Prinsip kerja KCKT adalah pemisahan komponen analit berdasarkan

kepolarannya, artinya komponen pada suatu analit (sampel) akan terpisah berdasarkan
sifat kepolaran masing-masing kompone dalam sampel, apakah kepolarannya lebih mirip
dengan fasa diam, maka dia akan tertinggal di fasa diam atau bergerak lebih lambat, atau
kah kepolarannya lebih mirip dengan fasa gerak sehingga dia akan bergerak terdistribusi
lebih jauh dan lebih cepat. Fasa gerak dalam KCKT adalah berupa zat cair dan disebut
juga eluen atau pelarut. Fasa gerak yang digunakan adalah air dan methanol dengan
perbandingan 3 : 1 yang bersifat lebih polar, sedangkan fase diamnya berupa kolom C18
bersifat lebih non polar. Hal ini disebabkan karena senyawa yang dianalisis yaitu
paracetamol bersifat lebih polar. Molekul polar dalam campuran itu akan menghabiskan
sebagian besar waktu mereka bergerak dengan pelarut. Senyawa non polar dalam
campuran akan cenderung membentuk atraksi dengan gugus hidrokarbon karena gaya
disperse Van Der Walls. Mereka juga akan kurang larut dalam pelarut karena
membutuhkan pemutusan ikatan hydrogen sebagaimana halnya diantara molekul-molekul
air atau methanol. Maka jenis teknik kromatografi yang digunakan adalah kromatografi
fase balik. (Ganjar, 2009)

Pada KCKT fase gerak selain berfungsi membawa komponen-komponen

campuran menuju detector, fase gerak dapat berinteraksi dengan solut-solut. Oleh karena
itu, fase gerak dalam KCKT merupakan salah satu faktor penentu keberhasilan proses
pemisahan. Fase gerak sebelum digunakan harus disaring terlebih dahulu untuk
menghindari adanya partikel-partikel kecil. Selain itu, adanya gas dalam fase gerak juga
harus dihilangkan, sebab adanya gas akan berkumpul dengan komponen lain terutama di
pompa dan detector sehingga akan mengacukan analisis. Sebelum melakukan analisis
setiap hari, seorang analis harus memastikan bahwa sistem dan prosedur yang digunakan
harus mampu memberikan data yang dapat diterima. Hal ini dilakukan dengan percobaan
kesesuaian system yang didefinisikan sebagai serangkaian uji untuk menjamin bahwa
metode tersebut dapat menghasilkan akurasi dan presisi yang dapat diterima. Uji
kesesuaian system ditunjukkan untuk memastikan efektivitas system operasional dari
system kromatografi sebelum digunakan untuk analisis, terutama analisis kuantitatif.
(Day, R.A., A.L. Underwood. 2002)
 Farmakope Amerika (United States Pharmacopeia, USP) menentukan parameter-
parameter yang dapat digunakan untuk menetapkan kesesuaian sistem sebelum dianalisis.
Parameter-parameter yang dapat digunakan, yaitu: bilangan lempeng teori (N), factor
tailing, kapasitas (k’ atau ɑ) dan nilai standar deviasi relative (RSD) tinggi puncak dan
luas puncak dari serangkaian injeksi. Uji kesesuaian system dinyatakan memenuhi syarat
apabila nilai Simpangan Baku Relatif (SBR) < 2,0%. Dari hasil pengamatan yang
dilakukan, diperoleh nilai SBR adalah 1,043850347 , sedangkan pada waktu retensi SBR
- nya adalah 5,3061808 . Menunjukkan bahwa system yang digunakan memenuhi syarat,
tetapi pada waktu retensi SBR tidak memenuhi syarat. Hal ini terjadi kemungkinan
adanya kesalahan pada saat pengerjaan.

Analisis yang digunakan dalam percobaan kali ini adalah analisis kualitatif dan
analisis kuantitatif. Analisis kualitatif dilakukan dengan membandingkan waktu retensi
larutan uji dengan waktu retensi larutan standar. Waktu retensi adalah waktu yang
diperlukan sampel untuk keluar kolom. Sedsngkan analisis kuantitatif adalah dilakukan
dengan menghitung konsentrasi sampel berdasarkan luas area puncak kromatogram
dengan menggunakan metode kurva yang menghitungkan konsentrasi dengan
menggunakan persamaan garis serta metode one point. (Hendayana, Sumar. 2006)

Pengujian kualitatif parasetamol menggunakan teknik HPLC. Diawali dengan

menginjeksikan sampel uji dan standar yaitu larutan yang sebelumnya telah disaring
dengan membrane filter PTFE kedalam kolom HPLC dengan injector khusus yang
bervolume 20μL, penyaringan sebelum penginjeksian ini dilakukan agar tidak terjadi
penyumbatan didalam kolom dan menghilangkan gas dari pelarutnya. Larutan didorong
cepat saat melalui kolom dengan bantuan pompa bertekanan tinggi. Komponen akan
keluar dari kolom dengan kecepatan yang berbeda dan terdeteksi oleh detector. Detector
yang digunakan adalah detector UV karena paracetamol merupakan senyawa organic
yang dapat menyerap sinar UV karena memiliki gugus kromofor pada strukturnya.
Analisis kualitatif dilakukan dengan menentukan waktu retensi dan luas area
kromatogram larutan sampel atau uji. Konsentrasi larutan uji adalah 50,2 ppm dan luas
areanya adalah 31334905 karena mendekati luas area pada larutan standar yaitu
37578231menunjukkan larutan uji mengandung paracetamol.
 Kemudian dilakukan analisis kuantitatif yang bertujuan untuk menentuka kurva
kalibrasi dan cara one point. Untuk cara kurva kalibrasi perhitungan kadar dilakukan
dengan persamaan garis y = bx + a.

Yang dipilih adalah y pada luas area 31334905

b: didapat dari persamaan regresi linear yaitu b = 711154,51

x: konsentrasi dari larutan standar

a: didapat dari persamaan regresi yaitu a = 75698,3

Lalu didapat x adalah 43,9556 ppm, setelah itu dapat dihitung kadar dari paracetamol
adalah 106,6375%. Untuk penentuan kadar paracetamol dengan cara one point kadar yang
didapat adalah 101,552%. Berdarkan literature dari farmakope, Paracetamol mengandung tidak
kurang dari 98,0% dan tidak lebih dari 101,0%. Dari cara kedua diatas sama-sama menunjukkan
%kadar yang bagus, akan tetapi metode dari kurva kalibrasi lebih baik dibandingkan dengan
metode one point karena hasilnya hampir mendekati dengan syarat yang diberlakukan oleh
farmakope.

Gandjar, Gholib, dan Rohman, 2009. Kimia Farmasi Analisis. Pustaka

Pelajar: Yogyakarta
R.A.Day, Dr Jan Dan Al - Underwood. 2002. Analitik Kimia Kuantitatif. Jakarta:
Erlangga