Jurnal Labora Medika Volume (Tahun) Halaman [Jurnal Labora Medika 2 (2016) 110-20]

(Time new roman font 10)

Journal Homepage: http://jurnal.unimus.ac.id/index.php/JLabMed

e-ISSN: 2549-9939

KENDALI MUTU PEMERIKSAAN SPESIES MIKROFILARIA PADA

PENDERITA KRONIS FILARIASIS SECARA POLYMERASE CHAIN
REACTION (PCR)

Al Hidayani (G4C018013)
1
Fakultas Ilmu Keperawatan dan Kesehatan, Universitas Muhammadiyah Semarang
Info Artikel Abstrak [Times New Roman 11Cetak Tebal dan
Miring]
Diterima 16 Agustus 2016 Isi Abstrak (Times New Roman 10) ditulis dalam
bahasa inggris atau Indonesia yang berisikan
Direvisi 30 Agustus 2016
isu-isu pokok penelitian, tujuan penelitian,
Disetujui 20 September 2016 metode/pendekatan dan hasil penelitian.
Tersedia Online 1 Oktober 2016 Abstrak ditulis dalam satu alenia, tidak lebih
dari 200 kata.
Keywords:
Maksimum 5 kata kunci dipisah
kan dengan tanda
koma. [Font Times
New Roman 10 spasi
tunggal, dan cetak
miring]

Pendahuluan limfatik sebagai penyebab utama

Filariasis adalah kelompok penyakit kecacatan di seluruh dunia
yang disebabkan oleh filaria yang (Depkes,2015)
mempengaruhi manusia dan hewan
Penyakit ini disebabkan oleh tiga spesies
(yaitu, parasit nematoda dari keluarga
cacing nematoda, yang dikenal sebagai
Filariidae). Dari ratusan parasit filaria
filariae - Wuchereria bancrofti, Brugia
yang dijelaskan, hanya 8 spesies yang
malayi dan Brugia timori. Cacing
menyebabkan infeksi alami pada
menyerang didalam sistem limfatik
manusia. Organisasi Kesehatan Dunia
manusia, jaringan kelenjar dan
(WHO) telah mengidentifikasi filariasis
pembuluh antara darah dan jaringan
*Corresponding Author:
Al Hidayani (G4C018013)
Fakultas Ilmu Keperawatan dan Kesehatan, Universitas Muhammadiyah Semarang, Semarang
Indonesia 50273.
E-mail: alhidayani97@gmail.com
tubuh. Sistem limfatik merupakan
komponen penting dari sistem kekebalan
tubuh.
Program Global untuk
Penghapusan Filariasis Limfatik
(GPELF) bertujuan untuk
menghilangkan penyakit parasit ini pada
tahun 2020. Strategi utamanya adalah
pemberian obat massal (MDA) dengan
obat antifilarial di antara penduduk yang
tinggal di daerah endemik dengan dosis
tahunan tunggal selama satu periode
lima-enam tahun (Ottesen 2006).
Pengembangan tes yang lebih spesifik
dan sensitif adalah penting untuk
GPELF, memungkinkan untuk (i)
menyarankan area mana yang harus
dilibatkan dalam MDA, (ii) mengukur
kemanjuran intervensi, (iii) membantu
memutuskan kapan menghentikan MDA
dan ( iv) menyarankan bagaimana
memantau populasi setelah berakhirnya
MDA, sehingga mencegah terjadinya
kembali transmisi parasit (WHO 2008).
Masalah yang sering terjadi saat
melakukan pemeriksaan filariasis
dengan metode biasa adalah
pengambilan sampel yang dilakukan
pada malam hari. Oleh karena itu,
dikembangkan metode yang dapat
mempermudah untuk pengambilan
sampel yang dapat dilakukan kapan saja.
Semakin berkembang nya
teknologi, maka berbagai metode baru
dikembangkan untuk mendiagnosis
filariasis, metode baru tersebut dititik
beratkan untuk mendiferensiasi spesies
filaria dengan Uji PCR (Polymerase
Chain Reaction).
Bahan dan Metode
Bahan yang digunakan dalam
pemeriksaan filariasis dengan metode
molekular adalah sampel darah yang
diteteskan pada kertas saring (whatman).
Pra-analitik
Alat dan Bahan
Alat dan bahan yang perlu
diperispakan untuk pengambilan sampel
yaitu lanset steril, pastikan lanset harus
baru/steril tidak dipakai dua
kali/disposible(sekali pakai), pipet
kapiler yang baru tidak boleh bekas
pakai dan kertas saring (Fischer dkk,
2008).
Spesimen
Untuk mendapat/memastiakn
sampel yang didapat akurat dan bisa
menjadi acuan, variabel yang dapat
mempengaruhi tahap pra-analitik harus
dapat dikontrol. Hal ini termasuk pada
persiapan pasien, data pasien yang
mengalami kronis filaria, pengambilan
sampel darah, serta transfortasi spesimen
ke laboratorium dan cara penyimpanan
sampel darah filaria dengan baik
(Adewoyin dan Nwogoh, 2014).
Pengambilan darah dilakukan pada siang
hari dengan melakukan kunjungan ke
rumah penderita. Untuk pengumpulan
sampel yang nyaman, pengawetan, dan
ekstraksi DNA selanjutnya sejumlah
kecil darah vena atau kapiler dapat
dikumpulkan pada kertas saring dengan
ukuran pori-posi 3mm (Whatman filter),
dikeringkan, dan disimpan pada suhu
kamar (20-250C). Jangan sampai terkena
air ataupun lembab, hal ini dapat
berpengaruh pada keberadaan parasit
filaria (Kluber S, dkk : 2011). Proses
pengeringan sangat penting dalam hal
ini, untuk mencegah hilangnya
keberadaan parasit filaria.
Analitik
Isolasi DNA
Isolasi DNA dilakukan oleh
laboran/praktisi terlatih, lebih baik
seseorang yang memang menekuni
bidang tersebut, dapat juga dilakukan
oleh tenaga laboratorium medis yang
sudah terlatih dalam bidang molekuler.
Yang dapat memastikan tahap selama
pembuatan isolasi berjalan dengan baik,
serta mendapatkan hasil isolasi yang
diinginkan. Asisten laboratorium yang
terlatih juga diperlukan dalam
melakukan isolasi DNA, agar dapat
mendapatkan isolasi DNA yang bebas
kontaminan, serta isolasi yang didapat
memang mengandung gDNA (genom
DNA) dari parasit filaria (Santoso &
Nungky, 2015)
Prisnsip utama dalam isolasi
DNA ada tiga yakni penghancuran
(lisis), ektraksi atau pemisahan DNA
dari bahan padat seperti selulosa dan
protein, serta pemurnian DNA (Corkill
dan Rapley, 2008). Ada beberapa hal
yang perlu diperhatikan dalam proses
isolasi DNA antara lain harus
menghasilkan DNA tanpa adanya
kontaminan seperti protein dan RNA;
metodenya harus efektif dan bisa
dilakukan untuk semua spesies metode
yang dilakukan tidak boleh mengubah
struktur dan fungsi molekul DNA. untuk
menjaga struktur DNA selama proses
penghancuran (pelisisan) dan purifikasi
sehingga memudahkan dalam
menghilangkan protein dan RNA serta
mencegah aktivitas enzim pendegradasi
DNA dan mencegah perubahan pada
molekul DNA praktisi perlu
memperhatikan pH dari larutan buffer
yang digunakan sera inhibitor DNAse
dan detergen (Surzcky, 2000). DNA
kemudian diekstraksi dengan metode
mendidih sederhana menggunakan resin
Chelex 100 untuk mengikat inhibitor
PCR, dalam proses ekstraksi waktu
inkubasi didalam air mendidih hanya
selama 10 menit, tidak boleh lebih
karena dapat mempengaruhi hasil dari
ekstraksi DNA (Fischer dkk, 2008)
Bagian yang diambil pada
proses ini yaitu supernatant, tidak boleh
diambil pada bagian endapan/pellet
karena yang terkandung pada pellet
adalah sisa-sisa dari bahan organik.
Untuk mendapat hasil isolasi yang baik,
cairan supernatant (DNA containing
water) dimana terdapat DNA
didalamnya. kemudian disimpan di
dalam freezer dengan suhu sekitar -
20ºC. Penyimpanan suhu pada -20ºC
bertujuan agar sampel DNA yang telah
diekstraksi dapat disimpan hingga waktu
berminggu-minggu. Jika suhu yang
dipakai tidak sesuai maka akan
berdampak pada kualitas DNA yang
dapat mengakibatkan rusaknya struktur
dan fungsi DNA.
Running PCR
Tahap running PCR meliputi:
menyiapkan tabung PCR, diberi kode
sesuai dengan kode isolasi DNA yang
akan di PCR. Proses running PCR
menggunakan master mix reagen dengan
primer forward HhaI
(5’GCGCATAAATTCATCAGC-3’)
dan primer reverse HhaII
(5’GCGCAAAACTTAATTACAAAAG
C-3), primer yang digunakan adalah
primer yang cocok dengan genom
parasit filaria yang diperoleh dari desain
primer pada Genbank. Suhu optimasi
yang digunakan untuk running PCR
yaitu: Hot start suhu 95°C selama 5
menit, 1 siklus; Denaturasi suhu 94°C
selama 30 menit ; Annaeling suhu 48°C
dengan waktu 40 menit ; Elongasi suhu
72°C (1’), sebanyak 35 siklus diulang
pada proses denaturasi, annaeling dan
elongasi, suhu optimal tidak disetting
sembarangan, hal ini dapat dilihat dari
muatan basa nitrogen yang ada pada
primer, semakin banyak ikatan G-C
pada primer maka semakin tinggi suhu
pada tahap denaturasi, agar hasil PCR
sesuai dengan yang diharapkan, lalu
dilanjutkan dengan proses ekstra
ekstensi(memanjangkan primer) dan
terakhir cooling down. Cooling down
harus pada suhu 40C, karena DNA labil
terhadap suhu (Santoso & Nungky,
2015)
Elektroforesis
Pembacaan hasil PCR dilakukan
dengan elektroforesis dan diperlukan gel
sebagai media. Pembuatan gel agarose
ini juga perlu diperhatiakn berapa
takaran/kadar yang diinginkan. Dalam
buku ajar takaran dalam pembuatan
agarose 1 gr/ 100ml TAE 1x, proses
pengenceran harus diperhatikan agar
tidak ada gumpalan yang terjadi pada
saat pembuatan gel dan pencetakan gel
diusahakan tidak ada terbentuknya
gelembung pada gel, yang dapat
mengakibatkan gel pecah/retak hal ini
dapat mempengaruhi hasil elektroforesis
yang berpengaruh pada pembentukan
pita/band.
Memasukkan sampel baik
marker ataupun DNA ke dalam sumuran
gel, harus tepat pada sumuran tidak
boleh keluar dari sumuran maupun
masuk ke sumuran lainnya,
memasukkan kontrol positif, sampel dan
kontrol negatif secara berurutan ke ke
dalam sumuran selanjutnya; menutup
chamber elektroforesis dan pastikan
posisi kabel negatif dan positif tidak
terbalik; mengalirkan aliran listrik dari
negatif menuju positif karena proses
elekroforesis berjalan dari kutub negatif
ke kutub positif. Pembacaan dapat
dilakukan dengan alat UV
Transilluminator atau mesin Geldoc alat
yang digunakan untuk mengamati dan
mendokumentasi hasil elektroforesis.
Post Analitik
Pembacaan hasil dari
elektroforesis, untuk pedoman/acuan
dalam pembacaan hasil dengan melihat
marker yang terbentuk, marker adalah
segmen DNA yang spesifik dan telah
diketahui ukurannya. Marker digunakan
untuk mengetahui hasil dari PCR DNA,
marker yang terdapat pada elektroforesis
berfungsi sebagai penanda pasang
basa/base pair(bp) dari molekul DNA
yang bermigrasi. Namun disamping itu,
elektroforesis gel juga memiliki
kekurangan yaitu pada identifikasi
amplikon. Disamping itu, kadang-
kadang hasil PCR dalam gel muncul pita
yang tidak berbentuk (smeary bands) hal
ini dapat terjadi karena pada saat isolasi
DNA masih terdapat kontaminan
maupun RNA dan protein yang terambil
pada saat pemisahan DNA (Tarigan,
2011).
Pada pemeriksaan filaria
pembacaan dan analisa hasil positif
apabila terbentuk band/pita pada 322 bp,
644 bp atau 966 bp. Jika pada
pemeriksaan didapat hasil dibawah 322
bp maka hasil isolasi DNA dapat
dikatakan tidak berhasil mendapatkan
genom spesifik atau DNA yang terambil
bukan DNA spesifik dari filaria. Sampel
positif kemudian dilakukan sekuensing
untuk menentukan spesies microfilaria.
Sekuensing dapat dilakukan jika
didalam laboratorium tersebut terdapat
tenaga ahli atau terlatih dan dapat juga
dikerjakan oleh petugas laboratorium di
lembaga yang melakukan
molekular.(Santosa & Nungky, 2015).
Quality control pada PCR : Di
laboratorium PCR kontrol kualitas
terutama berkaitan dengan kontrol
kesalahan dalam kinerja tes dan
verifikasi hasil tes. Ini termasuk internal
dan eksternal kontrol kualitas. Kontrol
kualitas internal termasuk pemantauan
laboratorium kinerja dengan
menggunakan bahan kontrol dan / atau
pengukuran ulang Kesalahan dalam
pengumpulan sampel, transportasi dan
ekstraksi asam nukleat DNA cukup
stabil ketika berada di dalam sel. DNA
seluler dapat terdegradasi oleh DNAse
berasal dari kontaminasi bakteri dari
sampel, jika sampel sudah
terkontaminasi maka penggunaan tabung
steril tidak ada gunanya. DNA yang
rusak tidak baik untuk PCR dan ini
adalah alasan penting untuk hasil
kualitas positif palsu atau negatif.
Penggunaan inhibitor PCR juga dapat
mempengaruhi, misalnya larutan buffer
lisis tidak akan bekerja baik jika volume
sampel melebihi ketentuan.
Kesalahan dalam PCR
Ada banyak faktor yang dapat
mempengaruhi efisiensi PCR. Kualitas
dari reagen, primer, pH buffer, kualitas
dan kuantitas DNA dan tabung PCR. 1).
Kualitas dari Taq Polimerase sangat
penting diperhatikan, karena jika terjadi
kesalahan dapat memberikan hasil
positif palsu. 2) Primer, terutama pada
saat mendesain primer jika terjadi
kesalahan dalam desain maka dapat
berpengaruh pada gen spesifik yang
akan digunakan serta penentu yang
paling penting dalam spesifisitas PCR.
3) Konsentrasi DNA dalam PCR juga
penting. Terlepas dari kualitasnya juga
banyak atau terlalu sedikit DNA dapat
memberikan hasil negatif palsu. 4)
Kualitas tabung PCR sering diabaikan.
Tabung harus dari dinding yang sangat
tipis yang memungkinkan transfer cepat
panas, hindari adanya udara karena
dapat mempengaruhi perpindahan panas.
Maka dari itu dala penggunaan PCR
perlu adanya tenaga yang terlatih dalam
pengerjaannya agar dapat meminimalisir
kesalahan yang dapat terjadi pada saat
pemeriksaan.
Referensi
1. Adewoyin, A.S. & Nwogoh, B.,
2014. Peripheral Blood Film –
Review. Ann Ib Postgrad Med,
Volume 12, pp,71-79
2. Corkill, G., Rapley, R. 2008. The
Manipulation of Nucleic Acids :
Basic Tools & Techniques in
Molekular Biomethods Handbook
Second Edition, Ed : Walker, J.M.,
Rapley, R. Human Press, NJ, USA.
3. Depkes. 2015. Menuju Eliminasi
Filariasis 2020.
4. Fischer, P et al. 2008. Polymerase
Chain Reaction based Detection of
Lymphatic Filariasis.
5. Kluber S, et al.2001. Rapid PCR-
based detection of Brugia malayi
DNA from bloof spots by DNA
Detection Test Strip. Tranns R. Soc
Trop Med Hyg 2001.
6. Santoso. & Suryaningtyas, N.H.
2015. Spesies Mikrofilaria Pada
Penderita Kronis Filariasis Secara
Mikroskopis dan Polymerase Chain
Reaction (PCR) di Kabupaten
Tanjung Jabung Timur.
7. Surzcky S. 2003. Human Molecular
Biology Laboratory, London :
Balckwell Publishing.
8. Tarigan, Simson. 2011.
Penggunaan Polymerase Chain
Reaction Enzyme Linked
Oligonucleotide Sorbent Assay
(PCR-ELOSA) untuk Deteksi
Agent Penyakit, WARTAZOA
Vol.21, No.1 (2011).
9. Ximenes, C et al. 2014. Detection
of Wuchereria bancrofti DNA in
Paired Serum and Urine Samples
Using Polymerase Chain Reaction-
based System.