MAKALAH

KROMATOGRAFI LAPIS TIPIS

Mata Kuliah: Teknik Separasi

Disusun Oleh:
1) Abdur Rahman Hanif (1300017024)
2) Hadi Yunanto (1300017018)
3) Danisa Rahmawati (1311017028)

PROGRAM STUDI BIOLOGI

FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
UNIVERSITAS AHMAD DAHLAN
YOGYAKARTA
2015

BAB I
PENDAHULUAN

A. Latar Belakang
Perkembangan ilmu pengetahuan sejalan dengan perkembangan tekhnologi. Berbagai alat
dengan kecanggihan semakin meningkat. Hal ini juga termasuk perkembangan dalam ilmu
 farmasi, tidak terkecuali bidang Analisis farmasi. Dalam bidang ini, selama beberapa tahun
terakhir terjadi perkembangan yang pesat untuk teknik pemisahan. Penerapan metode seperti
kromatografi dianggap metode modern yang saat ini sering digunakan dalam berbagai riset dan
penelitian. Hal ini terbukti dengan banyaknya publikasi ilmiah yang berkaitan dengan
penggunaan metode tersebut, baik untuk tujuan analisis kualitatif maupun kuantitatif.
Kromatografi banyak dipilih karena merupakan metode pemisahan yang sederhana.
Kromatografi mencakup berbagai proses yang berdasarkan pada perbedaan distribusi dari
penyusunan cuplikan antara dua fasa.Satu fasa tetap tinggal pada sistem dan dinamakan fasa
diam. Fasa lainnya dinamakan fasa gerak menyebabkan perbedaan migrasi dari penyusun
cuplikan. Kromatografi juga dapat digunakan, jika metode klasik tidak dapat dilakukan karena
jumlah cuplikan rendah, kompleksitas campuran yang hendak dipisahkan atau sifat berkerabat
zat yang sulit dipisah (Gandjar dan Rohman, 2007).
Kromatografi ada bermacam-macam diantaranya kromatografi kertas, kromatografi lapis
tipis, penukar ion, penyaringan gel dan elektroforesis (Sastrohamidjojo, 1985). Namun dalam
makalah ini hanya akan dibahas mengenai teknik Kromatografi Lapis Tipis (KLT).
B. Rumusan Masalah
Berdasarkan latar belakang di atas maka rumusan masalah dalam makalah ini yaitu :
1. Apa yang dimaksud Kromatografi Lapis Tipis (KLT)?
2. Apa kelebihan dan kekurangan Kromatografi Lapis Tipis (KLT)?
3. Bagaimana prinsip kerja Kromatografi Lapis Tipis (KLT)?
4. Apa fase diam dan fase gerak yang sering digunakan pada Kromatografi Lapis Tipis (KLT)?
5. Bagaimana prosedur kerja pemisahan sampel dengan Kromatografi Lapis Tipis (KLT)?
6. Bagaimana cara deteksi bercak dalam Kromatografi Lapis Tipis (KLT)?
7. Bagaimana penggunaaan Kromatografi Lapis Tipis (KLT) untuk analisis obat-obatan?

C. Tujuan
Tujuan makalah ini yaitu :
1. Untuk mengetahui definisi Kromatografi Lapis Tipis (KLT).
2. Untuk mengetahui kelebihan dan kekurangan Kromatografi Lapis Tipis (KLT).
3. Untuk mengetahui prinsip kerja Kromatografi Lapis Tipis (KLT).
4. Untuk mengetahui fase diam dan fase gerak yang sering digunakan pada Kromatografi Lapis
Tipis (KLT).
5. Untuk mengetahui prosedur kerja pemisahan sampel dengan Kromatografi Lapis Tipis (KLT).
6. Untuk mengetahui cara deteksi bercak dalam Kromatografi Lapis Tipis (KLT).
7. Untuk mengetahui cara penggunaaan Kromatografi Lapis Tipis (KLT) dalam analisis obat-
obatan?
 BAB II

PEMBAHASAN

A. Definisi Kromatografi Lapis Tipis

Kromatografi Lapis Tipis (KLT) pertama kali dikembangkan oleh Izmailoff dan
Schraiber pada tahun 1938. KLT merupakan bentuk kromatografi planar , yang fase diamnya
berupa lapisan seragam (uniform) pada permukaan bidng datar yang didukung oleh lempeng
kaca, plat aluminium, atau plat plastik (Gandjar dan Rohman, 2007).
KLT merupakan salah satu metode isolasi yang terjadi berdasarkan perbedaan daya serap
(adsorpsi) dan daya partisi serta kelarutan dari komponen-komponen kimia yang akan bergerak
mengikuti kepolaran eluen. Oleh karena daya serap adsorben terhadap komponen kimia tidak
sama, maka komponen bergerak dengan kecepatan yang berbeda sehingga hal inilah yang
menyebabkan pemisahan (Hostettmann et al, 1995).
Pada proses adsorpsi senyawa kimia dapat terpisah-pisah disebabkan oleh daya serap
adsorban terhadap tiap-tiap komponen kimia tidak sama. Sedangkan partisi adalah kelarutan tiap-
tiap komponen kimia dalam cairan pengelusi (eluen) tidak sama dimana arah gerakan eluen
disebabkan oleh gaya sentrifugal sehingga komponen kimia dapat bergerak dengan kecepatan
yang berbeda-beda.
Kromatografi lapis tipis merupakan jenis kromatografi yang dapat digunakan untuk
menganalisis senyawa secara kualitatif maupun kuantitatif. Lapisan yang memisahkan terdiri
atas bahan berbutir (fase diam) ditempatkan pada penyangga berupa pelat gelas, logam, atau
lapisan yang cocok. Campuran yang akan dipisah berupa larutan, ditotolkan berupa bercak atau
pita, setelah pelat/lapisan ditaruh dalam bejana tertutup rapat yang berisi larutan pengembang
yang cocok (fase gerak). Pemisahan terjadi setelah perambatan kapiler (pengembangan),
selanjutnya senyawa yang tidak berwarna harus ditampakkan/dideteksi. Deteksi dilakukan
dengan menggunakan sinar UV (Sudjadi, 1988).

B. Kelebihan dan Kekurangan KLT

Beberapa kelebihan KLT yaitu:
1. KLT lebih banyak digunakan untuk tujuan analisis.
2. Identifikasi pemisahan komponen dapat dilakukan dengan pereaksi warna, fluoresensi, atau
dengan radiasi menggunakan sinar ultraviolet.
3. Dapat dilakukan elusi secara mekanik (ascending), menurun (descending), atau dengan cara
elusi 2 dimensi.
4. Ketepatan penentuan kadar akan lebih baik karena komponen yang akan ditentukan merupakan
bercak yang tidak bergerak.
5. Hanya membutuhkan sedikit pelarut.
6. Biaya yang dibutuhkan terjangkau.
7. Jumlah perlengkapan sedikit.
8. Preparasi sample yang mudah
9. Dapat untuk memisahkan senyawa hidrofobik (lipid dan hidrokarbon) yang dengan metode
kertas tidak bisa (Gandjar dan Rohman, 2007).
Adapun kekurangan KLT yaitu:
1. Butuh ketekunan dan kesabaran yang ekstra untuk mendapatkan bercak/noda yang diharapkan.
2. Butuh sistem trial and eror untuk menentukan sistem eluen yang cocok.
3. Memerlukan waktu yang cukup lama jika dilakukan secara tidak tekun.

C. Prinsip Kerja KLT

Pada dasarnya KLT digunakan untuk memisahkan komponen-komponen berdasarkan
perbedaan adsorpsi atau partisi oleh fase diam di bawah gerakan pelarut pengembang (Watson,
2010). KLT sangat mirip dengan kromatografi kertas, terutama pada cara pelaksanaannya.
Perbedaan nyata terlihat pada fase diamnya atau media pemisahnya, yakni digunakan lapisan
tipis adsorben sebagai pengganti kertas.
Pada proses pemisahan dengan kromatografi lapis tipis, terjadi hubungan kesetimbangan
antara fase diam dan fasa gerak, dimana ada interaksi antara permukaan fase diam dengan gugus
fungsi senyawa organik yang akan diidentifikasi yang telah berinteraksi dengan fasa geraknya.
Kesetimbangan ini dipengaruhi oleh 3 faktor, yaitu : kepolaran fase diam, kepolaran fase gerak,
serta kepolaran dan ukuran molekul.

D. Fase Diam dan Fase Gerak

 Fase diam yang digunakan dalam KLT merupakan penjerap berukuran kecil dengan
diameter partikel antara 10-30 µm (Gandjar dan Rohman, 2007). Semakin kecil ukuran rata-rata
partikel fase diam dan semakin sempit kisaran ukuran fase diam, maka semakin baik kinerja
KLT dalam hal efisiensi dan resolusinya.
Silika gel salah satu contoh fase diam yang terbentuk dari silikon dioksida (silika). Atom
silikon dihubungkan oleh atom oksigen dalam struktur kovalen yang besar. Namun, pada
permukaan silika gel, atom silikon berlekatan pada gugus -OH.
Jadi, pada permukaan jel silika terdapat ikatan Si-O-H selain Si-O-Si. Gambar ini
menunjukkan bagian kecil dari permukaan silika.

Gambar 1. Struktur Silika

Permukaan silika gel sangat polar dan karenanya gugus -OH dapat membentuk ikatan
hidrogen dengan senyawa-senyawa yang sesuai disekitarnya, sebagaimana halnya gaya van der
Waals dan atraksi dipol-dipol.
Fase diam lainnya yang biasa digunakan adalah alumina dari aluminium oksida. Atom
aluminium pada permukaan juga memiliki gugus -OH. Pada dasarnya sifat serta penggunaannya
mirip silika gel.

Tabel 1. Fase diam yang sering digunakan pada KLT (Kealey dan Haines, 2002)
Fasa Diam Mekanisme Sorpsi Penggunaan
Silika gel Adsorpsi Asam amino, hidrokarbon, vitamin,
alkaloid
Serbuk selulosa Partisi Asam amino, nukleotida, karbohidrat
Selulosa penukar Pertukaran ion Asam nukleat, nukleotida, halida dan ion-
ion ion logam
Gel sephadex Eksklusi Polimer, protein, kompleks logam
Β-siklodekstrin Interaksi adsorpsi Campuran enansiomer
stereospesifik

Selain fasa diam, dalam KLT juga diperlukan fasa gerak/eluent yang berperan penting
pada proses elusi bagi larutan umpan (feed) untuk melewati fasa diam (adsorbent). Interaksi
 antara adsorbent dengan eluent sangat menentukan terjadinya pemisahan komponen. Oleh sebab
itu pemisahan komponen secara kromatografi dipengaruhi oleh laju alir eluent dan jumlah
umpan. Eluent dapat digolongkan menurut ukuran kekuatan teradsorpsinya pelarut atau
campuran pelarut tersebut pada adsorben dan dalam hal ini yang banyak digunakan adalah jenis
adsorben alumina atau sebuah lapis tipis silika. Suatu pelarut yang bersifat larutan relatif polar,
dapat mengusir pelarut yang tak polar dari ikatannya dengan alumina (gel silika). Semakin dekat
kepolaran antara senyawa dengan eluen maka senyawa akan semakin terbawa oleh fase gerak
tersebut. Hal ini berdasarkan prinsip “like dissolved like” (Watson, 2010).
E. Prosedur Kerja dengan KLT
Pada KLT, fasa diam berupa plat yang biasanya disi dengan silica gel. Sebuah garis
pensil digambar dekat bagian bawah fasa diam dan setetes larutan sampel ditempatkan di
atasnya. Sampel ditotol dengan bantuan pipa kapiler. Garis pada fasa diam berguna untuk
menunjukkan posisi asli sampel. Pembuatan garis harus menggunakan pensil karena jika semua
ini dilakukan dengan tinta, pewarna dari tinta juga akan bergerak sebagai kromatogram
berkembang. Ketika titik campuran kering, fasa diam diletakkan berdiri dalam gelas tertutup
yang telah berisi fasa gerak dengan posisi fasa gerak di bawah garis. Digunakan gelas tertutup
untuk memastikan bahwa suasana dalam gelas jenuh dengan uap pelarut.
Pelarut (fasa gerak) perlahan-lahan bergerak naik. Komponen-komponen yang berbeda
dari campuran berjalanan pada tingkat yang berbeda dan campuran dipisahkan memiliki warna
yang berbeda.
Pelarut diperbolehkan untuk naik hingga hampir mencapai bagian atas plat yang akan
memberikan pemisahan maksimal dari komponen-komponen pewarna untuk kombinasi tertentu
dari pelarut dan fase diam.
Identifikasi dari senyawa-senyawa yang terpisah pada lapisan tipis lebih baik dikerjakan
dengan pereaksi kimia dan reaksi-reaksi warna. Untuk identifikasi menggunakan harga Rf
meskipun harga-harga Rf dalam lapisan tipis kurang tepat bila dibandingkan pada kertas. Seperti
halnya pada kertas harga Rf didefinisikan sebagai berikut (Gritter et al, 1991):

Harga-harga Rf untuk senyawa-senyawa murni dapat dibandingkan dengan harga-harga

standard. Perlu diperhatikan bahwa harga-harga Rf yang diperoleh berlaku untuk campuran
 tertentu dari pelarut dan penyerap yang digunakan, meskipun daftar dari harga-harga Rf untuk
berbagai campuran dari pelarut dan penyerap dapat diperoleh (Gritter et al, 1991).
Pengukuran lain yang sering dipakai adalah menggunakan pengertian Rx atau Rstd yang
didefinisikan sebagai berikut (Gritter et al, 1991):

Harga Rx atau Rstd = jarak yang ditempuh senyawa yang tidak diketahui
Jarak yang ditempuh pelarut
Jarak yang
ditempuh senyawa standart yang diketahui

Senyawa standard biasanya memiliki sifat-sifat kimia yang mirip dengan senyawa yang
dipisahkan pada kromatogram. Misal perbandingan suatu hidrolisa protein dengan glisin atau
alanin.

F. Deteksi Bercak
Ada dua cara untuk menyelesaikan analisis sampel yang tidak berwarna, yaitu:
1. Menggunakan pendarflour
Fase diam pada sebuah lempengan lapis tipis seringkali memiliki substansi yang
ditambahkan kedalamnya, supaya menghasilkan pendaran flour ketika diberikan sinar ultraviolet
(UV). Itu berarti jika sinar UV disinarkan, maka sampel akan berpendar.
Pendaran ini ditutupi pada posisi dimana bercak pada kromatogram berada, meskipun
bercak-bercak itu tidak tampak berwarna jika dilihat dengan mata. Itu berarti bahwa jika
disinarkan sinar UV pada lempengan, akan timbul pendaran dari posisi yang berbeda dengan
posisi bercak-bercak. Bercak tampak sebagai bidang kecil yang gelap.
Sementara UV tetap disinarkan pada lempengan, kita harus menandai posisi-posisi dari
bercak-bercak dengan menggunakan pensil dan melingkari daerah bercak-bercak itu. Karena
jika kita mematikan sinar UV tersebut, bercak-bercaknya tidak tampak kembali.
2. Penunjukkan bercak secara kimia
Dalam beberapa kasus, dimungkinkan untuk membuat bercak-bercak menjadi tampak
dengan cara mereaksikannya dengan zat kimia sehingga menghasilkan produk yang berwarna.
Sebuah contoh yang baik adalah kromatogram yang dihasilkan dari campuran asam amino.
 Kromatogram dapat dikeringkan dan disemprotkan dengan larutan ninhidrin. Ninhidrin bereaksi
dengan asam amino menghasilkan senyawa-senyawa berwarna, umumnya coklat atau ungu.
Dalam metode lain, kromatogram dikeringkan kembali dan kemudian ditempatkan pada
wadah bertutup (seperti gelas kimia dengan tutupan gelas arloji) bersama dengan kristal iodium.
Uap iodium dalam wadah dapat berekasi dengan bercak pada kromatogram, atau dapat
dilekatkan lebih dekat pada bercak daripada lempengan. Substansi yang dianalisis tampak
sebagai bercak-bercak kecoklatan.

G. Penerapan KLT
KLT bisanya merupakan metode pilihan pertama jika sesorang ingin memisahkan suatu
campuran. Hal ini disebabkan karena KLT merupakan metode yang sederhana dan cepat. KLT
digunakan secara luas untk analisis obat. Berikut adalah penggunaan KLT untuk analisis
beberapa sediaan farmasi:
Tabel 2. Penerapan KLT untuk analisis obat (gandjar dan Rohman, 2007)
Obat (sediaan) Fase diam Fase gerak Deteksi
Asetaminofen
Silika gel Heksan:aseton (75:25) UV
(serbuk)
UV panjang
Albendazol Metilen klorid-asam aseat- eter
Silika gelombang
(serbuk) (6:1:1)
pendek
Amoksisilin (tablet, Metanol-piridin-kloroform-air
Silika Ninhidrin
kapsul, suspensi) (90:10:80:10)
Ampisilin (kapsul, Aseton-toluen-air-asam asetat
Silika Ninhidrin
suspensi oral) (650:100:10025)
Vitamin C (serbuk) Silica Metanol-aseton-air (20:40:3) UV
Silika disemprot
Metilen klorid-metanol-air
Dosisiklin EDTA 10%, pH UV 280 nm
(59:35:6)
9,0
Benzen-metanol-amonium
Ketamin (serbuk) Silika Dragendorff
hidroksida (80:20:1)
Silika Dikembangkan dengan cara 2
Morfin
(dijenuhkan dimensi: sikloheksan-toluen-
(penyalahgunaan UV 279 nm
dengan NaOH dietilamin (75:15:10) lalu
obat)
0,1 N) kloroform-metanol (9:1)
Nifedipin (serbuk) Silika Diisopropill eter UV 254
Nitrofurantoin Dipanaskan, UV
Silika Nitrometan-metanol (9:1)
(serbuk) 254
Nistatin (salep
Silika Benzen-metanol (9:1) UV 254 nm
dengan kliquinol)
 Silika (yang
Progesteron telah diaktifkan
Kloroform-etil asetat (2:1) UV 241 nm
(serbuk) pada suhu
105oC)
Prostaglandin Etil asetat-isooktan-etanol- Asam
Silika
(serbuk) asam format (35:0,5;0,1) fosfomolibdat
Teofilin (kapsul
Selulosa Metanol-air UV 254 nm
dengan guuaifensin)
Benzen-kloroform-dietilamin
Vinblastin (serbuk) Silika UV 254 nm
(40:20:3)
Eter-metanol-metilamin 40%
Vinkristin (injeksi) Silika Amonium sulfat
(40:20:3)
 BAB III

PENUTUP

A. Kesimpulan
Berdasarkan uraian di atas dapat disimpulkan:
1. KLT merupakan bentuk kromatografi planar , yang fase diamnya berupa lapisan seragam
(uniform) pada permukaan bidng datar yang didukung oleh lempeng kaca, plat aluminium, atau
plat plastik.
2. Keuntungan KLT yaitu ketepatan penentuan kadar baik karena komponen yang akan ditentukan
merupakan bercak yang tidak bergerak. Kerugiannya memerlukan waktu untuk menentuan
sistem eluen yang cocok.
3. Prinsip KLT yaitu pemisahan komponen-komponen berdasarkan perbedaan adsorpsi atau partisi
oleh fase diam dibawah gerakan pelarut pengembang.
4. Fase diam yang sering digunakan pada KLT yaitu silika gel sedangkan fase gerak (eluen)
merupakan campuran dari dua pelarut atau lebih.
5. Kerja dengan KLT dimulai dari (1) penyiapan plat, eluen dan sampel, (2) penotolan, (3) elusi,
(4) deteksi bercak/noda.
6. Cara mendeteksi bercak ada 2 yaitu menggunakan UV dan campuran zat kimia tertentu.
7. KLT bisa digunakan untuk analisis obat seperti Asetaminofen, Albendazol, Amoksisilin,
Ampisilin, dan lain-lain.
 DAFTAR PUSTAKA

Gandjar, IG dan Rohman, A. 2007. Kimia Farmasi Analisis. Pustaka Pelajar. Yogyakarta.

Gritter RJ, Bobbit JM, Arthur SE. 1991. Pengantar Kromatografi. Penerbit ITB. Bandung

Hostettmann K, Hostettmann M, Marston A. 1995. Cara Kromatografi Preparatif. Penerbit ITB.

Bandung.

Kealey D dan Haines PJ. 2002. Instant Notes: Analytical Chemistry. BIOS Scientific Publishers
Limited. New York.

Sastroharmidjojo H. 1985. Kromatografi. Penerbit Liberty. Yogyakarta.

Sudjadi.1988. Metode Pemisahan. Penerbit Kanisius.Yogyakarta.

Watson, DG. 2010. Analisis Farmasi. Penerbit Buku Kedokteran. Jakarta.

Diposting oleh Danisa Rahmawita di 14.00

Kirimkan Ini lewat EmailBlogThis!Berbagi ke TwitterBerbagi ke FacebookBagikan ke Pinterest
Lokasi: Bantul Regency, Special Region of

https://danisarahmaw.blogspot.com/2015/12/kromatografi-lapis-tipis-klt.html