II.

Teori Dasar

Kromatografi merupakan teknik analisis dengan solut atau zat-zat

terlarut terpisah oleh perbedaan kecepatan elusi, karena zat-zat ini melewati
kolom kromatografi. Pemisahan solute-solut diatur oleh distribusi solute dalam
fase gerak dan fase diam. Saat ini, KCKT merupakan teknik pemisahan yang
diterima secara luas untuk analasis dan pemurnian senyawa tertentu dalam
suatu sampel pada sejumlah bidang. KCKT merupakan metode yang tidak
dekstruktif dan dapat digunakan dengan baik untuk analisis kualitatif maupun
kuantitatif serta memiliki kecepatan analisis dan kepekaan yang tinggi
(Gandjar, 2007).
Komponen-komponen atau instrumentasi dari HPLC ialah sebagai
berikut:

1. Fasa gerak dan fase diam

Zat cair yang akan digunakan sebagai fasa gerak HPLC harus
memenuhi beberapa persyaratan berikut:

a. Zat cair harus bertindak sebagai pelarut yang baik untuk cuplikan yang
akandianalisis.
b. Zat cair harus murni sekali untuk menghindarkan masuknya kotoran yang
dapat mengganggu interpretasi kromatogram.
c. Zat cair harus jernih sekali untuk menghindarkan penyumbata pada
kolom.Biasanya pelarut disaring dengan saringan nilon berukuran diameter
0,45µm. Pompa vakum biasanya digunakan untuk menyaring partikel
kotoran sekaligus menghilangkan gas dari pelarut karena gas dapat
mengganggu base line.
d. Zat cair harus mudah diperoleh, murah, tidak mudah terbakar dan
tidak beracun.
 e. Zat cair tidak kental. Umumnya keketalan tidak melebihi 0,5 cP
(centiPoise).
f. Sesuai dengan detektor.

C18 silika berpori yand dimodifikasi (USP kode L1) adalah fase diam yang
paling umum dalam analisis HPLC. Lebih dari 400 kolom C18 yang berbeda di
pasaran dan ini tidak termasuk dengan berbagai dimensi kolom. Fase diam
ini dapat bervariasi dalam sifat fisik mereka, seperti ukuran partikel dan
distribusi, ukuran pori dan distribusi, sebagian atau seluruh matriks berpori dan
dalam modifikasi kimia permukaan.

Salah satu fitur semua kolom C18 memiliki kesamaan adalah bahwa
permukaannya dimodifikasi dengan C18H37 rantai alkana linear ini adalah tempat
kesamaan akhir. Kolom C18 berbeda dalam kepadatan ikatan, bentuk lampiran,
jumlah dan sifat akhir-capping (End-Capping) dan pengenalan kimia khusus
(Hendayana, 1994).

Gambar 1. Komponen HPLC

2. Pompa (pump)

Fase gerak dalam KCKT adalah suatu cairan yang bergerak melalui
kolom. Ada dua tipe pompa yang digunakan, yaitu tekanan konstan dan
pemindahan konstan. Pemindahan konstan dapat dibagi menjadi dua, yaitu:
pompa reciprocating dan pompa syringe. Pompa reciprocating menghasilkan
suatu aliran yang berdenyut teratur, oleh karena itu membutuhkan peredam
pulsa atau peredam elektronik untuk menghasilkan garis dasar (base line)
detector yang stabil, bila detector sensitive terhadap alirn. Keuntungan
utamanya ialah ukuran reservoir tidak terbatas. Pompa syringe memberikan
aliran yang tidak berdenyut, tetapi reservoirnya terbatas.
Pompa dalam HPLC berfungsi untuk mengalirkan fasa gerak cair
malalui kolom yang berisi serbuk halus. Pompa yang dapat digunakan dalam
HPLCharus memenuhi persyaratan :
a. Menghasilkan tekanan sampai 600psi.
b. Keluaran bebas pulsa
c. Kecepatan alir berkisar antara 0,1-10 mL/menit.
d. Bahan tahan korosi.

3. Injector
Sampel yang akan dimasukkan ke bagian ujung kolom, harus dengan
disturbansi yang minimum dari material kolom. Ada dua model umum yaitu
stopped flow dan solvent flowing. Ada tiga tipe dasar injector yang dapat
digunakan:
a. Stop-Flow
Aliran dihentikan, injeksi dilakukan pada kinerja atmosfer, sistem tertutup,
dan aliran dilanjutkan lagi. Teknik ini bisa digunakan karena difusi di dalam
cairan kecil resolusi tidak dipengaruhi.
b. Septum
Injector ini dapat diunakan pada kinerja sampai 60-70 atmosfer, tetapi tidak
tahan dengan semua pelarut-pelarut kromatografi cair. Partikel kecil dari
septum yang terkoyak dapat menyebabkan penyumbatan.
c. Loop Valve
 Umumnya digunakan untuk menginjeksi volume lebih besar dari 10 𝜇𝐿 dan
dilakukan dengan cara automatis. Pada posisi load sampel diisi kedalam
loop pada kinerja atmosfer, bila valve difungsikan maka sampel akan masuk
ke dalam kolom.

4. Kolom

Merupakan jantung kromatografi. Berhasil atau gagalnya suatu analisis

tergantung pada pemilihan kolom dan kondisi percobaan yang sesuai. Kolom
dapat dibag menjadi dua kelompok:

a. Kolom analitik: diameter dalam 2-6 mm, panjang kolom tergantung pada
jenis material, pengisi kolom. Untuk kemasan pellicular, panjang yang
digunakan adalah 50-100cm.
b. Kolom preparative: umumnya memiliki diameter 6mm atau lebih besar dan
panjang kolom 25-100 cm.

5. Detektor

Dibutuhkan untuk mendeteksi adana komponen sampel di dalam kolom

dan menghitung kadarnya. Detector yang baik memiliki sensitivitas yang
tinggi, gangguan yang rendah, kisar respon linier yang luas dan memberi respon
untuk semua tipe senawa. Suatu kepekaan yang rendah terhadap aliran dan
fluktuasi temperature sangat diinginkan tetapi tidak selalu dapat diperoleh.
Detektor yang umum digunakan adalah detector UV 254nm. Variabel panjang
gelombang dapat digunakan untuk mendeteksi banyak senyawa dengan range
yang lebih luas. Berbagai detektor untuk HPLC telah tersedia, walaupun
demikiandetektor harus memenuhi persyaratan berikut:

a. Cukup sensitif
b. Stabilitas dan ketrulangan tinggi
 c. Respon linear terhadap solute
d. Waktu respon pendek sehingga tidak bergantung alir
e. Reliabilitas tinggi dan mudah digunakan
f. Tidak merusak cuplikan.

6. Rekorder
Untuk mencetak hasil percobaan pada lembaran kertas berupa
kumpulanpuncak (kromatogram).Komponen yang terelusi mengalir ke detektor
dan dicatat sebagai puncak-puncak yang secara keseluruhan disebut sebagai kromatogram
(Hendayana, 2006).

 Kelebihan dari HPLC:

1. Kerja lebih mudah dengan automatisasi dalam prosedur analisis dan
pengolahan data
2. Volume sampel kecil
3. Daya pisah tinggi
4. Merupakan metode analitis:
a) Cepat
b) Peka
c) Akurat
d) Tepat
 e) Reproducible
f) Juga Preparatif
5. Dapat digunakan untuk analisis sampel organic dan anorganik, bersifat volatile
dan non-volatil, stabil dan tidak stabil secara thermal.
6. Pilihan fasa diam dan fasa geraknya luas
7. Dapat dilakukan pada suhu kamar.
8. Kolom dan pelarut pengembang dapat digunakan berkali-kali
9. Detector HPLC dapat divariasi dan banyak jenisnya
10. Waktu analisis pada umumnya singkat
11. Ketepatan dan ketelitiannya yang relatif tinggi
12. Mudah dioperasikan secara otomatis

 Kekurangan dari alat HPLC:

1. Larutan harus dicari fase diamnya terlebih dahulu
2. Hanya bisa digunakan untuk asam organic
3. Harus mengetahui kombinasi yang optimum antara pelarut, analit, dan gradient
elusi
4. Harganya mahal sehingga penggunaannya dalam lingkup penelitian yang
terbatas (Ahmad, 1991).

Tablet Asetaminofen atau tablet paracetamol adalah sediaan asetaminofen

yang dikempa menggunakan bahan tambahan yang sesuai, mengandung
asetaminofen, C8H9N02 tidak kurang dari 90,0 % dan tidak Iebih dari 110,0 % dari
jumlah yang tertera pada etiket. Penetapan kadar asetaminofen dengan dengan
metoda Kromatografi Cair Kinerja Tings (KCKT) (Anonim, 1995).

Asetaminofen atau paracetamol merupakan metabolit fenasetin dengan efek

antipiretik. Efek analgesik asetaminofen serupa dengan salisilat yaitu
menghilangkan atau mengurangi nyeri ringan sampai sedang. Asetaminofen
menurunkan suhu tubuh dengan mekanisme yang diduga juga berdasarkan efek
sentral seperti salisilat. Efek anti inflamasinya sangat lemah, oleh karena itu
asetaminofen tidak digunakan sebagai antirematik (Fêddy, 1995 ; Sartono 1991, dan
Schumarck dkk., 1994 ).

Paracetamol mengurangi rasa sakit dengan cara menurunkan produksi zat

dalam tubuh yang disebut prostaglandin. Prostaglandin adalah unsur yang dilepaskan
tubuh sebagai reaksi terhadap kerusakan jaringan atau infeksi, yang memicu
terjadinya peradangan, demam, dan rasa nyeri. Paracetamol menghalangi produksi
prostaglandin, sehingga rasa sakit dan demam berkurang. parasetamol tak memiliki
sifat antiradang. Jadi parasetamol tidak tergolong dalam obat jenis obat anti-inflamasi
nonsteroid (OAINS). Dalam dosis normal, parasetamol tidak menyakiti permukaan
dalam perut atau mengganggu gumpalan darah, ginjal atau duktus
arteriosus pada janin. Mekanisme aksi utama dari parasetamol adalah hambatan
terhadap enzim siklooksigenase (COX, cyclooxygenase), dan penelitian terbaru
menunjukkan bahwa obat ini lebih selektif menghambat COX-2. Meskipun
mempunyai aktivitas antipiretik dan analgesik, tetapi aktivitas antiinflamasinya
sangat lemah karena dibatasi beberapa faktor, salah satunya adalah tingginya
kadar peroksida dapat lokasi inflamasi. Hal lain, karena selektivitas hambatannya
pada COX-2, sehingga obat ini tidak menghambat aktivitas tromboksan yang
merupakan zat pembekuan darah (Bagian Farmakologi FK UI, 1995).
IV. Alat dan Bahan

Alat: Bahan :
1. Batang pengaduk 1. Aquadestilata
2. Erlenmeyer 2. Bahan pembanding paracetamol
3. Filler 3. Methanol pro HPLC
4. Gelas kimia 4. Tablet paracetamol
5. Gelas ukur
6. HPLC Agillent
7. Injector HPLC
8. Kertas perkamen
9. Kolom HPLC
10. Labu takar 10 mL
11. Labu takar 25 mL
12. Labu takar 100 mL
13. Membran filter PTFE ukuran
0,45 µm
14. Pipet tetes
15. Pipet volume
16. Spatel
17. Shake 3D
18. Timbangan analitik
19. Vial

DAPUS TAMBAHAN
Anonim, 1995, Fcvmakope Indonesia, Edisi IV, Departemen Kesehatan Republik
Indonesia Jakarta, hal. 650-651; 1009-1011
Freddy W.P., 1995, Analgesik - Antipiretik, Analgesik Anti -lnflamasi Nousteroid
dan obat Pirai, dalam Farmakologi dan Terapi, edisi IV, Jakarta, UI Press,
Hal. 207 – 215

Hendayana, Sumar. 1994. Kimia Analitik Instrumen. Semarang: Semarang Press ,