusi
terhadap produksi lipins oxy- selama pertumbuhan pada
jaringan tanaman yang kaya asam oleat. Dalam konteks ini,
aktivitas antijamur dari (7S, 10S) -DiHOME adalah est antar
(lihat Ref. 15 untuk review). Kami menyimpulkan bahwa P.
REFERENSI
1. Kuhn, H., Saam, J., Eibach, S., Holzhu¨tter, HG, Ivanov, I., dan Walther,
M. (2005) Biochem. Biophys. Res. Commun. 338, 93-101
2. Liavonchanka, A., dan Feussner, I. (2006) J. Tanaman Physiol. 163, 348 -357
3. Schneider, C., Pratt, DA, Porter, NA, dan Brash, AR (2007) Chem. Biol.
14, 473- 488
4. Smith, WL (2008) Tren Biochem. Sci. 33, 27-37
5. Garscha, U., Jernere'n, F., Chung, D., Keller, N. P., Hamberg, M., dan Oliw,
EH (2007) J. Biol. Chem. 282, 34.707-34.718
6. Oliw, EH (1994) Prog. Res lipid. 33, 329 -354
7. Mercade, E., Robert, M., Espuny, MJ, Bosch, MP, Manresa, MA, Parra,
JL, dan Guinea, J. (1988) J. Am. Minyak Chem. Soc. 65, 1915-1916
8. Hou, CT, Bagby, MO, Plattner, RD, dan Koritala, S. (1991) J. Am.
Minyak Chem. Soc. 68, 99 -101
9. Kuo, TM, Manthey, LK, dan Hou, CT (1998) J. Am. Minyak Chem. Soc.
75, 875- 879
10. Gardner, HW, dan Hou, CT (1999) J. Am. Minyak Chem. Soc. 76,
1151-1156
11. Kim, H., Gardner, HW, dan Hou, CT (2000) J. Am. Minyak Chem. Soc.
77, 95-99
12. Kuo, TM, Kim, H., dan Hou, CT (2001) Curr. Microbiol. 43, 198 -203
13. Kuo, TM, dan Nakamura, LK (2004) Curr. Microbiol. 49, 261-266
Jurusan Kimia HAYATI 9345
Dioksigenase
14. dan
Bae, JH, Kim, DS, Suh, hidroperoksida Isomerase
MJ, Oh, SR, Lee, IJ, Kang, SC, Hou, CT, dari P.
aeruginosa

9346 Jurusan Kimia HAYATI VOLUME 285 • NOMOR 13 • 26 Maret 2010

 Dioksigenase dan hidroperoksida Isomerase dari P.
aeruginosa
dan Kim, HR (2007) Appl. Microbiol. Biotechnol. 75, 435- 440
15. Hou, CT (2009) Nat. Biotechnol. 26, 2-10
16. Yetkin, G., Otlu, B., Cicek, A., Kuzucu, C., dan Durmaz, R. (2006) Am.
J. Menginfeksi. Kontrol 34, 188 -192
17. Lyczak, JB, Cannon, CL, dan Pier, GB (2002) Clin. Microbiol. Wahyu
15, 194 -222
18. Guerrero, A., Casals, I., Busquets, M., Leon, Y., dan Manresa, A. (1997)
Biochim. Biophys. Acta1347, 75- 81
19. Winsor, GL, Van Rossum, T., Lo, R., Khaira, B., Whiteside, MD,
Hancock, RE, dan Brinkman, FS (2009) Asam Nukleat Res. 37, D483-
D488
20. Porta, H., dan Rocha-Sosa, M. (2001) Mikrobiologi 147, 3199 -3200
21. Vance, RE, Hong, S., Gronert, K., Serhan, CN, dan Mekalanos, JJ (2004)
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101, 2135-2139
22. Clapp, CH, Senchak, SE, Stover, TJ, Potter, TC, Findeis, PM, dan Novak,
MJ (2001) J. Am. Chem. Soc. 123, 747-748
23. Kurang ajar, AR (2009) Fitokimia 70, 1522-1531
24. Brodhun, F., Gobel, C., Hornung, E., dan Feussner, SAYA. (2009) J. Biol.
Chem.
26 Maret 2010 • VOLUME 285 • NOMOR 13
284, 11.792-11.805
25. Hamberg, M., Zhang, LY, Brodowsky, ID, dan Oliw, EH (1994) Arch.
Biochem. Biophys. 309, 77- 80
26. Garscha, U., dan Oliw, EH (2009) J. Biol. Chem. 284, 13.755-13.765
27. Vidal-Mas, J., Busquets, M., dan Manresa, A. (2005) Antonie Van Leeu-
wenhoek 87, 245-251
28. Bradford, MM (1976) Anal. Biochem. 72, 248 -254
29. Garscha, U., dan Oliw, EH (2007) Anal. Biochem. 367, 238 -246
30. Garscha, U., Nilsson, T., dan Oliw, EH (2008) J. Chromatogr. B analyt.
Technol. Biomed. Hidup Sci. 872, 90 -98
31. Oliw, EH, Stark, K., dan Bylund, J. (2001) Biochem. Pharmacol. 62,
407- 415
32. Hamberg, M. (1971) Anal. Biochem. 43, 515-526
33. El-Kattan, AF, Poe, J., Buchholz, L., Thomas, HV, Brodfuehrer, J., dan
Clark, A. (2008) Obat Metab. Lett. 2, 120 -124
34. Ning, D., Wang, H., dan Zhuang, Y. (2009) Biodegradasi, di press
35. Chaco'n, J. N., Gaggini, P., Sinclair, R. S., dan Smith, F. J. (2000) Chem. Phys.
Lemak 107, 107-120
Jurusan Kimia HAYATI 9347