A.

Topik

Topik pada praktikum adalah pengamatan spora bakteri

B. Tanggal

Praktikum dilakukan pada Senin, 15 Februari 2016

C. Tujuan

1. Untuk memperoleh keterampilan pewarnaan spora bakteri

2. Untuk mengetahui ada tidaknya spora bakteri

D. Dasar Teori

Bakteri tertentu mampu membentuk spora yang tumbuh di dalam sel.

Spora yang berkembang di dalam sel bisa disebut endospora (Patrick & Baron,
2003). Bakteri membentuk spora disaat lingkungan tidak lagi optimum untuk
perkembangan dan pertumbuhannya (Patrick & Baron, 2003). Endospora
merupakan sel yang mengalai dehidrasi dengan dinding yang menebal serta
memiliki lapisan tambahan (Pommerville, 2014). Endospora membantu bakteri
untuk bertahan hidup dilingkungan yang sangat ekstrim (Pommerville, 2014).
Menurut Hogan (2010), bakteri yang dapat membentuk endospora dapat
bertahan hidup dan mengalami tahapan pertumbuhan sampai beberapa
generasi, dan spora tersebut dibentuk melalui sintesis protoplasma di dalam
sitoplasma sel vegetatifnya. Endospora dapat berada di bagian tengah (central),
ujung (terminal) ataupun tepian sel (Kango, 2013). Pewarnaan spora bakteri
memerlukan teknik pewarnaan tertentu yang dapat menembus dinding spora
(Hastutik, 2012).
Kebanyakan sel vegetatif akan mati pada suhu 60-70oC, namun spora
tetap hidup, spora bakteri ini dapat bertahan dalam air mendidih bahkan selama
1 jam lebih. Selama kondisi lingkungan tidak menguntungkan, spora akan tetap
menjadi spora, sampai kondisi lingkungan dianggap menguntungkan, spora
 akan tumbuh menjadi satu sel bakteri yang baru dan berkembangbiak secara
normal (Volk & Wheeler, 1988).
Kebanyakan sel vegetatif mati pada suhu 60o-70oC, namun endospora
tetap hidup, endospora dapat bertahan dalam air mendidih bahkan selama 1
jam lebih (Kango, 2013). Endospora akan tumbuh menjadi bakteri jika
lingkungan tersebut menguntungkan (Volk & Wheeler, 1988).

E. Alat dan Bahan

 Alat

1. Mikroskop 6. Mangkuk pewarna

2. Kaca benda 7. Lampu spiritus

3. Jarum inokulasi ujung lurus 8. Pipet

4. Jarum inokulasi ujung berkolong 9. Pinset

5. Kawat penyangga

 Bahan

1. Biakan bakteri yang diperoleh dari Kegiatan Ke-II

2. Aquades steril

3. Kertas lensa

4. Alkohol 70%

5. Larutan hijau malakit 5%

6. Larutan safranin 0,5%

7. Lap

8. Korek api

9. Sabun cuci

10. Lisol

11. Tissue
F. Prosedur Kerja

Kaca benda dilewatkan di atas nyala api lampu spiritus

Setetes aquades steril diteteskan di atas kaca benda

Inokulum yang berasal dari koloni bakteri yang akan diperiksa diambil
secara aseptik, diletakkan di atas tetesan aquades, diratakan perlahan
dan ditunggu hingga mengering

Dilakukan fiksasi dengan cara sediaan dilewatkan di atas lampu spiritus

dengan cepat

Larutan hijau malakit diteteskan diatas sediaan, lalu sediaan dipanaskan

di atas nyala api spiritus selama 3 menit. Sediaan dijaga agar tidak
mendidih atau mengering. Selama pemanasan, sediaan dijepit dengan
pinset

Sediaan diletakkan di atas lewat penyangga yang diletakkan diatas

mangkuk pewarna. Sediaan dibiarkan sampai dingin.

Kelebihan larutan hijau malakit dicuci dengan air kran dalam botol
penyemprot

Larutan safranin diteteskan diatas sediaan tersebut dan dibiarkan selama 3

menit
 Kelebihan safranin pada sediaan dicuci, lalu sediaan dikeringkan dan
diamati di bawah mikroskop

G. Hasil Pengamatan

No Ada Tidaknya Bentuk Spora Letak Spora Gambar

Koloni Spora (perbesaran
1000 kali)
1 Ada Oval Sentral

3 Ada Oval Diluar dari sel

vegetatif
(spora keluar)

H. Analisis Data

Berdasarkan data yang telah diperoleh terdapat spora pada koloni 1 dan
3 dengan bentuk yang sama yaitu oval. Setelah dilakukan pewarnaan spora
terhadap koloni bakteri tersebut didapatkan hasil bahwa koloni bakteri satu
memiliki spora berbentuk oval dan terletak di tengah atau sentral. Sedangakan
pada koloni 3 spora berbentuk oval dan terlihat bahwa spora berada diluar sel
vegetatif. Adanya spora bakteri ini ditandai dengan sel vegetatif bakteri
berwarna merah dan spora di dalamnya berwarna hijau.

I. Pembahasan

Praktikum kali ini bertujuan untuk mengamati endospora bakteri

dengan menggunakan prosedur pewarnaan spora. Reagen yang digunakan
adalah safranin 0,5% dan hijau malakait 5%. Pewarnaan dengan safranin
bertujuan untuk mewarnai bagian sel endopora, sehingga sel vegetative
bakterinya akan memberikan warna merah. Metode pewarnaan spora berfungsi
untuk mempermudah pengamatan agar peneliti atau pengamat mampu
membedakan endospora dengan sel vegetatif ataupun mengamati bentuknya.
Dalam sel vegetatif endospora tetap dapat dilihat di bawah mikroskop
meskipun tanpa pewarnaan namun tampak sebagai bulatan transparan dan
sangat refraktil. Endospora tidak mudah diwarnai dengan zat pewarna pada
umumnya, karena endospora sulit dibedakan dengan badan inklusi. Dari hal
tersebut metode pewarnaan endospora dengan larutan malacite green dapat
dijadikan pedoman atau dasar. Metode ini merupakan metode Shaeffor yang
mana foton endospora diwarnai pertama kali dengan larutan malacite green.
Pewarnaan tersebut sifatnya kuat karena dapat berpenetrasi ke dalam
endospora bakteri. Teknik tersebut akan menghasilkan warna hijau pada
endospora dan merah pada sel vegetatif (James, 2002). Warna hijau malakit
ini berfungsi sebagai indikator adanya spora bakteri.

Setelah sediaan ditetesi hijau malakit kemudian sediaan harus difiksasi

atau dipanaskan selama 3 menit. Hal tersebut bertujan untuk melelehkan
lapisan lilin pada spora sehingga zat warna dapat masuk. Langkah selanjutnya
adalah didinginkan hal tersebut bertujuan agar lapisan lilin kembali mengeras
dan membeku sehingga menyebabkan zat warna (malacite green)
terperangkap dalam lapisan tersebut sedangkan sel vegetatifnya dapat
terwarnai oleh zat pewarna kedua. Warna hijau malakit ini berfungsi sebagai
indikator adanya spora bakteri. Sediaan yang telah dibiarkan dingin
selanjutnya akan dibilas dengan air kran untuk menghilangkan kelebihan
warna pada sediaan. Pewarnaan endospora dengan larutan malacite green akan
menunjukkan reaksi positif pada bakteri penghasil endospora, yaitu larutan
akan berikatan dengan spora sehingga saat pencucian akan tetap berwarna hijau
dan cat penutup atau safranin tidak bisa diikat oleh endospora (Pearce, 2009),
dan menyebabkan pewarna kedua yaitu safranin dapat meresap pada sel
vegetatif. Adanya pewarnaan kedua ini menyebabkan sel vegetatif bakteri
berwarna merah. Pada pewarnaan kedua dengan menggunakan safranin
sediaan dibiarkan selama 3 menit agar safranin dapat meresap dan setelah itu
mencuci dengan air kran untuk menghilangkan kelebihan larutan safranin.
Kemudian mengeringkan safranin dengan kertas penghisap dan tidak ditiup-
 tiup agar menghindari kontaminasi dengan bakteri lain yang menempel pada
kaca benda.

Berdasarkan hasil pengamatan, pada koloni I dan III ditemukanya

adanya spora dan keduanya berbentuk oval. Pada koloni I endospora terletak
pada bagian sentral sedangkan pada koloni III spora terletak di luar sel
vegetative. Pada koloni 1 adanya spora tersebut dapat dilihat pada saat diamati
dibawah mikroskop cahaya dengan perbesaran 400x maka akan terlihat bahwa
pada sel vegetative bakteri yang bewarna merah akan terlihat bintik hijau
dibagian tengah sel vegetative bakteri. Sedagkan pada koloni III spora berada
di luar sel vegetatif dikarenakan dinding sel vegetative mengalai lisis pada saat
fiksasi atau pemanasan sehingga spora bakteri dapat keluar. Dengan adanya
kemampuan untuk membentuk spora ini, bakteri tersebut dapat bertahan hidup
pada kondisi yang ekstrim. Menurut Pelczar (1986) bakteri yang dapat
membentuk endospore ini dapat hidup dan mengalami tahapan-tahapan
pertumbuhan sampai beberapa generasi, dan spora terbentuk melalui sintesis
protoplasma baru di dalam sitoplasma sel vegetatifnya.

J. Kesimpulan
1. Spora bakteri tidak dapat diwarnai dengan pewarnaan biasa, diperlukan
teknik pewarnaan khusus dengan penggunaan larutan hijau malakit 5%,
dan sel vegetative juga diwarnai dengan larutan safranin 0,5% sehingga sel
vegetative ini berwarna merah dan spora akan berwarna hijau.
2. Adanya spora pada bakteri ditandai dengan warna hijau yang terdapat pada
Sel vegetatif bakteri, sel spora dapat terletak secara centralis, lateralis, dan
terminalis. Spora bakteri merupakan bentuk pertahanan bakteri terhadap
pengaruh buruk dari luar. Apabila pada bakteri tersebut memiliki spora
berarti bakteri tersebut masih mampu untuk memenuhi nutrisi dalam
lingkunganya. Pada sediaan koloni bakteri I dan III sama-sama memiliki
spora dengan bentuk oval namun terletak pada posisi yang berbeda. Pada
koloni I terletak secara sentralis didalam sel vegetative sedangkan koloni
III terletak di luar sel vegetatifnya (karena dinding sel vegetatif telah
mengalami lisis)
K. Diskusi
1. Apa fungsi spora bagi bakteri?
Jawab: Fungsi spora bagi bakteri adalah untuk menjalankan fungsi pertahanan
apabila kondisi lingkungan tidak optimum untuk pertumbuhan dan
perkembang biakan bakteri tersebut, misalnya medium mengering, kandungan
nutrisi menyusut, dan lain sebagainya.
2. Mengapa diperlukan pemanasan dalam proses pewarnaan spora? Jelaskan!
Jawab: Fungsi pemanasan dalam proses pewarnaan spora dilakukan agar
komponen protein dari dinding dan membran sel bakteri menjadi rusak.
Rusaknya dinding dan membran sel bakteri menyebabkan zat pewarna menjadi
mudah masuk dan mewarnai sel.

Kesimpulan

3. Spora bakteri (endospora) tidak dapat diwarnai dengan pewarnaan biasa,

diperlukan teknik pewarnaan khusus dengan penggunaan larutan hijau
malakit 5%, dan untuk memperjelas pengamatan, sel vegetative juga
diwarnai dengan larutan safranin 0,5% sehingga sel vegetative ini berwarna
merah dan spora akan berwarna hijau.
4. Adanya spora pada bakteri ditandai dengan warna hijau yang terdapat pada
bakteri, sel spora dapat terletak secara centralis, lateralis, dan terminalis.
Spora bakteri merupakan bentuk bakteri yang sedang dalam usaha
mengamankan diri terhadap pengaruh buruk dari luar. Apabila pada bakteri
tersebut tidak memiliki spora berarti bakteri tersebut masih mampu untuk
memenuhi nutrisi dalam lingkunganya/ medium masih mencukupi untuk
bertahan hidup.
 DAFTAR RUJUKAN

Hastutik, U., S. 2012. Petunjuk Praktikum Mikrobiologi. Universitas Muhammadiyah

Malang. Malang.
Hogan, C., M. 2010. Bacteria in Sidney Draggan; C.J. Cleveland. Encyclopedia of
Earth. Washington DC: National Council for Science and the Environment.
James Joyce. 2002. Prinsip-Prinsip Sains untuk Keperawatan. Retno Indah,
penerjemah; Jakarta: Erlangga.
Kango, N. 2010. Textbook of microbiology. I.K. International Pub. House, New Delhi.
Patrick, M., R. & Baron, E., J. 2003. Manual of Clinical Microbiology .Washington,
D.C.: ASM.
Pearce Evelyn. 2009. Anatomi dan Fisiologi untuk Paramedis. Yuliani Sri,
penerjemah; Jakarta: PT Gramedia Pustaka Utama.
Pelczar MA, J Chan, ECS Chan. 1986. Dasar-Dasar Mikrobiologi. Hadioetomo RS,
penerjemah; Jakarta: UI Press.
Pommerville, J., C. 2014. Fundamentals of microbiology, 10th ed. ed. Jones &
Bartlett Learning, Burlington, MA.
Volk and Whleer, 1998. Mikrobiologi Dasar. Jakarta : Erlangga.
Lampiran

Pewarnaan spora pada Pewarnaan spora pada

koloni 1 perbesaran 1000X koloni 3 perbesaran 1000x

Pemberian metilen Proses pencucian

green

Pemberian safranin