EVITA PUTRI PERMATASARI

160332605874

0FFERING H

“TUGAS PRAKTIKUM BIOKIMIA”

RANGKUMAN DASAR-DASAR BEKERJA SECARA ASEPTIK DAN PEMBUATAN

MEDIA PERTUMBUHAN MIKROBA

 Pengenalan Alat
Cawan petri adalah alat yang terbuat dari gelas dan berfungsi sebagai tempat
pembiakan mikroorganisme. Media pertumbuhan dapat dituang ke cawan bagian bawah dan
cawan bagian atas sebagai penutup. Cawan petri tersedia dalam berbagai ukuran yaitu
berdiameter 5cm, 8 cm, 9 cm, atau 15 cm. Cawan berdiameter 15 cm dapat menampung
media sebanyak 15-20 ml, sedangkan cawan berdiameer 9 cm hanya cukup diisi media
sebanyak 10 ml. Terdapat dua jenis cawan petri yaitu cawan tidak berventilasi (yang umum
dipakai) dan berventilasi. Cawan yang berventilasi digunakan untuk pembiakan anaerob.
Sedangkan untuk standarisasi gunakan cawan berukuran 15 mm kali 100 mm, dipilih cawan
yang bebas gelembung dan goresan sehingga distribusi agar merata (Khasani 1990).
Didalam mikrobiologi, tabung reaksi digunakan sebagai tempat media
pertumbuhan atau penampungan cairan lainnya seperti pelarut dalam pengenceran. Tabung
reaksi dipilih karena bentuknya yang vertikal (bandingkan dengan cawan petri) sehingga
mempermudah penanganan dan menghemat tempat penyimpanan. Tabung reaksi dapat diisi
media padat maupun cair. Media padat yang dimasukkan ke tabung reaksi dapat diatur
menjadi 2 bentuk menurut fungsinya, yaitu media agar tegak (deep tube agar) dan agar
miring (slants agar). Untuk membuat media miring, perlu diperhatikan tentang kemiringan
media yaitu luas permukaan yang kontak dengan udara tidak terlalu sempit atau tidak terlalu
lebar dan hindari jarak media yang terlalu dekat dengan mulut tabung karena memperbesar
resiko kontaminasi. Tutup tabung reaksi dapat berupa kapas, tutup metal, tutup plastik atau
alumunium foil. Tutup tabung yang paling baik dan aman digunakan adalah tutup plastik
plypropylene berulir karena akan mencegah timbulnya aerosol (Dwidjosaputro 2004).
Oven berfungsi sebagai alat sterilisasi dengan prinsip panas kering. Umumnya
alat-alat yang di sterilisasi dengan oven adalah alat gelas seperti cawan atau pipet ukur.
Selain oven alat sterilisasi lainnya adalah autoklaf. Autoklaf adalah alat yang digunakan
untuk sterilisasi autoklaf termasuk dalam tekniksterilisasi secara fisika dengan prinsip arus
uap dan tekanan, karena uap mempunyai data tembus yang lebih besar dan mengakibatkan
pengumpulan pada protoplasma sel-sel yang disterilisasikan. Autoklaf yang ada di
laboratorium terbagi menjadi dua yaitu yang digunakan untuk sterilisasi alat dan medium
yang akan dipakai, serta yang digunakan untuk destruksi atau sterilisasi kotor (Ratu 2005).

 Kerja Secara Aseptik

Salah satu teknik dasar dalam analisa mikrobiologi adalah teknik transfer aseptis
(suatu metode atau teknik di dalam memindahkan atau mentransfer kultur bakteria dari satu
tempat ke tempat lain secara aseptis agar tidak terjadi kontaminasi oleh mikroba lain ke
dalam kultur). Tehnik aseptis atau steril adalah suatu sistem cara bekerja (praktek) yang
menjaga sterilitas ketika menangani pengkulturan mikroorganisme untuk mencegah
kontaminasi terhadap kultur mikroorganisme yang diinginkan. Teknik ini sangat esensial dan
kunci keberhasilan prosedur mikrobial yang harus diketahui oleh seorang yang hendak
melakukan analisis mikrobiologi. Pengambilan sampel harus dilakukan secara statistik agar
tidak bias, jadi secara acak (random sampling). Selain itu, digunakan teknik aseptis selama
pengambilan sampel agar tidak terjadi pencemaran. Alat-alat yang digunakan harus steril.
Bahan makanan cair diambil dengan pipet steril, makanan padat menggunakan pisau, garpu,
sendok atau penjepit yang steril (John 1990).
Teknik transfer aseptis adalah suatu metode atau teknik di dalam memindahkan
atau mentransfer kultur bakteria dari satu tempat ke tempat lain secara aseptis agar tidak
terjadi kontaminasi oleh mikroba lain ke dalam kultur. Teknik transfer aseptis ini sangat
esensial dan kunci keberhasilan prosedur mikrobial yang harus diketahui oleh seorang yang
hendak melakukan analisis mikrobiologi. Teknik aseptis sangat penting dalam pengerjaan
mikrobiologi yang memerlukan ketelitian dan keakuratan disamping kesterilan yang harus
selalu dijaga agar terbebas dari kontaminan yang dapat mencemari. Populasi mikroba di alam
sekitar kita sangat besar dan komplek. Beratus-ratus spesies berbagai mikroba biasanya
menghuni bermacam-macam bagian tubuh kita, termasuk mulut, saluran pencernaan, dan
kulit. Sekali bersin terdapat beribu-ribu mikroorganisme sehingga diperlukan teknik yang
dapat meminimalisirnya seperti pengisolasian (Rachmawati 2008)
Aseptik sangat diperlukan untuk menghindarkan mikroorganisme dari
kontaminan yang dapat menghambat pertumbuhan mikroba. Teknik aseptis digunakan
sepanjang kegiatan berlangsung baik alat, bahan, lingkungan sekitar maupun praktikannya,
untuk alat dan bahan praktikum dapat diterapkan metode sterilitas. Penguasaan teknik aseptic
ini sangat diperlukan dalam keberhasilan laboratorium mikrobiologi dan hal tersebut
merupakan salah satu metode permulaan yang dipelajari oleh ahli mikrobiologi (Oram 2001).
Ada beberapa aturan umum yang harus diperhatikan dalam tehnik aseptis, yaitu:
a. Meja kerja sebaiknya jauh dari sesuatu yang dapat menciptakan aliran udara, misalnya
tidak ada jendela yang terbuka, tidak dekat dengan pintu yang selalu dibuka-tutup dan
jauh dari lalu-lintas orang.
b. Pastikan meja kerja bersih dari kotoran dan benda-benda yang tidak akan digunakan.
Kotoran seringkali sulit dibersihkan pada sudut-sudut ruang.
c. Usap meja kerja dengan antiseptik atau senyawa pembersih lain sebelum digunakan. Di
sebagian besar laboratorium umumnya menggunakan etanol 70% untuk
membersihkannya. Sediakan etanol pada posisi selalu dekat dengan meja. Jika telah
selesai bekerja, sebaiknya meja kerja dikosongkan dari peralatan dan bersihkan lagi.
d. Semua peralatan yang digunakan harus steril. Sebaiknya semua peralatan yang telah
disterilisasi diberi label. Jika menemukan alat yang sepertinya telah disterilisai tapi masih
ragu terhadap sterilitasnya maka sebaiknya jangan digunakan. Bungkus peralatan baik
alat steril sekali pakai atau bukan.
e. Atur peralatan di meja kerja sedemikian rupa sehingga meminimalisir pergerakan tangan.
Alat-alat yang biasanya digunakan dengan tangan kanan (jarum inokulum, filler, pipet
dll.) letakkan disebelah kanan begitu juga sebaliknya (rak tabung, cawan petri,
erlenmeyer dll.) terkecuali untuk tangan kidal. Di bagian tengah meja kerja disediakan
ruang lapang untuk bekerja.
f. Membakar mulut atau bagian tepi dari suatu alat dapat membunuh mikroorganisme yang
menempel.
g. Telah siap dengan segala peralatan dan bahan yang dibutuhkan. Semua bahan dan alat
untuk prosedur tertentu telah dipersiapkan di meja kerja. Jangan sampai meninggalkan
meja kerja untuk mengambil sesuatu yang terlupa atau tertinggal. Perhitungkan semua
yang diperlukan beserta cadangannya.
h. Pakai sarung tangan dan masker. Sarung tangan membantu melindungi dari tumpahan
biakan atau bahan kimia berbahaya. Tidak menggunakan sarung tangan dirasa tidak
bermasalah jika materi dan bakteri yang diteliti dipastikan tidak berbahaya. Masker
untuk meminimalisir kontaminasi oleh mulut kita saat berbicara.
i. Cuci tangan sebelum dan sesudah bekerja. Cuci tangan dengan desinfektan atau sabun
bila tidak ada desinfektan. Cuci tangan dapat membilas mikroorganisme yang ada di
tangan (Pradhika 2009).
  Sterilisasi
Cara kerja sterilisasi adalah cara kerja agar terhindar dari kontaminasi, cara
kerja steril ini digunakan pada pembuatan media, pemeriksaan kultur dan pembuatan
preparat. Sterilisasi dapat dilakukan secara :
1. Fisik di bagi menjadi beberapa bagian antara lain :
a. Dengan ”Hot air Sterilization” oven. Bahan dari gelas dibungkus dengan
alumunium foil, suhu 170-250°C selama 2 jam.
b. Panas basah dengan tekanan, suhu 121°C selama 15 menit. Alat yang
digunakan adalah autoclave, caranya: alat-alat gelas dibungkus lagi dengan
alumunium foil.
c. Pressure Cooker, caranya: panaskan air mendidih, biarkan klep uap terbuka
agar keluar uap kemudian klep uap ditutup, lihat suhu dan tekanan, bila suhu
telah 121°C dengan tekanan 1,5 atm, dijaga konstan selama 15 menit.
Kemudian buka klep uap hingga tercapai tekanan nol, dan setelah suhu
mencapai suhu kamar, alat dan bahan dikeluarkan.
2. Kimia yaitu dengan menggunakan zat-zat kimia seperti desinfektan, antiseptik.
3. Radiasi yaitu dengan menggunakan sinar Ultraviolet, biasanya digunakan pada
ruangan dan alat-alat plastik.
4. Filter yaitu dengan menggunakan membran filter dan Vacum Pump (Arie 2007).
Sterilisasi merupakan metode praktis yang dirancang untuk membersihkan dari
mikroorganisme, atau sengaja untuk menghambat pertumbuhannya, yang nyata dari
kepentingan dasar di banyak keadaan. Jenis dari mikroorganisme sangat berbeda dalam
kelemahannya terdapat berbagai macam agen antimikroba, dan lebih banyak lagi, efek yang
praktis dari agen ini pada adanya keadaan nyatayang sangat besar dipengaruhi oleh keadaan
sekitar. Banyak yang akan bertahan, contohnya, pada cuaca tertentu organisme memiliki
kulit, pada beberapa tubuh zat cair atau pada udara, Air, makanan, kotoran, atau ruangan
berdebu. Caranya harus dirubah, oleh karena itu, dengan masalah nyata. Hal ini tidak
mungkin, bagaimanapun pada garis besarnya tentunya prinsip dasar digaris bawahi pada
umumnya digunakan cara untuk memusnahkan dan mengontrol kehidupan mikroba (Chan et
al 1992).
Ada tiga cara yang umum dipakai dalam sterilisasi yaitu penggunaan panas,
bahan kimia, dan penyaringan (filtrasi). Bila panas digunakan bersama-sama dengan uap air
maka disebut sterilisasi panas lembab atau sterilisasi basah, bila tanpa kelembaban maka
disebut sterilisasi panas kering. Dipihak lain sterilisasi kimiawi dapat dilakukan dengan
menggunakan gas atau radiasi. Pemilihan metode didasarkan pada sifat bahan yang akan
disterilkan. Metode sterilisasi yang umum digunakan secara rutin di laboratorium
mikrobologi adalah yang menggunakan panas. Sterilisasi panas kering dapat diterapkan pada
apa saja yang tidak merusak, menyala, hangus, dan menguap pada suhu setinggi itu. Bahan-
bahan yang biasa disterilkan dengan cara ini seperti pipet, tabung reaksi, cawan, botol
sampel, dan bahan-bahan yang tidak tembus uap seperti gliserin, minyak, vaselin, dan bahan-
bahan berupa bubuk. Bahan-bahan yang disterilkan harus dilindungi dengan cara
membungkus, menyumbat atau menaruhnya dalam suatu wadah tertutup untuk mencegah
kontaminasi (Curtis et al 1999).
Sterilisasi basah biasanya dilakukan di dalam autoklaf atau sterilisator uap yang
mudah diangkat (portable) dengan mengguanakn uap air jenuh bertekanan pada suhu 121oC
selama 15 menit. Karena titik air menjadi 121oC itu disebabkan oleh tekanan 1 atmosfer pada
ketinggian permukaan laut, maka daur sterilisasi tersebut seringkali juga dinyatakan sebagai :
1 atm 15 menit. Pada tempat-tempat yang lebih tingginya diperluka tekanan lebih besar untuk
mencapai suhu 121oC. ada beberapa hal yang perlu diperhatikan dalam melakukan sterilisasi
basah yaitu:
a. Sterilisasi bergantung pada uap, karena itu udara harus dikosongkan terlebih dahulu
b. Semua bagian bahan yang disterilkan harus terkena uap
c. Bahan-bahan yang berpori atau berbentuk cair harus permeable terhadap uap
d. Suhu yang sebagaimana yang terukur oleh thermometer harus 121oC sampai 15 menit
(Sriwulandari 2005)

 Media pertumbuhan mikroba

Media adalah suatu bahan yang terdiri dari campuran zat-zat hara (nutrient)
yang berguna untuk membiakkan mikroba. Dengan mempergunakan bermacam-macam
media dapat dilakukan isolasi, perbanyakan, pengujian sifat-sifat fisiologis dan perhitungan
jumlah mikroba (Sutedjo,1996).
Supaya mikroba dapat tumbuh baik dalam suatu media, maka medium tersebut harus
memenuhi syarat-syarat antara lain :
- Harus mengandung semua zat hara yang mudah digunakan oleh mikroba

- Harus mempunyai tekanan osmosa, tegangan permukaan dan pH yang sesuai dengan
kebutuhan mikroba yang ditumbuhkan

- Harus mengandung zat-zat yang dapat menghambat pertumbuhan mikroba

 - Harus berada dalam keadaan steril sebelum digunakan, agar mikroba yang diinginkan
dapat tumbuh baik (Sutedjo,1996).

 Macam-macam media
Media dapat digolongkan berdasarkan atas susunan kimianya, sifat wujudnya
dan fungsinya.
a. Penggolongan media berdasarkan susunan kimia :

- Media anorganik. Yaitu media yang tersusun dari bahan-bahan anorganik

- Media organik. Yaitu media yang tersusun dari bahan-bahan organik

- Media sintetik (media buatan). Yaitu media yang susunan kimianya diketahui dengan
pasti. Media ini umumnya digunakan untuk mempelajari kebutuhan makanan suatu
mikroba

- Media non sintetik. Yaitu media yang susunan kimianya tidak dapat ditentukan
dengan pasti. Media ini umumnya digunakan untuk menumbuhkan dan mempelajari
taksonomi mikroba (Sutedjo,1996).

b. Penggolongan media berdasarkan sifat wujudnya

- Media cair yaitu media yang berbentuk cair

- Media padat. Yaitu media yang berbentuk padat. Media ini dapat berupa bahan
organik alamiah, misalnya yang dibuat dari kentang, wortel, dan lain-lain, atau dapat
juga berupa bahan anorganik misalnya silica gel
- Media padat yang dapat dicairkan, (semi solid), yaitu yang apabila dalam keadaan
panas berbentuk cair, sedangkan dalam keadaan dingin berbentuk padat, misalnya
media agar (Sutedjo,1996).
c. Penggolongan media berdasarkan fungsinya

- Media diperkaya. Yaitu media yang ditambahi zat-zat tertentu misalnya serum darah
ekstrak tanaman dan lain sebagainya, sehinggan dapat digunakan untuk
menumbuhkan mikroba yang bersifat heterotrof.

- Media selektif. Yaitu media yang ditambahi zat kimia tertentu untuk mencegah
pertumbuhan mikroba lain (bersifat selektif). Misalnya media yang mengandung
Kristal violet pada kadar tertentu dapat mencegah pertumbuhan bakteri gram positif
tanpa mempengaruhi pertumbuhan bakteri gram negative.
 - Media diferensial. Yaitu media yang ditambahi zat kimia (bahan) tertentu yang
menyebabkan suatu mikroba membentuk pertumbuhan atau mengadakan perubahan
tertentu sehingga dapat dibedakan tipe-tipenya. Misalnya media daerah agar dapat
digunakan untuk membedakan bakteri homolitik (pemecah darah) dan bakteri non
hemolitik.

- Media penguji. Yaitu media dengan susunan tertentu yang digunakan untuk pengujian
vitamin. Vitamin asam-asam amino, antibiotika dan lain sebagainya.

- Media untuk perhitungan jumlah mikroba. Yaitu media spesifik yang digunakan
untuk menghitung jumlah mikroba dalam suatu bahan.

- Media khusus. Yaitu media untuk menentukan tipe pertumbuhan mikroba dan
kemampuannya untuk mengadakan perubahan-perubahan kimia tertentu
(Sutedjo,1996).

 Media biak dan persyaratan bagi pertumbuhan.

 Media biak

i. Media biak kompleks

Untuk banyak mikroorganisme bertuntutan tinggi belum dikenal benar bahan-bahan

makanan yang diperlukan. Orang membiakkannya dalam larutan biak yang mengandung
ekstrak ragi, otolisat ragi, pepton, atau ekstak daging. Untuk beberapa kelompok organisme
lazim juga digunakan : rempah-rempah, dekok rumput kering, sari buah prem, sari buah
wortel, santan dan untuk cendawan kupofil juga sari perasan tahi kuda. Mengingat biaya,
larutan-larutan baik tidak dibentuk dari senyawa-senyawa murni tetapi lebih disukai untuk
menggunakan zat-zat kompleks, seperti air didih, melaso, air rendaman jagung atau ekstrak
kedelei, yang sebagai produk sisa tersedia dengan harga murah. Media bak seperti ini disebut
media bak kompleks. (Schlegel, 1994).

ii. Media biak padat

Untuk membuat bak padat pada larutan bak cair di tambahkan bahan pemadat yang
member konsistensi seperti selai pada larutan air. Hanya untuk keperluan tertentu masih
digunakan gelatin, karena sudah mencair pada suhu 26-30 oC dan banyak mikroorganisme
mampu mencairkan gelatin.
  Persyaratan bagi pertumbuhan

a. Kadar ion hydrogen. Diantara semua ion, ion H+ dan OH- adalah ion-ion yang paling
mobililitas; oleh sebab itu perubahan kadar yang kecil saja sudah menimbulkan pengaruh
yang besar. (Schlagel, 1994).

b. Karbon dioksida, larutan bak yang diperlukan untuk pertumbuhan mikroorganisme yang
ototrof yang memfikasi CO2 biasanya ditambahi Na- bikarbonat dan diinkubasi dibawah
atmosfir yang mengandung CO2 dalam wadah tertutup (Schlagel, 1994).

c. Kadar air dan tekanan osmotik. Mikroorganisme menunjukkan perbedaan yang luas dari
segi tuntutan keperluan akan kadar air (Schlagel, 1994).

d. Suhu. Memilih tuntutan mengenai suhu inkubasi miroorganisme berbeda-beda prilakunya.

e. Aerasi untuk semua mikroorganisme aerob obligat, oksigen merupakan akseptor electron
yang sangat penting. Biak anaerob. Untuk menumbuhkan jenis bakteri yang anaerob kuat
penyingkiran O2 udara merupakan persyaratan yang amat perlu (Schlegel, 1994)

 Zat hara yang ditambahkan ke dalam media.

Pada umumnya bakteri tidak dapat langsung menggunakan N2 bebas dari udara,
sehingga keperluannya diberikan dalam bentuk garam. Nitrogen diperlukan sebagai bahan
dasar untuk protein, asam nukleat dan vitamin.
Dalam media bahan yang mengandung N ini berupa :
- NH4Cl –N inorganik
- NaNO3
- Pepton –N organik

a. Karbon :
Sebagai sumber karbon digunakan bernagai gula, pati, glikogen. Gula yang dipakai
berupa 5C,6C, atau disakarida (laktosa, sukrosa, dan maltose). Untuk dapat menggunakan
sumber karbon ini bakteri dapat menguraikannua menjadi molekul yang lebih kecil yang
kemudian digunakan untuk bahan dasar protein, polisakarida, lipida dan asam nukleat.
b. Vitamin dan Faktor pertumbuhan :
Berbagai vitamin yang diperlukan bakteri adalah thiamine, riboflavin, asam nikotinat,
asam pantotenas biotin. Vitamin ini berfungsi sebagai koenzim atau bagian lain dari bahan
dasar sel (Hastowo,1992).
  Metoda Uji Aktivitas Anti-Mikroba
Uji aktivitas anti-mikroba ini diukur respons pertumbuhan populasi mikroorganisme terhadap
agen antimikroba. Tujuan assay antimikroba (termasuk antibiotik dan substansi antimikroba
non-antibiotik, misalnya fenol, bisfenol, aldehid), adalah untuk menentukan potensi dan
kontrol kualitas selama proses produksi senyawa antimikroba dipabrik, untuk farmakokinetik
obat pada hewan atau manusia dan untuk memonetor dan mengontrol kemoterapi obat.
Kegunaan uji antimikroba adalah diperolehnya suatu sistem pengobatan yang efektif dan
efesien. (Krisno, 2011)
1. Metoda Dilusi
Cara ini digunakan untuk menentukan kadar hambat minimum (KHM) dan kadar bunuh
minimum (KBM) dari antimikroba. Prinsip dari metoda dilusi ini adalah membuat seri
pengenceran agen antimikroba pada medium cair yang ditambahkan dengan mikroba uji.
Larutan uji agen antimikroba pada kadar terkecil yang terlihat jernih tanpa adanya
pertumbuhan mikroba uji ditetapkan sebagai KHM tersebut selanjutnya dikultur ulang pada
media cair tanpa penambahan mikroba uji ataupun agen antimikroba, dan diunkubasi selama
18-24 jam. Media cair yang tetap terlihat jernih setelah inkubasi ditetapkan sebagai KBM.
2. Metode Difusi
a. Metode disc diffusion (tes Kirby dan Bauer) untuk menentukan aktivitas agen antimikroba.
Piringan yang berisi agen antimikroba diletakkan pada media agar yang telah ditanami
mikroorganisme yang akan berdifusi pada media agar tersebut. Area jernih mengindikasikan
adanya hambatan pertumbuhan mikroorganisme oleh agen antimikroba permukaan media
agar.

b. Metode E-test digunakan untuk mengestimasi MIC (minimum inhibitory concentration)

atau KHM (kadar hambat minimum), yaitu konsentrasi minimal suatu agen antimikroba
untuk dapat menghabat pertumbuhan mikroorganisme. Pada metode ini digunakan strip
plastik yang mengandung agen antimikroba dari kadar terendah hingga tertinggi dan
diletakkan permukaan media agar yang telah ditanami mikroorganisme. Pengamatan
dilakukan pada area jernih yang ditimbulkannya yang menunjukkan kadar agen antimikroba
yang menghambat pertumbuhan mikroorganisme pada media agar.

c. Ditch-plate technique. Pada metode ini sampel uji berupa agen antimikroba yang
diletakkan pada parit yang dibuat dengan cara memotong media agar dalam cawan petri pada
bagian tengah secara membujur dan mikroba uji ( maksimum 6 macam ) digoreskan kearah
parit yang berisi agen antimikroba.
d. Cup-plate technique. Metode ini serupa dengan mitode disc diffusion, dimana dibuat
sumur pada media agar yang telah ditanami dengan mikroorganisme dan pada sumur tersebut
diberi agen antimikroba yang akan diuji.
e. Gradient-plate technique. Pada metode ini konsentrasi agen antimikroba pada media agar
secara teoretis bervariasi dari 0 hingga maksimal. Media agar dicairkan dan larutan uji
ditambahkan. Campuran kemudian dituang kedalam cawan petri dan diletakkan dalam posisi
miring. Nutrisi kedua selanjutnya dihitung diatasnya.

 Cara Pembuatan Media Pertumbuhan Mikroba

Garis besar pembuatan media yang tersusun atas beberapa bahan adalah
sebagai berikut :
- Mencampur bahan-bahan : bahan-bahan yang dilarutkan dalam air suling. Kemudian
dipanaskan dalam pemanas air supaya larutannya homogen.

- Menyaring : beberapa jenis media kadang-kadang perlu disaring, dan sebagai

penyaringan dapat digunakan kertas saring, kapas atau kain. Untuk media agar atau
gelatin penyaringan harus dilakukan dalam keadaan panas.

- Menentukan dan mengatur pH : penentuan pH media dapat dilakukan dengan

menggunakan kertas pH, pH meter atau dengan komparator blok. Pengaturan pH
media dapat dilakukan dengan penambahan asam atau basa (organik atau anorganik).

- Memasukkan media ke dalam tempat tertentu : sebelum disterilkan, media

dimasukkan ke dalam tabung reaksi kemudian dibungkus kertas sampul (kertas
coklat) supaya tidak basah sewaktu disterilkan.

- Sterilisasi : pada umumnya sterilisasi media dilakukan dengan uap panas di dalam
autoclave, pada suhu 121◦ C selama 15-30 menit (Sutedjo,1996).

Supaya mikroba dapat tumbuh baik dalam suatu media, maka medium tersebut
harus memenuhi syarat-syarat, antara lain harus mengandung semua zat hara yang mudah
digunakan oleh mikroba, harus mempunyai tekanan osmosis, tegangan permukaan dan pH
yang sesuai dengan kebutuhan mikroba yang akan tumbuh, tidak mengandung zat-zat yang
dapat menghambat pertumbuhan mikroba, harus berada dalam keadaan steril sebelum
digunakan, agar mikroba yang ditumbuhkan dapat tumbuh dengan baik. Mikroorganisme
memanfaatkan nutrisi media berupa molekul-molekul kecil yang dirakit untuk menyusun
komponen sel. Dengan media pertumbuhan dapat dilakukan isolat mikroorganisme menjadi
kultur murni dan juga memanipulasi komposisi media pertumbuhannya (Sutedjo 1991).
Hal yang terpenting adalah medium harus mengandung nutrien yang merupakan
substansi dengan berat molekul rendah dan mudah larut dalam air. Nutrien ini adalah
degradasi dari nutrien dengan molekul yang kompleks. Nutrien dalam medium harus
memenuhi kebutuhan dasar makhluk hidup, yang meliputi air, karbon, energi, mineral dan
faktor tumbuh (Label 2008).
Untuk membuat biakan padat pada larutan biak cair ditambahkan bahan
pemadat yang memberi konsistensi seperti selai pada larutan air. Hanya untuk keperluan
tertentu masih digunakan gelatin, karena sudah mencair pada suhu 260-300˚C dan banyak
organisme mampu mencairkan gelatin. Bahan pemadat yang hampir ideal adalah agar. Agar
ditambahkan pada larutan air dengan kadar 15-20 gr/lt. Agar baru mencair pada suhu 1000˚C,
agar tersebut masih tetap baik kalau didinginkan sampai 450˚C. Agar hanya dipengaruhi oleh
sejumlah kecil bakteri (Schlegel 1994).