Extraction technique to separate kaempferol from Soursop

(Annona muricata) leaves

Abstrak

Daun sirsak mengandung berbagai senyawa yang memiliki aktivitas biologis seperti kaempferol
sebagai antikanker. Dua belas teknik ekstraksi dilakukan untuk mendapatkan teknik ekstraksi terbaik
untuk mendapatkan kandungan kaempferol yang tinggi pada ekstrak daun sirsak. Serbuk daun sirsak
kering diekstraksi dengan pelarut yang berbeda dan teknik yang berbeda seperti maserasi, sonikasi,
refluks, dan sokletasi. Hasil ekstrak, toksisitas terhadap larva Artemia salina, fenol total, flavonoid
total, total tanin, dan profil kromatografi lapis tipis dari semua ekstrak ditentukan. Total fenol dan
total konten flavonoid ditentukan oleh spektroskopi, sedangkan total konten tanin ditentukan
dengan metode titrasi. Hasil penelitian menunjukkan bahwa hasil ekstrak bervariasi dari 4,09 -
18,64%. Semua ekstrak beracun karena mereka menunjukkan nilai LC kurang dari 1000 ppm.
Kandungan tannin pada ekstrak bervariasi dari 3,78 - 7,59%, konten fenolik dari 6,16 - 16,44%, dan
kandungan flavonoid dari 0,63 - 10,25%. Ekstrak dengan kandungan tinggi total fenol dan total
flavonoid, rendah kandungan tanin, dan intensitas titik rendah pada kromatografi lapis tipis dipilih
untuk analisis kromatografi cair kinerja tinggi. Ekstraksi sonikasi residu n-heksana dipilih sebagai
teknik ekstraksi terbaik untuk isolasi kaempferol dari daun sirsak dengan kandungan kaempferol
sebesar 1,22%. Selain kandungan kaempferol yang tinggi, sonication dipilih karena hasil ekstraksi
tertinggi, waktu ekstraksi terpendek dan ketidakmurnian terkecil.

PENGANTAR

Sirsak (Annona muricata) adalah salah satu tanaman yang ditemukan di negara-negara tropis, seperti
Indonesia. Tanaman ini ditanam secara komersial untuk mengumpulkan buah-buahan sebagai bahan
makanan. Selain itu, buah sirsak juga digunakan untuk mengobati disentri, bisul, wasir, dan
antikonvulsan [1]. Daun sirsak juga dilaporkan memiliki beberapa kegiatan, seperti menurunkan
kadar gula darah, meningkatkan sistem kekebalan tubuh, dan mengobati kanker [2-4]. Beberapa
penelitian telah melaporkan bahwa ekstrak daun sirsak mengandung flavonoid dan senyawa fenolik
lain seperti quercetin, catechin, dan kaempferol [5]. Flavonoid dari Annona dioca dilaporkan
memiliki aktivitas untuk menghambat sel-sel kanker Ehrlich [6].

Kaempferol di alam berada dalam bentuk glikosida yang memiliki banyak aktivitas biologis seperti
anti-inflamasi, anti-jamur, antioksidan, dan anti diabetes [7-9]. Kaempferol dapat dipisahkan dengan
ekstraksi dari sumber daya alam menggunakan etanol atau metanol [10]. Beberapa teknik ekstraksi
telah dikembangkan untuk mengekstraksi kaempferol dari sumber daya alam seperti oleh
sonication, soxhletation, dan reflux [9, 11-12]. Teknik yang berbeda dan pelarut yang berbeda yang
digunakan pada proses ekstraksi menghasilkan hasil dan kemurnian kaempferol yang berbeda. Oleh
karena itu, penelitian untuk menentukan teknik terbaik untuk mengekstrak kaempferol dari daun
sirsak yang sederhana, murah, cepat dan memiliki hasil yang tinggi diperlukan.
BAGIAN EKSPERIMENTAL

Material

Semua pelarut yang digunakan adalah kelas analitik atau HPLC dan diperoleh dari Merck (Darmstadt,
Jerman), kaempferol dan quercetin standar dari Nacalai (Tokyo, Jepang), dan daun sirsak dari Unit
Sumber Daya Konservasi dan Budidaya Biopharmaca, Kampus Darmaga, Institut Pertanian Bogor,
Indonesia. Sampel diayak, dikeringkan pada oven 50 o C selama 72 jam, dan digiling sebelum
digunakan. Nama spesies diidentifikasi oleh Pusat Penelitian Biologi Lembaga Ilmu Pengetahuan
Indonesia, Cibinong, Indonesia

Metode

Penelitian ini fokus pada pemilihan metode ekstraksi dari berbagai sumber sampel sirsak. Kelompok
pertama sampel menggunakan daun sirsak kering, kelompok kedua (residu n-heksana)
menggunakan residu daun sirsak kering setelah diekstraksi dengan n-heksana, dan kelompok ketiga
(EtOAc residu) menggunakan n-heksana residu setelah diekstraksi dengan etil asetat. Setiap
kelompok sampel diekstraksi dengan pelarut (1 g: 5 mL) dalam berbagai metode. Metode yang
digunakan adalah maserasi dengan etanol selama 1 minggu [10], maserasi dengan gelombang
ultrasonik dengan air-metanol (85:15) selama 3 jam [11], refluks oleh metanol 70% pada 60-70ºC
selama 3 jam [9], dan sokletasi dengan metanol 70% [12]. Setiap ekstrak dikeringkan dengan rotary
evaporator.

Hasil, kandungan tanin, kandungan fenolik total, kandungan flavonoid total, dan toksisitas semua
ekstrak ditentukan untuk memilih ekstrak prospektif. Ekstrak prospektif adalah ekstrak yang
memiliki hasil tinggi, kandungan flavonoid tinggi, tocixity tinggi, kandungan tanin rendah, dan
kandungan fenolik total rendah. Disamping itu ekstrak prospektif juga ditentukan oleh profil
kromatogram lapis tipis. Ekstrak yang memiliki intensitas tinggi kaempferol spot dan hanya
membatasi jumlah titik lain adalah ekstrak prospektif. Kandungan kaempferol ditentukan oleh
kromatografi cair kinerja tinggi (HPLC) pada ekstrak yang dipilih.

Kandungan kaempferol tertinggi dilaporkan sebagai metode terbaik untuk memisahkan kaempferol
dari daun sirsak.

Total tannin content

Sekitar 0,5 gram ekstrak ditambahkan oleh 50mL air dan dipanaskan pada 40-60 oC selama 30 menit
dan disaring. Indigo carmine ditambahkan ke filtrat dan dititrasi oleh KMnO 4 0,1 N sampai
perubahan warna menjadi emas kekuningan.

Kandungan fenolik total

Sekitar 25 mg ekstrak dilarutkan dengan 25mL metanol: air (1: 1). A 300 µL larutan ditambahkan
oleh 1,5 mL Folin-Ciocalteu (1:10) dan dicampur. Setelah 3 menit, 1,2 mL Na2CO 7,5% ditambahkan
ke larutan dan absorbansi larutan diukur pada 765nm dan dilaporkan sebagai setara asam galat / g
sampel.
Total konten flavonoid

Ekstrak sekitar 200mg dilarutkan oleh aseton dan hexamethylenetetramine (HMT) 25%. Solusinya
kemudian dihidrolisis oleh HCl 25% pada 80 o C selama 30 menit. Produk hidrolisat dipartisi oleh etil
asetat dan fraksi EtOAc dikumpulkan dan ditambahkan oleh AlCl2% dan absorbansi diukur pada 425
nm. Toksisitas oleh Tes Lelehitas Udang Air Garam [15] 3 Sekitar 10 larva udang air asin dimasukkan
ke sumur terdiri dari air laut 4.5mL dan ditambahkan larutan ekstrak 0,5 mL. Konsentrasi ekstrak
berkisar antara 1 - 5000μg / mL. Jumlah larva mati ditentukan setelah 1 hari (24 jam). Konsentrasi
mematikan 50% (LC 50) ditentukan.

Profil Kromatografi Lapis Tipis (KLT)

Ekstrak 25 mg dihidrolisis oleh HCl 4 N dan dipartisi oleh EtOAc. Fraksi EtOAc dikeringkan sampai
1mL metanol. Larutan metanol ini terlihat di piring gel silika bersama kaempferol. Piring kemudian
dielusi oleh kloroform: metanol (9,75: 0,25). Deteksi yang digunakan adalah ultraviolet pada 366 nm.

Konten kaempferol oleh HPLC

Metode yang digunakan adalah menggunakan kolom C18 dengan 30% asetonitril dan 70% buffer
fosfat 0,025 M pH 2,5. Metode isokratik digunakan dengan 1,0mL / menit laju aliran. Detektor itu UV
pada 370 nm. Kandungan kaempferol diukur dengan membandingkan luas puncak kaempferol
dengan area puncak puncak waktu retensi yang sama pada sampel. Sampel yang digunakan adalah
sampel hidrolisat oleh HCl4M. Sampel dan standar yang disuntikkan sekitar 20 µL

HASIL DAN DISKUSI

Hasil, toksisitas, kandungan tanin, kandungan fenolik total dan kandungan flavonoid dari semua
metode ekstraksi dan semua kelompok sampel ditunjukkan pada Tabel 1. Hasil tertinggi ekstrak
ditemukan pada metode sokletasi dari daun sirsak kering. Metode soxhletation memberikan hasil
tertinggi pada setiap kelompok sampel, karena soxhletation menggunakan boiler dan refluks yang
bersirkulasi pelarut. Hasilnya adalah tingginya jumlah komponen ekstrak yang dipindahkan ke
pelarut. Berdasarkan kelompok sampel, kelompok daun sirsak kering memiliki hasil tertinggi
dibandingkan dengan sampel lainnya. Ini berarti proses pra-ekstraksi sebelum proses ekstraksi
utama menurunkan hasil karena beberapa komponen tidak ada di residu lagi. Setelah ekstraksi oleh
EtOAc, residu hanya memberikan sedikit hasil. Dari semua ekstrak, hasil tertinggi ditemukan pada
metode sokletasi dari daun kering.

Toksisitas semua ekstrak dilaporkan dalam nilai LC50. LC adalah konsentrasi yang dapat membunuh
50% populasi uji hewan. Berdasarkan data pada Tabel 1, semua ekstrak memiliki LC 50 kurang dari
1000 ppm. Menurut Meyer et al, ekstrak kasar beracun jika ekstrak kasar memiliki nilai LC 108 50 50
kurang dari 1000 ppm [15]. Itu berarti semua ekstrak beracun. Ekstrak beracun yang paling banyak
adalah ekstrak soxhletation dari daun kering.

Kandungan tanin dari semua ekstrak bervariasi. Kandungan tanin tertinggi ditemukan pada ekstrak
soxhletation dari n-hexane risudue, sedangkan kandungan terendah ditemukan pada ekstrak
soxhletation dari residu EtOAc (Tabel 1). Tannin adalah senyawa fenolik yang ditemukan pada daun
sirsak, proses ekstraksi yang dianggap sebagai proses yang baik untuk memisahkan kaempferol
adalah proses yang menghasilkan kandungan tanin terendah.
Kandungan fenolik total juga ditentukan untuk semua ekstrak. Ekstrak dari residu EtOAc memiliki
kandungan fenolik yang lebih rendah dibandingkan dengan jenis sampel lain. Kandungan fenolik
tertinggi ditemukan pada metode sokletasi dari residu n-heksana (Tabel 1). Kandungan fenolik yang
tinggi pada ekstrak dianggap sebagai metode prospektif untuk memisahkan kaempferol.

Kandungan flavonoid total ditentukan karena kaempferol adalah salah satu senyawa flavonoid
(Gambar 1). Kandungan flavonoid tertinggi ditemukan pada ekstrak maserasi dari daun kering (Tabel
1). Kandungan flavonoid yang tinggi bisa terkait dengan kandungan kaempferol

Hasil tertinggi, konten fenolik, dan kandungan flavonoid, dan kandungan tanin terendah pada
ekstrak adalah ekstrak yang berbeda. Itu membuat sulit untuk memilih ekstrak prospektif, sehingga
profil kromatografi lapis tipis (TLC) diperlukan. Profil TLC dapat memberikan informasi tentang
ekstrak apa yang terdiri dari kaempferol dengan membandingkan spot dengan standar kaempferol.
Di alam, flavonoid tidak dalam bentuk bebas. Sebagian besar flavonoid ditemukan pada bentuk
glikosida. Untuk memisahkan flavonoid dari gula, proses hidrolisis diperlukan. Untuk menghidrolisis
glikosida flavonoid pada ekstrak, HCl ditambahkan ke ekstrak sebelum proses KLT. Profil TLC dari
semua ekstrak ditunjukkan pada Gambar 2.

Berdasarkan kromatogram TLC pada Gambar 2, spot kaempferol ditemukan dengan Rf 0,10, dan
semua ekstrak terdiri dari kaempferol dengan jumlah yang berbeda. Dari warna spot pada Rf 0.10,
ekstrak dari residu EtOAc terdiri dari kaempferol yang lebih sedikit dibandingkan dengan jenis
sampel lainnya. Titik-titik lain di samping tempat dengan Rf 0,10 adalah tempat yang tidak diinginkan
karena tempat itu bertindak sebagai kontaminan. Untuk tahap berikutnya penelitian, ekstrak dari
bahan kering dengan maserasi, sonication, dan metode saksheksasi dan ekstrak dari residu n-
heksana dengan maserasi dan metode sonication digunakan.

Metode HPLC digunakan untuk menentukan kandungan kaempferol pada ekstrak. Kromatogram
analisis HPLC dari 5 ekstrak ditunjukkan pada Gambar 3. Selain puncak kaempferol, puncak quercetin
juga muncul pada semua ekstrak dengan area puncak yang berbeda. Quercetin muncul pertama
sebelum kaempferol pada metode HPLC fase terbalik karena quercetin (Gambar 4) lebih polar
dibandingkan dengan kaempferol [16].

Konten kaempferol dan quercetin konten pada ekstrak yang dipilih dilaporkan pada Tabel 2. Konten
kaempferol pada semua ekstrak lebih tinggi dari konten quercetin. Kandungan kaempferol dan
quercetin tertinggi ditemukan pada ekstrak sonikasi dari residu n-heksana. Ekstrak sonikasi dari
residu n-heksana dianggap sebagai metode ekstraksi terbaik karena memiliki hasil tinggi kedua
dibandingkan dengan ekstrak lain, juga hanya membutuhkan 3 jam untuk menyelesaikan proses
ekstraksi, dan memiliki lebih sedikit kotoran pada kromatogram TLC.

KESIMPULAN Sebagai kesimpulan, metode ekstraksi terbaik untuk mengisolasi kaempferol dari daun
sirsak adalah metode ekstraksi sonikasi dari residu n-heksana. Metode sonication dari n-hexane
memiliki kandungan kaempferol sebesar 1,22%, yield 17,36%, waktu ekstraksi terpendek dan
ketidakmurnian terkecil.