4.

3 Budidaya

Bagian ini memberikan fitur yang menonjol dari budidaya leptospiral in vitro dan resep
yang terkait untuk pertumbuhan leptospiral yang sukses menggunakan informasi
terutama berasal dari Faine et al. (1999) dan Zuerner (2005). Untuk metodologi yang
sangat informatif, rinci dan kondisi kultur untuk pemeliharaan laboratorium Leptospira
dan pertumbuhan in vivo Leptospira di laboratorium hewan pembaca diarahkan ke buku
klasik oleh Faine et al. (1999) dan Protokol Lancar dalam artikel Mikrobiologi yang
ditulis oleh Zuerner (2005) dan Haake (2006). Penjelasan leptospirosis pada hewan
laboratorium juga dapat ditemukan dalam bab oleh William A. Ellis, buku ini.

Salah satu persyaratan penting untuk persiapan semua larutan dan media yang diperlukan
untuk pembudidayaan Leptospira adalah penggunaan air suling kaca atau air yang telah
disterilkan dengan autoklaf (secara rutin 20 menit pada 121 ° C) dan kemudian
didinginkan. Sterilisasi diperlukan untuk menghilangkan leptospira saprophytic yang
terdapat di sumber air. Satu juga harus dicatat bahwa sterilisasi filter tidak dapat
digunakan di tempat autoklaf, karena Leptospira saprofitik dapat melewati filter
mikrobiologi. Faktor penting lainnya dalam keberhasilan penyebaran leptospira
patogenik adalah sumber dan kualitas suplemen serum albumin yang ditambahkan ke
media yang berfungsi sebagai detoxicant asam lemak. Bentuk albumin yang paling sering
digunakan adalah albumin serum bovin (BSA). Analisis berbagai BSA berbeda untuk
kesesuaian mereka untuk budidaya leptospiral yang sukses, terutama untuk isolasi
leptospira dari sampel klinis, sangat penting. Setelah identifikasi banyak BSA yang
sesuai, pembelian sejumlah besar lot khusus direkomendasikan untuk menyediakan
bahan yang cukup untuk budidaya yang sukses di masa depan. BSA juga dapat
didelipidasi dengan ekstraksi serbuk kering dengan kloroform / metanol (2: 1, vol / vol).
Filter 0,22 μm, sebagai pengganti autoklaf, harus digunakan sebagai langkah sterilisasi
akhir untuk media siap pakai yang mengandung albumin, karena albumin bersifat
heatlabile. Atau, media pertumbuhan leptospiral dapat dibeli secara komersial. Semua
media harus dipanaskan pada suhu 56 ° C selama 30 menit untuk memastikan
pembunuhan leptospira saprophytic. Perlu juga dicatat bahwa spesies Leptospira
patogenik merupakan patogen Biosafety Level 2 (BSL-2) dan dengan demikian pedoman
biosafety yang sesuai harus diikuti.

4.3.1 Pertumbuhan di Media Cair

Keberhasilan pertumbuhan leptospiral dalam media cair tergantung pada sifat inokulum
benih. Strain laboratorium yang beradaptasi dengan baik dapat langsung dibentuk pada
kultur cair, menggunakan 1–10% volume medium segar sebagai inokulum benih. Tiga
jenis media yang biasa digunakan untuk kultur cair Leptospira dijelaskan. Dalam semua
kasus, pereaksi harus ditambahkan dalam pesanan yang ditentukan. EMJH medium
Media cair yang paling sering digunakan untuk mengkulturkan Leptospira adalah
modifikasi Johnson dan Harris (Johnson dan Harris 1967) dari medium Ellinghuasen
McCullough (Ellinghausen dan McCullough 1965) (EMJH). Serum kelinci dapat
ditambahkan ke media ini; jika serum harus ditambahkan, harus dikumpulkan dari kelinci
sero-negatif dan panas-inaktivasi dengan inkubasi selama 30 menit pada 56 ° C. EMJH
yang dilengkapi dengan albumin disiapkan dari serangkaian larutan kaldu (semua
disiapkan dalam air steril, distilasi) seperti diuraikan di bawah ini.

Basal Salt Stock Solution (Zuerner 2005):

1 g Na2HPO4

0,3 g KH2PO4

1 g NaCl

1 ml larutan kaldu amonium klorida (25 g NH4Cl / 100 ml air)

1 ml larutan kaldu tiamin (0,5 g tiamin / 100 ml air)

1 ml larutan kaldu gliserol (10 ml gliserol / 100 ml air)

 Tambahkan komponen ke ~ 800 ml steril, suling air dengan pengadukan.

 Atur pH hingga 7,4 dengan larutan NaOH atau HCl encer.
  Buatlah volume air hingga 1 liter dengan air suling steril.
 Sterilkan dengan autoklaf.
 Simpan hingga 1 bulan pada 4 ° C.

Larutan kaldu BSA Stock Solution (Zuerner 2005):

Tambahkan 10 g bovine serum albumin, fraksi V, hingga 50 ml steril, suling air dengan
konstan, pengadukan lambat (hindari berbusa). Untuk memfasilitasi pelarutan BSA,
larutan ini dapat dipanaskan dengan lembut sampai <50 ° C atau dibiarkan pada 4 ° C
semalam. Gunakan segera untuk menyiapkan Suplemen BSA (lihat resep di bawah).

BSA Supplement (Zuerner 2005):

Untuk 50 ml BSA Stock Solution (lihat resep di atas) tambahkan larutan kaldu berikut
dengan pengadukan konstan:

1 ml larutan kaldu kalsium klorida (1 g CaCl2 • 2H2O / 100 ml air)

1 ml larutan kaldu magnesium klorida (1 g MgCl2 • 2H2O / 100 ml air)

1 ml larutan kaldu seng sulfat (0,4 g ZnSO4 • 7H2O / 100 ml air)

0,1 ml larutan kaldu tembaga sulfat (0,3 g CuSO4 • 5H2O / 100 ml air)

10 ml larutan kaldu sulfat besi (0,5 g FeSO4 • 7H2O / 100 ml air)

1 ml larutan kaldu vitamin B12 (0,02 g / 100 ml air)

12,5 ml larutan kaldu Tween 80 (10 ml / 100 ml air)

 Atur pH hingga 7,4 menggunakan sekitar 0,4 ml 2 N NaOH.

 Buatlah volume terakhir menjadi 100 ml dengan air suling steril.
 Sterilkan dengan penyaringan melalui filter 0,22 μm.
 Simpan tanpa batas pada −20 ° C.

Lengkapi EMJH Medium (Zuerner 2005):

Mulailah dengan 100 ml Suplemen BSA (lihat resep di atas) dan tambahkan komponen-
komponen berikut menggunakan teknik aseptik. Untuk lebih mengurangi insiden
kontaminan, yang sangat penting selama isolasi utama Leptospira patogenik, tambahkan
10 ml larutan kaldu 5-fluorouracil (1 g / 100 ml air) ke 890 ml Basal Salt Stock Solution
(lihat resep di atas). Jika serum kelinci ditambahkan, kurangi volume Larutan Basal
Garam untuk mempertahankan volume akhir 1 liter. Simpan hingga 1 bulan pada suhu
kamar.

Modified Complete EMJH Medium untuk pertumbuhan Leptospira pada 37 ° C (Ellis

dan Thiermann 1986; Bolin tidak diterbitkan):

Seperti disebutkan sebelumnya, pertumbuhan optimal Leptospira in vitro dicapai pada

kisaran suhu 28–30 ° C, meskipun Leptospira dapat berhasil tumbuh pada suhu 37 ° C
menggunakan versi EMJH Lengkap Medium yang dimodifikasi seperti diuraikan di
bawah ini.:

 Pertumbuhan terbaik dicapai dengan menyiapkan semua larutan menggunakan

air suling steril yang dibeli secara komersial (misalnya Gibco # 15230-204). Air
suling kaca ganda steril yang disiapkan di rumah juga mungkin cocok.
 Suplemen BSA menambahkan 0,1 ml larutan kaldu mangan sulfat (0,3 g MnSO4
• H2O / 100 ml air) sebagai pengganti 0,1 ml larutan kaldu tembaga sulfat.
 Untuk 100 ml Suplemen BSA, tambahkan 1 g laktalbumin hidrolisat, 100 µl 10
mg / ml superoksida dismutase dan 0,04 g natrium piruvat. Biarkan padatan larut
tanpa memutar botol.
 Filter-Vakum Medium EMJH Lengkap menggunakan aparatus filter 1 liter, 0,22
μm.
 Tingkat pertumbuhan yang diamati untuk L. interrogans serovar Copenhageni
ditingkatkan dalam versi modifikasi dari EMJH Medium Lengkap. Kerapatan
akhir ~ 109 bakteri / ml dicapai dalam 3 hari pada 37 ° C menggunakan inokulum
benih 2% dari volume akhir.
  Sudah menjadi pengamatan kami bahwa versi modifikasi dari EMJH Lengkap
Medium memiliki waktu paruh yang lebih pendek daripada Medium EMJH
Lengkap konvensional. Jika pertumbuhan leptospiral maksimal yang diinginkan
diinginkan, versi medium termodifikasi harus disiapkan pada interval 2 minggu
dan disimpan pada 4 ° C.

Medium Stuart (Zuerner 2005) Medium ini awalnya diformulasikan oleh Stuart (1946)
dan kemudian dimodifikasi oleh Faine (1994). Ini kaya akan serum kelinci, yang
menumbuhkan pertumbuhan leptospiral, tetapi juga memiliki kecenderungan untuk
mengendapkan fosfat yang ada dalam medium. Presipitat semacam itu dapat
mengaburkan pandangan bakteri pada analisis darkfield kultur.

1,93 g NaCl

0,34 g NH4Cl

0,19 g MgCl2 6H2O

0,13 g L-asparagin

0,67 g Na2HPO4

0,087 g KH2PO4

 Larutkan komponen dalam air suling untuk membuat volume akhir 1 liter.
 Atur pH hingga 7,5 dengan larutan NaOH atau HCl encer.
 Sterilkan dengan autoklaf selama 20 menit pada 121 ° C, dingin.
 Simpan hingga 1 tahun pada suhu kamar.
 Sebelum digunakan, aseptik tambahkan serum kelinci steril ke konsentrasi akhir
10%.
Medium Korthof (Faine dkk. 1999; Korthof 1932) Ini adalah media lain yang
mengandung serum yang umum digunakan, yang mirip dengan medium Stuart,
meningkatkan pertumbuhan leptospiral, tetapi dapat mempersulit penampakan bakteri
gelap jika bentuk presipitat fosfat.

0.8 g peptone
1.4 g NaCl
0.02 g NaHCO3
0.04 g KCl
0.04 g CaCl2
0.24 g KH2PO4
0.88 g Na2HPO4

 Larutkan komponen, satu per satu, dalam air suling untuk membuat volume akhir
1 liter.
 Kukus larutan pada suhu 100 ° C selama 20 menit (perebusan dapat digunakan
sebagai pengukus). Dinginkan semalaman di 4 ° C.
 Saring endapan yang dihasilkan melalui kertas saring Whatman No. 1.
 Alihkan ke aliquot yang bekerja.
 Sterilkan dengan autoklaf selama 20 menit pada 121 ° C, dingin.
 Secara aseptik tambahkan serum kelinci steril ke konsentrasi akhir 10%.
 PH akhir media harus 7,2-7,6.

Isolasi Leptospira dari sampel yang terkontaminasi Cara termudah untuk menghilangkan
kontaminasi dari kultur Leptospira adalah dengan menyaring kultur menggunakan filter
steril 0,22 µm; Leptospira akan melewati dan filtrat dapat diinkubasi dan disubkultur
(Faine et al. 1999). Sebagai alternatif, isolasi Leptospira yang berhasil dari sampel yang
terkontaminasi dengan mikroorganisme klinis dan lingkungan umum telah dicapai
dengan menggunakan kombinasi agen antimikroba sulfamethoxazole (40 µg / ml),
trimethoprim (20 µg / ml), amfoterisin B (5 µg / ml), fosfomisin (400 µg / ml), dan 5-
fluorouracil (100 µg / ml) (Chakraborty et al. 2011). Leptospira juga dapat dipulihkan
dari kultur yang terkontaminasi dengan inokulasi hewan. Kultur disuntikkan secara
intraperitoneal dan darah diambil secara aseptik di bawah anestesi setelah 10-30 menit.
Hamster, tikus, dan marmut telah digunakan.

4.3.2 Pertumbuhan Media Semisolid

Leptospira patogenik, dan khususnya leptospira yang baru-baru ini diisolasi dari sampel
klinis, tumbuh dengan baik dalam medium semipadat di mana mereka membentuk zona
pertumbuhan padat yang disebut sebagai disk Dinger (Lawrence 1951). Untuk
memfasilitasi pertumbuhan dalam medium semipadat, transfer aseptik ~ 100-250 µl
kultur ke tabung yang berisi 6-8 ml medium semipadat (lihat resep di bawah). Pindahkan
disk Dinger ke tabung yang berisi medium semisolid segar saat bentuk disk yang
memiliki kerapatan terlihat. Waktu transfer tergantung pada strain leptospiral yang
sedang tumbuh, dengan beberapa strain yang membutuhkan transfer mingguan dan yang
lain membutuhkan waktu hingga 6 bulan untuk mencapai pertumbuhan yang cukup
untuk memungkinkan transfer.

Semisolid EMJH medium (Zuerner 2005):

 Tambahkan 1,5 g agar hingga 900 ml Larutan Basal Garam (lihat resep di atas).
 Sterilkan dengan autoklaf selama 20 menit pada 121 ° C.
 Ketika Campuran Basa Garam Basal / campuran agar-agar telah didinginkan
hingga ~ 50 ° C tambahkan 100 ml Suplemen BSA (lihat resep di atas) per liter.
 Simpan dalam 1 botol liter hingga 1 tahun pada suhu kamar.

4.3.3 Pertumbuhan Media Padat

Pertumbuhan koloni yang terisolasi dari Leptospira pada media padat sering sulit dan,
untuk beberapa strain leptospiral patogen, tidak dapat diraih. Untuk mengisolasi individu
koloni leptospiral, kultur beruntun atau menyebar pengenceran terbatas pada media
EMJH padat (lihat resep di bawah). Minimalkan potensi kontaminasi dengan bekerja
secara steril, menyegel pelat dengan Parafilm, dan menempatkan pelat Parfilmed dalam
kantong plastik tertutup. Balikkan lempeng, menetaskan, dan pantau pertumbuhan pada
interval mingguan. Waktu untuk pengembangan koloni yang terisolasi tergantung pada
strain, dengan beberapa menunjukkan pertumbuhan dalam waktu 10 hari dari plating dan
yang lain memakan waktu hingga 6 minggu untuk muncul. Koloni muncul tertanam tepat
di bawah permukaan agar-agar, berwarna putih dan biasanya memiliki diameter 1-2 dan
2-3 mm untuk leptospira patogen dan saprophytic, masing-masing. Isolasi koloni dicapai
dengan dengan lembut aspirasi koloni ke ujung ujung filter steril atau pipet Pasteur,
diikuti dengan pengenalan koloni menjadi semipadat atau cair dan inkubasi sampai
pertumbuhan muncul.

Medium EMJH Padat (Zuerner 2005):

 Tambahkan 8 g agar hingga 900 ml Basal Salt Stock Solution (lihat resep di atas).
 Sterilkan dengan autoklaf selama 20 menit pada 121 ° C.
 Ketika Campuran Basa Garam Basal / campuran agar-agar telah didinginkan
hingga ~ 50 ° C tambahkan 100 ml Suplemen BSA (lihat resep di atas) per liter.
 Tuangkan ke dalam piring Petri individu dengan ~ 40 ml / piring, sebaiknya
dalam lemari keamanan biologis untuk mengurangi kemungkinan kontaminasi
lempeng.
 Menyimpan pelat yang dipadatkan di dalam peti asli, terbalik, pada suhu 4 ° C.