KROMATOGRAFI CAIR KINERJA TINGGI

I. TUJUAN
Setelah melakukan praktikum ini mahasiswa diharapkan dapat :
 Menjelaskan teori kromatografi cair kinerja tinggi;
 Mengoperasikan alat kromatografi cair kinerja tinggi;
 Menganalisis suatu senyawa kimia baik secara kualitatif maupun kuantitatif
dengan menggunakan alat kromatografi cair kinerja tinggi.

II. ALAT DAN BAHAN YANG DIGUNAKAN

 Alat yang digunakan
1. Perangkat HPLC + Injektor + pencetak kromatogram
2. Kolom Lichosphere C-18
3. Syringe
4. Penyaring milipore
 Bahan yang digunakan
1. Cafein 15 ppm
2. Metanol

III. DASAR TEORI

Kromatografi adalah metode suatu proses fisik yang digunakan untuk

memisahkan komponen-komponen dari suatu campuran senyawa kimia. Dalam
kromatografi, campuran tersebut dibuat sebagi zona yang sempit (kecil) pada salah satu
ujung media porus seperti adsorben, yang disebut alas atau landasan kromatografi. Zona
campuran kemudian digerakan dengan larutan suatu cairan atau gas yang bergerak
sebagai pembawa, melaui media porus tersebut, yang berupa partikel-partikel yang
”diam“ (tidak bergerak, statisiones). Sehingga akibatnya masing-masing komponen dari
campuran tersebut akan terbagi (terdistribusi) secara tidak merata antara alas yang “diam”
dan cairan atau gas yang membawanya. Akibat selanjutnya, masing-masing komponen
akan bergerak (bermigrasi) pada kecepatan yang berbeda (differential migration) dan
dengan demikian, akan sampai pada ujung lain dari alas tersebut pada waktu yang
berlainan, dan dengan demikian terjadilah pemisahan diantara komponen-komponen yang
ada. (Bahti, Husein H. 2011: 4).
Kromatografi merupakan salah satu metode pemisahan komponen-komponen
campuran yang berdasarkan distribusi diferensial dari komponen-komponen sampel
diantara dua fasa, yaitu fasa gerak dan fasa diam. Salah satu teknik kromatografi yang
dimana fasa gerak dan fasa diamnya menggunakan zat cair adalah HPLC (High
Performance Liquid Chromatography) atau didalam bahasa Indonesia disebut KCKT
(Kromatografi Cair Kinerja Tinggi).
Teknik HPLC merupakan suatu metode kromatografi cair-cair, yang dapat
digunakan baik untuk keperluan pemisahan maupun analisis kuantitatif. Analisis
kualitatif dengan teknik HPLC didasarkan pada pengukuran luas area standar. Pada
prakteknya, metode pembandingan area standar dan sampel kurang menghasilkan data
yang akurat bila hanya melibatkan suatu konsentrasi standar. Oleh karena itu, dilakukan
dengan menggunakan teknik kurva kalibrasi. (Wiji, dkk. 2010 : 17).
HPLC yang modern telah mucul akibat pertemuan dari kebutuhan, keinginan
manusia untuk meminimalis pekerjaan, kemampuan teknologi, dan teori untuk memandu
pengembangan pada jalur yang rasional. Jelas sebelum era peralatan yang modern bahwa
LC (Liquid Chromatography) memiliki kekuatan pemisahan yang sangat ampuh, bahkan
untuk komponen-komponen yang berhubungan sangat erat. LC harus ditingkatkan
kecepatannya, diotomasasi, dan harus disesuaikan dengan sampel-sampel yang lebih
kecil, waktu elusi yang beberapa jam (Underwood, Day. 2002 : 553).
HPLC berbeda dari kromatografi kolom cairan konvensional dalam hal digunakan
bahan pengisi kolom berupa partikel yang sangat kecil berukuran sampai 3-5 μm (1μm =
10-6 m). Sehingga mengharuskan digunakannya tekanan tinggi sampai 20.000 Kpa ( 200
atmosfir) untuk mengalirkan fasa gerak melalui kolom tersebut.
Ternyata, penggunaan bahan pengisi kolom yang lebih kecil ini bukan saja telah
memperbaiki kecepatan analisis, tapi (dari ini yang lebih penting) ialah telah
menghasilkan suatu teknik dengan daya pisah yang tinggi. HPLC mempunyai kelemahan-
kelemahan yang diantaranya, peralatannya lebih rumit, tidak murah, dan perlu
pengalaman. Untuk beberapa jenis zat, metode ini kurang sensitif. Selain itu sampel
disyaratkan harus stabil dalam larutan.
Berdasarkan kepolaran fasa geraknya, HPLC dibagi menjadi 2 macam yaitu :
a) Fase Normal HPLC
HPLC jenis ini secara esensial sama dengan kromatografi kolom. Meskipun
disebut normal, ini bukan bentuk biasa dari HPLC. Kolom ini diisi dengan
partikel silika yang sangat kecil dan pelarut nonpolar seperti heksan sebuah
kolom sederhana memiliki diameter internal 4,6 mm (dan kemungkinan
kurang dari nilai ini) dengan panjang 120 nm-250 nm. Senyawa-senyawa
polar dalam campuran melalui kolom akan melekat lebih lama pada silika
yang polar dibanding dengan senyawa-senyawa non polar. Oleh karena itu,
senyawa yang non polar kemudian akan lebih cepat melewati kolom. Apabila
pasangan fasa diam lebih polar daripada fasa geraknya maka sistem ini
disebut HPLC fase normal.
b) Fase Balik HPLC
Pada HPLC jenis ini, ukuran kolomnya sama, tetapi silika dimodifikasi
menjadi non polar melalui pelekatan hidrokarbon dengna rantai panjang pada
permukaannya secara sederhana baik berupa atom karbon 8 atau 18. Dalam
kasus ini, akan terdapat interaksi yang kuat antara pelarut polar dan molekul
polar dalam campuran yang melalui kolom. Interaksi yang terjadi tidak
sekuat interaksi antara rantai-rantai hidrokarbon yang berlekatan pada silika
(fasa diam) dan molekul-molekul polar dalam larutan. Oleh karena itu
molekul-molekul polar akan lebih cepat bergerak melalui kolom. Sedangkan
molekul-molekul non polar akan bergerak lambat karena interaksi dengan
gugus hidrokarbon.

Komponen instrumentasi penyusun Kromatografi Cair Kinerja Tinggi :

a) Reservoir Pelarut
Jumlah reservoir pelarut : (1) bisa salah satu atau lebih; berisi pelarut organik
seperti heksana, atau air, atau campuran air dan pelarut organik seperti
metanol,tergantung kepada apakah kita bekerja menggunakan fasa normal atau fasa
terbalik atau metode kromatografilainnya.
Bila sistem KCKT dilengkapi dengan alat pencampuran (2) (atau mempunyai
lebih dari satu pompa) yang memungkinkan membuat campuran-campuran pelarut
dengan komposisi yang diatur dengan bantuan suatu programener, maka diperlukan lebih
dari satu reservoir, sistem ini diperlukan untuk melakukan elusi bergradien dimana
komposisi pelarut diubah-ubah selama pengelusian.
Pelarut fasa gerak dipompa dari reservoir oleh sistem pompa, demikian sehingga
campuran pelarut dengan komposisi tertentu dapat mengalir tanpa denyutan (pulseless).
Kecepatan aliran dapat diatur antara 0,1 – 10 mL/menit. Gas yang terlarut dalam pelarut
fasa gerak yang digunakan harus dibuang terlebih dahulu (de-gassing), selain itu, pelarut
harus di saring dahulu agar bebas dari partikel-partikel kecil yang tidak larut.
Pada saluran-saluran pelarut biasanya dipasang saringan (berukuran 2-10 mμ)
untuk mencegah partikel-partikel kecil yang tidak larut tadi, masuk kedalam kolom.
Saringan ini harus diganti atau dibersihkan bila terjadi penyumbatan. Diantara jenis-jenis
pompa yang paling umum digunakan untuk sistem HPLC adalah jenis pompa “isap dan
tekan ” (reciprocating).
Pompa “isap dan tekan” yang sederhana mempunyai kecepatan isap yang tetap.
Artinya, waktu yang diperlukan untuk langkah mengisis sama dengan waktu untuk
langkah memompa. Pompa seperti ini memerlukan perendam denyutan yang baik. Oleh
karena itu, pompa jenis ini umumnya menggunakan dua pengisap yang masing-masing
bekerja kebalikan satu dari yang lainnya. Setiap pengisap memppunyai dua katup
pengendali.
Pelarut diisap ke dalam ruang pengisap melalui katup pemasukkan dan kemudian
ditekan ke luar melalui katup pengeluaran. Untuk melakukan elusi bergradien diperlukan
dua sistem pompa yang masing-masing mempunyai satu atau dua penghisap. Ada dua
macam rancangan utama pompa gradien yaitu pecampuran tekana tinggi yang
mempunyai hantaran dua pompa dan pencampuran tekana rendah dengan hantaran satu
pompa.
Rancangan pompa gradien yang pertama, yakni sistem pencampuran tekanan
tinggi, mempunyai dua pompa dan satu pengendali, masing-masing pompa
menghantarkan satu sistem pelarut. Fungsi pengendali adalah mengatur kecepatan aliran
masing-masing pelarut sesuai dengan komposisi yang diinginkan dan juga berfungsi
untuk menjamin terjadinya pengadukan yang baik oleh suatu pengaduk dinamik. Setiap
pompa mempunyai dua penghisap dan setiap penghisap mempunyai dua katup. Jenis
yang kedua, pompa pembagi bertekanan rendah hanya mempunyai satu penghisap. Untuk
melakukan elusi gradien hanya diperlukan satu pompa. Pompa ini mempunyai katup
pembagi, tidak mempunyai pengendali gradien.
Dengan katup-katup pembagi dimungkinkan untuk membuat suatu campuran
terner (tiga jenis pelarut) dengan perbandingan yang diinginkan. Jadi untuk melakukan
gradien gradien tidak diperlukan lebih dari satu pompa. Katup-katup pembagi ini
dikendalikan oleh suatu microprocessor dan terbuka selama langkah pemasukan pelarut.
(Bahti, Husein. H . 2011 : 34-40)

b) Kolom
Kolom HPLC biasanya terbuat dari stailess steel, akan tetapi ada juga yang terbuat
dari gelas berdinding tebal. Kolom utama berisi fasa diam, tepat terjadinya pemisahan
campuran menjadi komponen-komponen. Bergantung keperluannya kolom utama dapat
digunakan untuk analisis atau preparatif setiap komponen yang keluar kolom ditampung
pada tabung yang berbeda dan keluaran HPLC dihubungkan dengan fraction colector
selain kolom utama dikenal pula kolom pengaman.
Kolom utama berisi fasa dian dan jenisnya bervariasi bergantung pada keperluan,
misalnya dikenal kolom C8, C-18, cyanopropyl, dan penukar ion. Kolom utama untuk
HPLC biasanya berukuran panjang berkisar antara 5-30 cm dan diameter dalam berkisar
4,5–10 mm.
Kolom pengaman (guard coloumn) disebut juga pra-kolom karena letaknya
sebelum sistem pemasukan cuplikan. Kolom ini berukuran pendek 5 cm dengan diameter
4,6 mm biasanya dipaking dengan partikel silika berukuran besar dari ukuran partikel
kolom utama. Kolom pengaman mempunyai dua fungsi yaitu: menyaring kotoran yang
terbawa oleh fasa gerak dan untuk menjenuhkan fasa gerak dalam rangka menghindarkan
terjadinya erosi fasa diam oleh aliran pelarut.
Kolom merupakan jantung kromatograf, keberhasilan atau kegagalan analisis
bergantung pada pilhan kolom dan kondisi kerja yang tepat. Kolom dapat dibagi menjadi
dua kelompok :
- Kolom analitik
 Garis tengah dalam 2-6 mm, panjang bergantung pada jenis kemasan, untuk
kemasan pelikel biasanya panjang kolom 50-100 cm, untuk kemasan
mikropartikel berpori biasanya 10-30 cm.
- Kolom preparative
Umumnya bergaris tengah 6 mm atau lebih besar, dan panjang 25-100 cm.

c) Pompa
Pada HPLC, pompa ini berfungsi untuk mengalirkan fasa gerak cair melalui
kolom yang berisi serbuk halus. Digunakan pompa bertekanan tinggi dalam metode ini
sebagai akibat penggunaan fasa gerak yang berupa zat cair yang akan sukar mengalir
dalam kolom yang dipadatkan dengan serbuk halus. Oleh karena itu, agar zat cair dapat
melewati kolom secara tepat maka dibutuhkan bantuan pompa yang bertekana tinggi.
Pompa yang digunakan dalam HPLC harus memenuhi persyaratan sebagai berikut :
 Menghasilkan tekanan sampai 5000 psi
 Kecepatan alir berkisar antara 0,1-10 mL/menit
 Bahan tahan korosi
 Keluaran bebas pulse

d) Injector Sample
Sampel-sampel cair dan larutan disuntikan secara langsung ke dalam fase gerak
yang mengalir dibawah tekanan menuju kolom menggunakan alat penyuntik yang terbuat
dari tembaga tahan karat dan katup teflon yang dilengkapi dengan keluk sampel (sample
loop) internal atau eksternal.
Salah satu jenis penyuntik untuk memasukan sampel ke dalam sistem (kolom)
kromatografi adalah penyuntik loop. Dalam prakteknya, loop tidak perlu diisi penuh, tapi
bila tidak diisi penuh akan mengakibatkan lebih jeleknya presisi hasil eksperimen dan
ketergantungan presisi tersebut kepada bagaimana si-operator menggunakan penyuntik.
Perlu diingat, bahwa penyuntik tidak boleh dicabut sebelum pegangan (handle)
penyuntik diputar dari posisi load (“pengisap”) ke posisi inject (“suntik”). Karena sampel
akan mengalir ke saluran pembuangan. Hal yang terakhir ini tentunya tidak diinginkan,
pegangan penyuntik harus diputar cepat agar pemutusan aliran ke dalam diinginkan.
Pegangan penyuntik harus diputar cepat agar pemutusan aliran ke dalam kolom, antara
posisi pengisian (load) dan posisi penyuntikan (inject) berlangsung cepat.
Yang menjadi faktor ketidak tepatan pengukuran HPLC salah satunya terletak
pada keterulangan pemasukan cuplikan kedalam paking kolom. Masalahnya kebanyakan
memasukan cuplikan kedalam kolom dapat menyebabkan band broadening. Oleh karen
itu cuplikan yang dimasukkan harus sekecil beberapa puluh mikroliter. Beberapa teknik
pemasukan cuplikan kedalam sistem dapat diuraikan sebagai berikut :
 Injeksi Syringe
Syringe disuntikan melalui septum (seal karet) dan untuk ini dirancang syringe
yang tahan tekanan sampai 1500 psi. Akan tetapi keterulangan injeksi stringe ini
sedikit lebih baik dari 2-3 % dan sering lebih jelek.
 Injeksi Stop Flow
Aliran pelarut dihentikan sementara, sambungan pada ujung kolom dibuka dan
cuplikan disuntikan langsung kedalam ujung kolom. Setelah menyambung
kembali kolom maka pelarut dialirkan kembali. Untuk memasukkan cuplikan
kedalam fasa gerak perlu dua langkah : sejumlah volume cuplikan disuntikkan ke
dalam loop dan posisi ‘load’. Cuplikan masih berada dalam loop ; kran diputar
untuk mengubah posisi ‘load’ menjadi posisi ‘injeksi’ dan fasa gerak membawa
cuplikan kedalam kolom (kran cuplikan)
 Kran Cuplikan
Jenis pemasukan cuplikan ini disebut juga loop dan paling banyak digunakan.
Untuk memasukan cuplikan ke dalam aliran fasa gerak perlu 2 langkah, yaitu:
sejumlah volume cuplikan disuntikan ke dalam loop dalam posisi load, cuplikan
masih berada dalam loop; kran diputar untuk mengubah posisi load menjadi posisi
injeksi dan fasa gerak membawa cuplikan ke dalam kolom.

e) Detektor
Ada dua jenis detektor yaitu detektor selektif, adalah detektor yang peka terhadap
golongan senyawa tertentu saja. Dan detektor universal, yaitu detektor yang peka
terhadap golongan senyawa apapun kecuali pelarutnya. Diantara detektor yang
digunakan dalam KCKT adalah :
Detektor Ultra Violet – Visible (Sinar Tampak)
Detektor UV terutama digunakan untuk pendeteksian senyawa-senyawa
organik. Detektor UV dilengkapi dengan pengatur panjang gelombang, sehingga
panjang gelombang UV yang digunakan dapat dipilih sesuai dengan jenis cuplikan
yang diukur.
 Detektor UV-Visible (uv-sinar tampak) paling banyak digunakan, karena
sensitivitasnya yang baik mudah menggunakannya, tidak merusak senyawa yang di
analisis, dan memungkinkan untuk melakukan elusi bergradien. Ada yang dipasang
pada panjang gelombang tetap yaitu pada panjang gelombang 254 nm, dan ada yang
panjang gelombangnya dapat dipilih sesuai dengan diinginkan antara 190-600 nm.
Detektor dengan panjang gelombang variabel ini ada yang dilengkapi alat untuk
memilih panjang gelombang secara otomatis dan dapat me-nol-kan sendiri (allto
zero). Detektor jenis ini juga ada yang menggunakan drode erray (sebagai pengganti
photo tube), sehingga dapat melakukan pembacaan absorban yang kontinyu pada
berbagai panjang gelombang.
Detektor Indeks Bias
Detektor indeks bias memberi respons terhadap senyawa yang dianalisis apapun,
termasuk pelarutnya sendiri. Prinsip dasar kerja detektor ini adalah perubahan indeks bias
karena adanya komponen sampel dalam pelarut. Detektor ini bersifat tidak merusak (non-
destruktif), sensitivitasnya cukup tinggi (minimum 10-6 g) dan umumnya digunakan
dalam pekerjaan preparatif. Dengan detektor ini tidak dapat dilakukan elusi bergradien.
Detektor ini digunakan dalam kromatografi eklusi dan dalam analisis karbohidrat.
Beberapa hal yang harus diperhatikan dalam menggunakan detektor indeks bias :
1. Bila digunakan lebih dari satu pelarut, maka campuran dahulu hingga homogen dan
bebaskan dari gas terlarutnya.
2. Setelah detektor dihidupkan, tunggu beberapa lama sebelum digunakan sampai
detektor stabil.
3. Bila digunakan lebih dari satu detektor yang dipasang berurutan, maka tempatkanlah
detektor indeks bias pada urutan terakhir.
4. Untuk saluran pembuangan, gunakanlah selang teflon berdiameter dalam (inner
diameter) yang besar tapi pendek.
5. Tempatkan detektor pada kondisi suhu yang dipelihara tetap.
6. Jaga agar sel indeks bias selalu bersih.

6. Rekorder
Rekorder adalah alat untuk mencetak hasil percobaan pada lembar berupa
kumpulan puncak (kromatogram) kromatogram HPLC yang didapat berguna untuk
analisis kualitatif dan kuantitatif. Luas peak menyatakan konsentrasi komponen dalam
campuran dan jumlah peak menyatakan jumlah komponen. Analisis kualitatif dapat
dilakukan dengan cara membandingkan waktu retensi (rt) analit atau sampel dengan
waktu retensi standar. Sedangkan analisis kuantitatif depat dilakukan dengan didasarkan
pada luas peak atau tinggi peak dengan metode standar kalibrasi.

Prinsip kerja instumentasi HPLC

HPLC menggunakan fasa gerak untuk memisahkan komponen dari sebuah
campuran komponen (analit). Prinsip keja HPLC adalah pemisahan setiaap komponen
dalam sampel berdasarkan kepolarannya. Yang paling membedakan HPLC dengan
kromatografi lainnya adalah pada HPLC digunakan tekanan tinggi untuk mendorong fasa
gerak. Fasa diam yang biasa digunakan (pada kolom) HPLC jenis fasa terbalik adalah
RMe2SiCl, dimana R adalah rantai alkana C-18 atau C8. Sementara fasa geraknya berupa
larutan yang diatur komposisinya (gradien elusi), misalnya : air:asetonitril (80:20), hal ini
bergantung pada kepolaran analit yang akan dipisahkan. Campuran analit akan terpisah
berdasarkan kepolarannya, dan waktu retensinya akan berbeda, hal ini akan teramati pada
spektrum yang punsak-puncaknya terpisah.
Prinsip dasar HPLC adalah pemisahan komponen-komponen terjadi karena
perbedaan kekuatan interaksi antara solut-solut terhadap fasa diam. Keunggulan
menggunakan HPLC dibandingkan kromatografi gas yaitu terletak pada kemampuannya
untuk menganalisis cuplikan yang tidak menguap dan labil pada suhu tinggi. HPLC tidak
terbatas pada senyawa organik tapi mampu menganalisis senyawa anorganik, mampu
menganalisis cuplikan yang mempunyai molekul tinggi (beratnya), mampu menganalisis
cuplik yang mempunyai titik didih yang sangat tinggi seperti polimer.

Cara kerja instumentasi HPLC

Prinsip kerja alat HPLC adalah pertama fasa gerak dialirkan melalui kolom
kedetektor dengan bantuan pompa. Kemudian cuplikan dimasukan ke dalam aliran fasa
gerak dengan cara penyuntikan. Didalam kolom terjadi pemisahan komponen-komponen
campuran karena perbedan kekuatan interaksi antara solut-solut terhadap fasa diam.
Solut-solut yang kurang kuat interaksinya dengan fasa diam akan keluar dari kolom
terlebih dahulu. Sebaliknya solut-solut yang interaksinya kuat dengan fasa diam akan
keluar dari kolom lebih lama. Setiap komponen yang campuran yang keluar kolom
dideteksi oleh detektor kemudian direkam dalam bentuk kromatogram.

Gambar Skema Instrumentasi HPLC

IV. LANGKAH KERJA
Prosedure operational instrument HPLC thermo-dionex:

1. Terlebih dahulu siapkan fase gerak yang akan digunakan untuk analisa dan masukkan
ke botol fase gerak yang tersedia.
2. Periksa ketersediaan cairan seal wash pada pompa, bila habis / sudah lama harap di
tambah / ganti dengan Aquadest baru.
3. Pasang kolom sesuai kebutuhan analisa.
4. Nyalakan instrument : pompa, detektor ( tombol poower ada dibelakan instrument)
5. Nyalaka CPU komputer dan monitor.
6. Aktifkan server monitor pada bagian pojok kanan bawah layar monitor.
7. Buka software chromelon 6,8
8. Buka panel instrument : (bia ada warning tekan ok)
9. Lakukan koneksi software dengan instrument, caranya dengan memberi cheklist
 pada pump dan detektor.
10. Lakukan purging pada chanel fase gerak yang akan digunakan:
a) Buka knop purging
b) Atur prosentasi pompa
c) Klik purge pada software
Bila selesai jangan lupa tutup kembali knob purging
11. Alirkan fase gerak ke kolom dengan flow 1ml/mnt.
12. Nyalakan lampu Uv-vis pada detektor sesuai kebutuhan analisa.
13. Biarkan kolom teraliri fase gerak selama 30-60 menit
14. Pindahkan window software ke posisi browser.
15. Buat sequence, instrument methode program dan processing data (rincian ada pada
bagian selanjutnya)
16. Bila sequence, program dan instrument methode telah dibuat, kik batch start
17. Klik ready check untuk memastikan sequence telah siap running, lalu start
18. Lakukan injeksi standard dan sampel.
Cat : bila ingin menginjeksi sampel, posisi injektor ada pada posisi load(atas)
Bila sudah ada warning waiting for injektion, lalu putar injektor ke posisi INJECT
19. Lakukan processing data ( ada pada bagian proses kuantitasi )
20. Bila analisa telah selesai, cuci terlebih dahulu kolom yang digunakan dengan
kandungan air : meOH selama 30-60 menit
21. Akhiri pencucian kolom dengan dialiri metanol 100% selama 30 menit.
22. Matikan flow pompa dan lampu yang digunakan
23. Tutup software chromelleonbeserta server monitornya
24. Matikan instrument HPLC dan komputernya.

Cara membuat methode file HPLC

1. Klik file - new

2. Klik methode file - OK
3. Klik file - save as
4. Cari folder yang diinginkan - beri nama methodnya - save
Cara membuat program

1. klik new - program file - ok

2. Klik my computer - HPLC - next
3. Masukkan konsentrasi fase gerak yang diinginkan, dan flow rate yang digunkan
- next
4. Masukkan waktu run time setiap injektor --- next
5. Masukkan panjang gelombang yang diinginkan -- next
6. Lalu simpan, file --- beri nama ---- save

Cara membuat sequence

1. Klik new --- sequence -- ok

2. Klik next tanpa mengubah ketentuan informasi yang ada
3. Lalu klik finish

Cara Kuantitasi data HPLC

1. Pada window browser double klik salah satu standar

2. Akan muncul hasil data Uv-vis lalu klik QNT
3. Klik general, masukkan dimension of amounts, mis : ppm
4. Klik detection -- lakukan pengaturan integrasi, mis : minimum area : 0,1
5. Klik peak table --- arahkan panah ke tengah peak --- isi nama zat --- klik add
peak to peak --- close, lalu hapus baris peak 1 yang tak bernama.
6. Klik amount title --- masukkan amount of consentrate standart, mis : 60 ppm
7. Klik save
8. Klik printer layout
9. Tampil hasil proses data baik standar maupun sampel --- print
10. Klik next sample untuk melihat data injeksi selanjutnya ---- print
11. Print semua data yang dibutuhkan.
V. DATA PENGAMATAN

 Fase gerak : metanol dan aquadest (cair)

 Fase diam : silika gel (padatan)
 Kolom : C18
 Panjang gelombang : 272nm
 Kecepatan fase gerak : 1ml/mnt
 Sampel : 1. Standar kaffein
2. Panadol
3. Oskadon
4. Bodrex
 Konsentrasi sampel kaffein : 20 ppm
NO Nama Ret. Time Area Konsentrasi
ppm
1 Standar Kaffein 3,08 2,180 14,487

2 Oskadon 3,07 3,663 21,018

3 Panadol 3,10 3,031 19,536

4 Bodrex 3,09 6,930 39,759

VI. PERHITUNGAN
 Standar kaffein :
Konsentrasi = 50 mg kaffein =1000 ppm
0,05L
Konsentrasi Larutan =
M1 x V1 = M2 x V2
1000 x 1 = M2 x 50
M2 = 1000
50
M2 = 20 ppm
VII. ANALISA DATA
 Pada praktikum ini bertujuan untuk menganalisa sampel kaffein menggunakan alat
penyerap yang bernama High Performance Liquid Chromatography (HPLC) atau yang
lebih dikenal dengan Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT).
Kromatografi adalah teknik pemisahan campuran yang didasarkan atas perbedaan
distribusi dari komponen-komponen campuran tersebut diantara dua fase, pada HPLC
kedua fase tersebut adalah silika gel (padatan) sebagai fase diam dan metanol sebagai
fase gerak yang berupa zat cair. HPLC berfungsi sebagai sebuah alat untuk mendorong
analit melalui sebuah kolom fase diam dengan memompa cairan (fase gerak) pada
tekanan tinggi melalui kolom yang nantinya akan diteruskan ke rekorder lalu di buat ke
dalam bentuk grafik.
Prinsip kerja HPLC adalah dengan bantuan pompa fase gerak cair yang dialirkan
melalui kolom menuju detektor. Kemudian cuplikan dialirkan kedalam aliran fase gerak
dengan cara penyuntikan.
Terjadi pemisahan komponen-komponen campuran didalam kolom. Pemisahan
tersebut bergantung atau didasarkan pada tingkat kepolaritasan dari setiap komponen-
komponen yang ada di dalam campuran tersebut. Apabila sifat kepolaran salah satu
komponen sama atau hampir sama dengan fase diam maka komponen tersebut akan
tertahan sejenak didalam kolom dan akan keluar sedikit lebih lama dibandingkan dengan
komponen lain yang sifat kepolarannya tidak sama atau berbeda dengan fase diam.
Pada praktikum, nilai konsentrasi pada standar kaffein sebesar 14,487 ppm, dengan
Ret. Time 3,08 menit yang menandakan selama 3,08 menit waktu yang diperlukan
komponen sampel untuk melintasi kolom. Pada sampel bodrex, konsentrasi kaffein
sebesar 39,759 ppm. Untuk sampel selanjutnya, sampel oskadon memiliki konsentrasi
kaffein sebesar 21,018 ppm. Dan pada sampel panadol, konsentrasi kaffein sebesar
19,536 ppm.
Pada setiap sampel, volume yang diinjeksikan masing-masing sebesar 20 µL. Serta,
Menggunakan lampu UV yaitu panjang gelombang 273. Pada saat analisa kaffein, harus
terhindar dari adanya gelembung atau gas udara dalam penganalisaan dari awal hingga
akhir agar pembacaan detector tidak terganggu dan hasilnya tida kacau.
VIII. Kesimpulan
 Berdasarkan praktikum yang telah dilakukan didapatkan kesimpulan sebagai
berikut :

1. Kromatografi adalah teknik pemisahan campuran yang didasarkan atas perbedaan

distribusi dari komponen-komponen campuran tersebut diantara dua fase.
2. HPLC berfungsi sebagai sebuah alat untuk mendorong analit melalui sebuah kolom
fase diam dengan memompa cairan (fase gerak) pada tekanan tinggi melalui kolom
yang nantinya akan diteruskan ke rekorder lalu di buat ke dalam bentuk grafik.
3. Pada HPLC terdapat dua fasa yaitu :
a) Fase gerak : metanol dan aquadest ( zat cair )
b) Fase diam : silika gel ( zat padat )

IX. Daftar Pustaka

1) Jobsheet “Penuntun Pratikum Kimia Analitik Instrumen” Tahun 2015. Politeknik

Negeri Sriwijaya Palembang
2) www.scribd.com/kromatografi-cair-kinerja-tinggi
3) www.academia.edu/high-performance-liquid-cromatograph
GAMBAR ALAT

SATU SET ALAT HPLC