HALAMAN PERSETUJUAN

Proposal Penelitian

Validasi Metode Dan Analisis Asam Retinoat

Dengan Metode Spektrofotometri UV-Vis

Pada Krim Pemutih Wajah Yang Beredar

Di Kota Kendari

Diajukan oleh :

Nur Fauziah
F1F1 12 076

Telah Disetujui oleh :

Pembimbing I Pembimbing II

Irnawati, S.Si., M.Sc Muh. Handoyo Sahumena, S.Pd., M.Sc

NIP. 19830616 201212 2 001 NIP. -

Mengetahui,
Ketua Program Studi Farmasi,

Nur Illiyyin Akib, S.Si., M.Si., Apt.

NIP. 19810319 200801 2 006

1
 DAFTAR ISI

HALAMAN PERSETUJUAN.................................................................................i
DAFTAR ISI............................................................................................................ii
DAFTAR TABEL...................................................................................................iv
DAFTAR GAMBAR...............................................................................................v
DAFTAR LAMPIRAN...........................................................................................vi
BAB I.......................................................................................................................1
BAB I PENDAHULUAN........................................................................................1
A. Latar Belakang..........................................................................................1
B. Rumusan Masalah.....................................................................................4
C. Tujuan Penelitian.......................................................................................4
D. Manfaat Penelitian.....................................................................................4
BAB II TINJAUAN PUSTAKA..............................................................................6
A. Kosmetik...................................................................................................6
B. Krim..........................................................................................................7
1. Pengertian Krim.....................................................................................7
2. Krim Pemutih........................................................................................8
C. Asam Retinoat...........................................................................................9
D. Metode Analisis Asam Retinoat..............................................................13
E. Spektrofotometri......................................................................................15
F. Validasi Metode..........................................................................................17
1. Akurasi.................................................................................................18
2. Presisi...................................................................................................20
3. Spesifisitas...........................................................................................21
4. Linearitas.............................................................................................21
5. Batas Deteksi (LOD) dan Batas Kuantifikasi (LOQ)..........................22
G. Kerangka Konsep....................................................................................24
BAB III METODE PENELITIAN........................................................................25
A. Waktu dan Tempat Penelitian..................................................................25
B. Jenis Penelitian........................................................................................25
C. Bahan Penelitian......................................................................................25

2
 D. Alat Penelitian.........................................................................................25
E. Definisi Operasional................................................................................25
F. Prosedur Penelitian.....................................................................................26
1. Pengambilan Sampel Krim Pemutih....................................................26
2. Pembuatan Larutan Asam Retinoat 1000 µg/mL.............................26
3. Pembuatan Larutan Asam Retinoat 500 µg/mL..................................27
4. Penentuan Panjang Gelombang Maksimum Larutan Asam Retinoat27
5. Pembuatan Kurva Baku.......................................................................27
6. Analisis Kualitatif dan Kuantitatif.......................................................27
7. Validasi Metode...................................................................................28
G. Pengolahan Data......................................................................................30
1. Akurasi.................................................................................................30
2. Presisi...................................................................................................31
3. Spesifisitas...........................................................................................31
4. Linearitas.............................................................................................32
5. LOD dan LOQ.....................................................................................32
6. Penetapan Kadar Asam Retinoat Dalam Sampel.................................33
H. Jadwal Penelitian.....................................................................................33
DAFTAR PUSTAKA.............................................................................................34
LAMPIRAN...........................................................................................................37
Lampiran 1: Prosedur penelitian............................................................................37
Lampiran 2. Perhitungan Bahan............................................................................39

3
 DAFTAR TABEL

NO TEKS HALAMAN
.
1. Nilai Persen Recovery 19
2. Tingkat Ketelitian Berdasarkan % RSD 21
3. Jadwal Penelitian 33

4
 DAFTAR GAMBAR

N TEKS HALAMAN
O
.
1 Struktur Asam Retinoat 10
.
2 Instrumen spektrofotometri UV-Vis 16
.
3 Kerangka konsep penelitian 24
.

5
 DAFTAR LAMPIRAN

N HALAMAN
O
. TEKS
1 Prosedur Penelitian
37
.
2 Perhitungan Bahan
39
.

6
 BAB I

PENDAHULUAN

A. Latar Belakang

Kosmetik berasal dari kata Yunani “kosmetikos” yang berarti keahlian

dalam menghias (Djajadisastra, 2009). Kosmetik sudah menjadi keperluan sehari-

hari bagi sebagian besar manusia baik laki-laki maupun perempuan, mulai dari

bayi hingga lanjut usia bahkan hingga saat meninggalkan dunia ini. Berbagai

macam produk kosmetik beredar di pasaran ditujukan untuk keperluan yang

berbeda-beda (Tranggono dan Fatma, 2007). Seiring dengan perkembangan

zaman, kosmetik bukan hanya merupakan kebutuhan sekunder/pelengkap saja,

melainkan telah menjadi kebutuhan primer setiap orang terutama wanita

(Djajadisastra, 2009).

Sebagian besar wanita Indonesia menginginkan wajah yang putih, bersih

dan cerah untuk menjaga penampilan agar tetap menarik. Dilakukan berbagai cara

untuk memenuhi keinginan itu, mulai dari perawatan kulit alami hingga

perawatan yang instan. Salah satu cara yang dilakukan dengan menggunakan krim

pemutih. Krim pemutih merupakan suatu sediaan atau paduan bahan yang

berfungsi untuk mencerahkan atau merubah warna kulit sehingga kulit menjadi

lebih putih bersih dan bersinar (Djajadisastra, 2009).

Fenomena tersebut menimbulkan persaingan bisnis yang kompetitif dan

ketat antara perusahaan kosmetik untuk memproduksi kosmetik khususnya krim

pemutih wajah dengan berbagai macam variasi dan harga. Namun tidak sedikit

produsen kosmetik menambahkan bahan kimia berbahaya demi mendapatkan

1
keuntungan yang lebih banyak tanpa mempertimbangkan keamanan bagi

kesehatan konsumen. Bahan kimia yang sering ditambahkan dan telah dilarang

penggunaannya dalam kosmetik dan berbahaya jika digunakan dalam jangka

panjang yaitu merkuri, hidroquinon, zat warna rhodamin B dan asam retinoat

(Badan POM, 2007).

Asam retinoat merupakan turunan vitamin A dan telah banyak digunakan

sebagai bahan pemutih (Bandem, 2013). Asam retinoat (Retinoid Acid ) atau

tretinoin termasuk golongan obat keras yang dapat menyebabkan kulit kering, rasa

terbakar, dan teratogenik sehingga penggunaannya harus dengan resep dokter

(Badan POM, 2007). Adanya asam retinoat dalam darah pada kehamilan telah

dinyatakan berpotensi teratogen, tidak terkecuali untuk penggunaan asam retinoat

topikal di kulit yang dapat memungkinkan resiko terserapnya asam retinoat ke

dalam tubuh. Besarnya resiko tersebut sehingga asam retinoat dikontraindikasikan

selama kehamilan dan selama merencanakan kehamilan (Badan POM, 2011).

Hasil investigasi dan pengujian laboratorium Badan Pengawas Obat dan

Makanan Republik Indonesia (BPOM) di seluruh Indonesia sampai dengan bulan

Maret 2013 telah ditemukan 17 kosmetik yang mengandung bahan

berbahaya/dilarang dan telah beredar, salah satunya adalah kosmetik yang

mengandung asam retinoat (Badan POM, 2013). Rahayu dkk., (2014) menemukan

kandungan asam retinoat dalam krim pemutih yang dijual bebas di Purwokerto

dengan menggunakan metode KCKT (Kromatografi Cair Kinerja Tinggi) dengan

kadar 7,36±2,48 ppm, 7,08±0,53 ppm, 378,83±10,96 ppm, dan 474±10,01 ppm.

Krim pemutih yang mengandung asam retinoat juga ditemukan oleh Suhartini

2
dkk., (2013) yang beredar bebas di kota Manado dengan kadar berturut-turut

0.021%, 0.026% dan 0.016%.

Asam retinoat dapat dianalisis dengan berbagai macam metode analisis.

Metode analisis yang digunakan yaitu Kromatografi Lapis Tipis (Badan POM,

2011; Suhartini, dkk., 2013), Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (Badan POM,

2011; Rahayu, dkk., 2014) dan Spektrofotometri UV-Vis (Suhartini, dkk., 2013).

Spektrofotometri UV-Vis adalah salah satu metode yang paling sering digunakan

dalam analisis farmasi, karena sederhana, mudah, cepat dan merupakan metode

analisis yang ekonomis (Nijhu, dkk., 2011). Diperlukan validasi metode untuk

memastikan proses analisis yang dihasilkan dari metode spektrofotometri

menghasilkan data yang valid (Purwanto dan Farida, 2012).

Validasi metode merupakan elemen penting dari kontrol kualitas. Validasi

membantu memberikan jaminan bahwa pengukuran akan dapat dipercaya.

Menurut Eurochem, validasi adalah konfirmasi melalui pemeriksaan dan

penyediaan bukti objektif bahwa persyaratan tertentu untuk penggunaan yang

dimaksudkan tertentu terpenuhi. Parameter validasi metode analisis meliputi

akurasi, presisi, spesifisitas, batas deteksi (LOD) dan batas kuantifikasi (LOQ)

(Riyanto, 2014).

Berdasarkan uraian di atas, peneliti tertarik untuk melakukan validasi

metode dan analisis kandungan asam retinoat dengan metode spektrofotometri

UV-Vis pada krim pemutih wajah yang beredar di pasar Kota Kendari.

3
B. Rumusan Masalah

Berdasarkan latar belakang maka terdapat beberapa masalah yang dapat

dirumuskan sebagai berikut :

1. Bagaimana akurasi, presisi, dan spesifisitas dari metode analisis yang

digunakan?
2. Berapa batas deteksi, batas kuantifikasi serta linearitas dari metode analisis

yang digunakan?
3. Apakah terdapat senyawa asam retinoat pada sediaan krim pemutih wajah

yang beredar di pasar Kota Kendari?

C. Tujuan Penelitian

Tujuan dilakukannya penelitian ini yaitu :

1. Untuk mengetahui akurasi, presisi, dan spesifisitas dari metode analisis yang

digunakan.
2. Untuk mengetahui batas deteksi, batas kuantifikasi serta linearitas dari metode

analisis yang digunakan.

3. Untuk mengetahui apakah terdapat senyawa asam retinoat pada sediaan krim

pemutih wajah yang beredar di pasar Kota Kendari.

D. Manfaat Penelitian

Manfaat dilakukannya penelitian ini yaitu :

1. Bagi peneliti
Manfaat dari penelitian ini yaitu dapat menambah pengetahuan mengenai

cara menganalisis kandungan senyawa asam retinoat pada sediaan krim

pemutih wajah yang beredar di Kota Kendari.

2. Bagi institusi
Memberikan kontribusi kepada universitas berupa hasil penelitian,

sehingga bisa menjadi referensi dan informasi bagi peneliti lainnya

khususnya dalam bidang analisis farmasi.

4
3. Masyarakat
Memberikan informasi pada masyarakat mengenai pada sediaan krim

pemutih yang aman dan tidak mengandung bahan berbahaya bagi kesehatan.

5
 BAB II

TINJAUAN PUSTAKA

A. Kosmetik

Menurut Peraturan Menteri Kesehatan RI No.

445/MenKes/Permenkes/1998, kosmetik adalah sediaan atau paduan bahan yang

siap untuk digunakan pada bagian luar badan (epidermis, rambut, kuku, bibir dan

organ kelamin bagian luar), gigi dan rongga mulut untuk membersihkan,

menambah daya tarik, mengubah penampakan, melindungi supaya tetap dalam

keadaan baik, memperbaiki bau badan tetapi tidak dimaksudkan untuk mengobati

atau menyembuhkan suatu penyakit (Tranggono dan Fatmah, 2007).

Berdasarkan fungsinya kosmetik diklasifikasikan menjadi (Shai, dkk.,

2009):

1. Kosmetik Perawatan Kulit

Kosmetik perawatan kulit adalah kosmetik yang penggunaanya bertujuan

untuk membersihkan, melindungi dan memelihara kesehatan kulit.

a. Kelompok pembersih (cleansing)

Kosmetik ini berguna untuk membersihkan kotoran, debu atau make up

pada kulit.
b. Kelompok penyegar
Kosmetika penyegar kulit umumnya berupa cairan bening atau lotion.

Cairan penyegar sering disebut sebagai toning lotion/astringent lotion, yang

gunanya untuk meberikan rasa segar dan meringkaskan pori-pori.

c. Kelompok pelembab

6
 Kosmetika pelembab biasanya berbentuk cream atau lotion, gunanya

untuk memberikan kelembaban terutama untuk kulit kering atau normal,

sehingga terjaga kelembabannya.

d. Kelompok pelindung
Kosmetika pelindung biasanya disebut dengan sun screen atau tabir surya,

gunanya untuk melindungi kulit dari sengatan matahari.

e. Kosmetika penipis kulit (peeling)
Biasanya berbentuk bubuk atau cream, yang disebut dengan peeling.

Gunanya untuk mengangkat atau membuang sel kulit yang sudah mati agar

tidak terjadi penebalan kulit dan penyumbatan pori-pori.

2. Kosmetika riasan (dekoratif atau make-up);

Kosmetika dekoratif merupakan kosmetika yang dibuat dan digunakan

untuk merias atau memperindah kulit. Biasanya dibuat dengan berbagai macam

warna dan aroma. Contohnya adalah bedak, lipstick, pemerah pipi (blush on),

pewarna kelopak mata (eye shadow), pembuat garis mata (eyeliner), pensil alis,

dan maskara.

B. Krim

1. Pengertian Krim

Menurut Farmakope IV, krim adalah bentuk sediaan setengah padat

mengandung satu atau lebih bahan obat terlarut atau terdispersi dalam bahan dasar

yang sesuai. Istilah ini secara tradisional telah digunakan untuk sediaan setengah

padat yang mempunyai konsistensi relatif cair diformulasi sebagai emulsi air

dalam minyak atau minyak dalam air. Sekarang ini batasan tersebut lebih

diarahkan untuk produk yang terdiri dari emulsi minyak dalam air atau dispersi

mikrokristal asam-asam lemak atau alkohol berantai panjang dalam air, yang

7
dapat dicuci dengan air dan lebih ditujukan untuk penggunaan kosmetika dan

estetika (Ditjen POM,1995).

Krim adalah sediaan setengah padat berupa emulsi kental mengandung

tidak kurang dari 60% air, dimaksudkan untuk pemakaian luar. Tipe krim ada dua

yaitu krim tipe air minyak (A/M) dan krim minyak air (M/A). untuk membuat

krim digunakan zat pengemulsi. Umumnya berupa surfaktan-surfaktan anionik,

kationik, dan nonionik (Anief, 2006).

2. Krim Pemutih

Krim pemutih adalah sediaan kosmetik yang berbentuk krim yang

merupakan campuran bahan kimia dan atau bahan lainnya yang digunakan untuk

memucatkan noda hitam/coklat pada kulit (Nastiti, 2014). Produk pemutih kulit

atau skin whitening merupakan produk yang mengandung bahan aktif yang dapat

menghambat produksi melanin agar jumlah melanin tidak berlebih sehingga akan

memberikan warna kulit yang lebih putih (Badan POM, 2007).

Mekanisme dari pemutih wajah yaitu dengan menghambat sintesis

melanin. Melanin dibentuk oleh melanosit dengan enzim tirosinase memainkan

peranan penting dalam proses pembentukannya. Sebagai akibat dari kerja

enzim tirosinase, tiroksin diubah menjadi 3,4 dihidroksiferil alanin (DOPA)

dan kemudian menjadi dopaquinone, yang kemudian dikonversi, setelah

melalui beberapa tahap transformasi menjadi melanin. Penghambatan sintesis

melanin dilakukan dengan penghambatan enzim, tirosinase. Obat yang biasanya

digunkan dan mampu menghambat enzim tersebut adalah hidrokuinon, asam

kojik, asam azelaik, ekstrak bengkuang, arbutin (Shai, dkk., 2009).

8
 Djajadisastra (2003) mengelompokkan bahan aktif pemutih dalam dua

kelompok yaitu :

a. Bahan aktif pemutih kulit yang aman untuk kosmetika, antara lain asam

askorbat (vitamin C), asam kojik, arbutin, dan ekstrak mulberry.

b. Bahan aktif pemutih kulit untuk pengobatan yaitu merkuri, hidrokuinon dan

asam retinoat.

Penggunaan bahan aktif pemutih merkuri (Hg), hidroquinon > 2%, dan

asam retinoat (tretinoin) dalam sediaan kosmetik dapat membahayakan kesehatan

dan telah dilarang digunakan sebagaimana tercantum dalam Peraturan Menteri

Kesehatan RI No.445/MENKES/ PER/V/1998 Tentang Bahan, Zat Warna,

Substratum, Zat Pengawet dan Tabir Surya pada Kosmetik dan Keputusan Kepala

Badan POM No. HK.00.05.4.1745 Tentang Kosmetik. Merkuri (Hg) /Air Raksa

termasuk logam berat berbahaya, yang bahkan dalam konsentrasi kecil dapat

bersifat racun. Sedangkan hidroquinon >2% dan asam retinoat termasuk golongan

obat keras yang hanya dapat digunakan berdasarkan resep dokter. (Badan POM,

2007).

C. Asam Retinoat

Asam retinoat atau tretinoin (tretinoinum) dengan rumus molekul C 20H28O2

memiliki berat 300,44 g/mol. Pemerian berupa serbuk hablur, berwarna kuning

hingga jingga muda. Asam tretinoat tidak larut dalam air, sukar larut dalam etanol

dan larut dalam kloroformn (Ditjen POM, 1995), sensitif terhadap cahaya, panas,

dan udara (Sweetman, 2009). Panjang gelombang maksimum (λ maks) asam

retinoat dalam metanol adalah 352 nm (Suhartini, dkk., 2013) dan 339 nm

(Elzanfaly, dkk., 2012), λ maks dalam piridin adalah 389 nm dan λ maks dalam

9
 1
tetrahdidrofuran adalah 363 nm (Ragno, dkk., 1996). Nilai A 1 cm asam retinoat

yaitu 1455–1545 (353 nm) (USP, 2008). Struktur asam retinoat dapat dilihat pada

Gambar 1.
CH3 CH3 CH3 O
H3C

C OH

CH3

Gambar 1. Struktur asam retinoat (Ditjen POM, 1995)

Asam retinoat merupakan turunan vitamin A dan telah banyak digunakan

sebagai bahan pemutih pada kelainan melasma dan hiperpigmentasi pasca

inflamasi (HPI). Mekanisme kerja sebagai bahan pemutih belum jelas, tetapi

suatu penelitian pada binatang didapatkan bahwa asam retinoat mampu dapat

menghambat tirosinase. Mekanisme kerja asam retinoat mampu lebih meratakan

distribusikan granula pigmen di keratinosit. Penelitian lain mengatakan bahwa

asam retinoat juga mengganggu transfer melanin ke keratinosit dan mempercepat

pengelupasan epidermis. Sehingga dari berbagai pernyataan di atas terlihat jelas

bahwa asam retinoat akan berefek mengurangi pigmentasi pada kelainan-kelainan

pigmentasi. Asam retinoat tersedia dalam konsentrasi 0,025%; 0,5%; 0,1% dalam

sediaan solusio, gel maupun krim (Bandem, 2013).

Menurut Menaldi (2003), asam retinoat merupakan zat peremajaan non

peeling karena merupakan iritan yang menginduksi aktivitas mitosis sehingga

terbentuk stratum korneum yang kompak dan halus, meningkatkan kolagen dan

glikosaminoglikan dalam dermis sehingga kulit menebal dan padat serta

meningkatkan vaskularisasi kulit sehingga menyebabkan kulit memerah dan

10
segar. Asam retinoat juga terbukti efektif untuk pengobatan melasma. Selain

melasma, tretinoin juga digunakan untuk mengobati hiperpigmentasi akibat

penuaan dini dan hiperpigmentasi postinflamasi. Tretinoin secara luas diyakini

dapat menyebabkan penyebaran granul-granul pigmen dalam keratinosit, dengan

mengganggu transfer pigmen, dan mempercepat transfer epidermis, sehingga

pigmen hilang secara lebih cepat (Chan, 2008).

Tretinoin juga mempercepat turnover epidermis, mempersingkat transit

time di lapisan basal dan mempercepat hilangnya pigmen melalui proses

epidermopoesis (Victor, 2004). Asam retinoat mereduksi melanin epidermis,

kemungkinan dengan cara menurunkan jumlah transfer melanosom ke keratinosit,

selanjutnya meningkatkan proliferasi epidermis dan penghambatan enzim

tirosinase dan pada akhirnya terjadi penurunan proses melanogenesis. Ketika

digunakan sebagai monoterapi, tretinoin cukup efektif akan tetapi membutuhkan

waktu pengobatan selama 6 bulan atau lebih. Sehingga tretinoin sering

dikombinasikan dengan satu atau lebih bahan lainnya untuk mempercepat

timbulnya efek yang diharapkan (Torok, 2005).

Penggunaan tretinoin yang sebagai obat keras, hanya boleh dengan resep

dokter, namun kenyataannya ditemukan dijual bebas kosmetik yang mengandung

tretinoin (Badan POM, 2006). Penggunaan asam retinoat memiliki risiko yang

berbahaya bagi pemakainya, antara lain (Badan POM, 2011):

1. Potensi sebagai iritan
Pada kulit normal, asam retinoat yang dioleskan akan menimbulkan

peradangan pada kulit. Gejala yang sering muncul adalah sensasi rasa agak panas,

menyengat, kemerahan, eritema sampai pengerasan kulit. Gejala tersebut akan

pulih tergantung dari tingkat keparahan. Selain itu, Hipopigmentasi maupun

11
hiperpigmentasi, akantosis (hiperplasia dan penebalan abnormal lapisan tanduk)

dan parakeratosis (persistensi nuklei keratinoasit pada lapisan tanduk). Pada dosis

yang lebih tinggi dari dosis terapi, efek terapinya tidak akan meningkat dan dalam

jangka waktu yang lama, dan dapat menyebabkan menurunnya keratinisasi dan

produksi sebum sehingga kulit semakin kering dan tipis.

2. Potensi sebagai zat karsinogen (menyebabkan kanker)
Penggunaan asam retinoat pada mencit albino dan mencit berpigmen

terbukti dapat meningkatkan potensi karsinogen akibat radiasi sinar UV-B dan

UV-A.
3. Potensi sebagai zat teratogen (menyebabkan cacat janin)
Telah dilaporkan bahwa bayi yang terlahir dari seorang wanita yang

mengoleskan asam retinoat 0,05% sebanyak dua kali sehari untuk wajah

berjerawat, sebelum dan selama kehamilan, mengalami malformasi berat pada

wajah seperti kecacatan langit-langit mulut, bibir sumbing, celah kelopak mata

menyatu. Kasus lainnya melibatkan seorang wanita yang telah menggunakan

krim asam retinoat 0,05% selama sebulan sebelum menstruasi terakhir dan selama

sebelas minggu pertama kehamilan, dilaporkan bahwa bayi yang terlahir

mengalami cacat telinga eksternal (tanpa lubang dan tidak berfungsi).

Kebanyakan bayi yang terlahir dengan kondisi tersebut akhirnya

meninggal. Selain dari itu, kasus keguguran dan kelahiran prematur telah

dilaporkan usai penggunaan asam retinoat. Adanya asam retinoat dalam darah

pada kehamilan telah dinyatakan berpotensi teratogen. Tidak terkecuali untuk

penggunaan asam retinoat topikal di kulit yang dapat memungkinkan resiko

terserapnya asam retinoat ke dalam tubuh. Karena besarnya resiko tersebut, asam

retinoat dikontraindikasikan selama kehamilan dan selama merencanakan

kehamilan.

12
D. Metode Analisis Asam Retinoat

Metode analisis terbagi menjadi dua, yakni analisis kualitatif dan analisis

kuantitatif. Analisis kualitatif merupakan analisis untuk melakukan identifikasi

elemen, spesies, dan/atau senyawa-senyawa yang ada di dalam sampel. Dengan

kata lain, analisis kualitatif berkaitan dengan cara untuk mengetahui ada atau

tidaknya suatu analit yang dituju dalam suatu sampel. Sedangkan analisis

kuantitatif adalah analisis untuk menentukan jumlah (kadar) absolut atau relatif

dari suatu elemen ataau spesies yang ada di dalam sampel (Gandjar dan Abdul,

2012).

Adapun metode untuk analisis asam retinoat yaitu sebagai berikut:

a. Kromatografi Lapis Tipis (KLT)

Kromatografi Lapis Tipis (KLT) menggunakan suatu adsorben yang

disalutkan pada suatu lempeng kaca sebagai fase stasionernya dan pengembangan

kromatogram terjadi ketika fase mobil tertapis melewati adsorben (Pudjaatmaka,

1994). Analisis kandungan asam retinoat pada kosmetik dapat dilakukan dengan

menggunakan dua larutan pengembang untuk menganalisis asam retinoat yang

terkandung dalam kosmetik. Pengembang tersebut yaitu sistem A dan sistem B.

Sistem A: campuran n-heksan – asam asetat glasial 0,33% dalam etanol p.a

(9:1) v/v . Sistem B: campuran n-heksan – aseton (6:4) v/v. Larutan penampak

bercak yang digunakan adalah asam fosfomolibdat 5% dalam etanol. Perkiraan

nilai Rf untuk sistem A 0,1-0,3 dan untuk sistem B 0,5 (Badan POM, 2011).
b. Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT)
Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT) merupakan teknik yang mana

solute terpisah oleh perbedaan kecepatan elusi, dikarenakan solut-solut ini

melewati suatu kolom kromatografi) (Gandjar dan Abdul, 2012). Asam retinoat

13
diidentifikasi secara kromatografi cair fase balik dengan deteksi ultra violet. Fase

gerak yang digunakan untuk menganalisis asam retinoat yang terkandung dalam

kosmetik yaitu campuran metanol-air-asam asetat glasial (85:15:0,5). Detektor

diatur pada panjang gelombang 353 nm. Larutan sampel disuntikkan sebanyak

20 μl dengan kecepatan alir fase gerak 1,4 mL/menit (Badan POM, 2011).
c. Spektrofotometri UV-Vis
Spektrofotometri UV-Vis adalah teknik spektroskopi yang memakai sumber

radiasi elektromagnetik ultraviolet dekat (190-380 nm) dan sinar tampak (380-780

nm) dengan memakai instrumen spektrofotometer. (Sastrohamidjojo, 2007).

Metode spektrofotometri UV-Vis dapat digunakan untuk analisis kuantitatif asam

retinoat yang terkandung dalam sediaan krim. Uji kuantitatif dilakukan dengan

cara sampel uji ditambahkan metanol, dikocok hingga homogen. Didinginkan

dalam es selama 15 menit dan saring melalui kertas saring Whatman No.41. Filtrat

ditambahkan metanol dan dihomogenkan, kemudian diiukur serapannya pada

panjang gelombang 352 nm (Suhartini, dkk., 2013).

E. Spektrofotometri

Spektrofotometri adalah salah satu metode dalam kimia analisis yang

digunakan untuk menentukan komposisi suatu sampel baik secara kuantitatif dan

kualitatif yang didasarkan pada interaksi antara materi dengan cahaya. Cahaya

yang dimaksud dapat berupa cahaya inframerah, cahaya visible, maupun ultra

violet (Anonim, 2007).

Menurut Sastrohamidjojo (2007), spektrofotometri UV-Vis merupakan

gabungan antara Spektrofotometri UV dan visible, yang menggunakan dua buah

sumber cahaya yang berbeda, yaitu sumber cahaya UV dan sumber cahaya

visible. Sistem Spektrofotometri UV-Vis paling banyak tersedia dan paling

14
populer digunakan. Kemudahan metode ini adalah dapat digunakan baik untuk

sampel berwarna juga untuk sampel tak berwarna. Alat yang digunakan dalam

Spektrofotometri disebut Spektrofotometer. alat ini banyak bermanfaat untuk

penentuan konsentrasi senyawa yang dapat menyerap radiasi pada daerah

ultraviolet (200 – 400 nm) atau daerah sinar tampak (400 – 800 nm).

Spektrofotometer UV-Vis memiliki beberapa komponen penyusun, meliputi

sumber cahaya polikromatis, monokromator, tempat cuplikan (kuvet) dan detektor

(Sastrohamidjojo, 2007). Komponen instrumen spektrofotometri UV-Vis dapat

dilihat pada Gambar.2

Gambar 2. Instrumen Spektrofotometri UV-Vis (Sastrohamidjojo, 2007)

1. Sumber cahaya polikromatis
Sumber sinar polikromatis berfungsi sebagai sumber sinar polikromatis

dengan berbagai macam rentang panjang gelombang

2. Monokromator
Monokromator merupakan serangkaian alat optik yang berfungsi sebagai

penyeleksi panjang gelombang yaitu mengubah cahaya yang berasal dari sumber

sinar polikromatis menjadi cahaya monokromatis

3. Tempat cuplikan
Spektrofotometer UV-VIS menggunakan kuvet sebagai tempat cuplikan

(sampel). Kuvet biasanya terbuat dari kuarsa atau gelas, namun kuvet dari kuarsa

15
yang terbuat dari silika memiliki kualitas yang lebih baik. Kuvet biasanya

berbentuk persegi panjang dengan lebar 1 cm

4. Detektor
Detektor berfungsi menangkap cahaya yang diteruskan dari sampel dan

mengubahnya menjadi arus listrik. Kebanyakan detektor menghasilkan sinyal

listrik yang dapat mengaktifkan meter atau pencatat. Setiap pencatat harus

menghasilakn sinyal yang secara kuantitatif berkaitan dengan tenaga cahaya

yang mengenainya.
5. Read out
Read out merupakan suatu sistem baca yang menangkap besarnya isyarat

listrik yang berasal dari detektor.

Hukum Lambert-Beer yang menyatakan bahwa intensitas yang diteruskan

oleh larutan zat penyerap berbanding lurus dengan tebal dan konsentrasi larutan.

Hukum ini secara sederhana dapat dinyatakan dalam rumus berikut (Gandjar dan

Abdul, 2012):

Io
A = log It = ε .b.c = a . b . c

Keterangan :

A = serapan

Io = intensitas sinar dating

It = intensitas sinar yang diteruskan (ditransmisikan)

ε = absortivitas molekuler/ konstanta ekstingsi (L. mol-1.cm-1)

a = absortivitas (L. g-1.cm-1)

b = tebal larutan/kuvet (cm)

c = kosentrasi larutan (g/L atau mg/mL)

16
F. Validasi Metode

Validasi metode menurut United States Pharmacopeia (USP) dilakukan

untuk menjamin bahwa metode analisis akurat, spesifik, reprodusibel, dan tahan

pada kisaran analit yang akan dianalisis. Suatu metode analisis harus divalidasi

untuk melakukan verifikasi bahwa parameter-parameter kinerjanya cukup mampu

untuk mengatasi problem analisis (Gandjar dan Abdul, 2012).

Validasi metoda analisis adalah suatu tindakan penilaian terhadap parameter

tertentu, berdasarkan percobaan laboratorium, untuk membuktikan bahwa

parameter tersebut memenuhi persyaratan untuk penggunaannya. Beberapa

manfaat validasi metode analisis adalah untuk mengevaluasi suatu metode

analisis, menjamin prosedur analisis, menjamin keakuratan dan mengurangi resiko

penyimpangan yang mungkin timbul (Harmita, 2004). Adapun parameter-

parameter yang perlu dilakukan untuk uji validasi metode yaitu ketepatan

(akurasi), presisi, batas deteksi (LOD), batas kuantifikasi (LOQ) dan linearitas

(Gandjar dan Abdul, 2012).

1. Akurasi

Akurasi adalah kedekatan hasil uji antara hasil yang diperoleh dengan

nilai sebenarnya (true value) atau dengan nilai referensinya (Chan, dkk., 2004).

Akurasi dinyatakan sebagai persen perolehan kembali (recovery) analit yang

ditambahkan. Persen perolehan kembali dapat ditentukkan dengan cara membuat

sampel plasebo (eksipien obat, cairan biologis) kemudian ditambah analit dengan

konsentrasi tertentu (biasanya 80% sampai 120% dari kadar analit yang

diperkirakan), kemudian dianalisis dengan metode yang akan divalidasi. Bila

17
tidak dimungkinkan membuat sampel plasebo karena matriknya tidak diketahui

seperti obat-obatan paten, atau karena analitnya berupa suatu senyawa endogen

misalnya metabolit sekunder pada kultur kalus, maka dapat dipakai metode adisi

(Harmita, 2004).

ICH (International Conference Harmanization) merekomendasikan

pengumpulan data akurasi dari 9 kali penetapan kadar dengan 3 konsentrasi yang

berbeda (misalnya 3 konsentrasi dengan 3 kali pengulangan atau triplo). Ketika

penentuan batasan uji perolehan kembali belum ditentukan oleh laboratorium

yang melakukan pengujian maka sebagai batasan awal dapat ditentukan

berdasarkan Tabel 1.

Tabel 1.Nilai Persen Recovery

Analit pada matriks Recovery yang
sampel (%) diterima (%)
100 98 – 102
>10 98 – 102
>1 97 – 103
>0,1 95 – 105
0,01 90 – 107
0,001 90 – 107
0,0001 (1 µg/mL) 80 – 110
0,00001 (100 ppb) 80 – 110
0,000001 (10 ppb) 60 – 115
0,0000001 (1 ppb) 40 – 120
(Sumber: Wood, 1998)

Akurasi dapat ditentukan melalui dua cara, yaitu metode simulasi (standar

sebagai sampel) dan Metode penambahan bahan baku (standar adisi). Dalam

metode simulasi sejumlah analit bahan murni diukur kadarnyaterlebih dahulu

(dengan konsentrasi yang sudah diketahui), kemudian ditambahkan kedalam

bahan campuran pembawa sediaan (placebo adalah campuran pereaksi yang

digunakan) lalu campuran diukur dan dianalisis, dan hasilnya dibandingkan

18
dengan kadar analit yang ditambahkan (kadar sebenarnya). Pada metode

penambahan baku, sejumlah analit bahan murni yang diketahui kadarnya

ditambahkan pada sampel yang telah mengandung analit, namun tidak diketahui

kuantitasnya. Matriks sampel yang telah mengandung analit juga dianalisis.

Selisih kedua hasil dibandingkan dengan kadar yang sebenarnya (Riyanto, 2014).

2. Presisi

Presisi adalah kedekatan hasil uji dengan cara memperoleh pengukuran

dari berbagai contoh yang homogen dalam kondisi yang normal. Presisi adalah

ukuran yang menunjukan derajat kesesuaian antara hasil individual, diukur

melalui penyebaran hasil individual rata-rata jika prosedur ditetapkan secara

berulang pada sampel yang diambil dari campuran yang homogen (Chan dkk.,

2004). Presisi merupakan keterluangan metode analisis dan biasanya

diekspresikan sebagai simpangan baku relative dari sejumlah sampel yang

berbeda signifikan secara statistik. Biasanya replikasi 6-15 dilakukan pada

sampel tunggal untuk tiap-tiap konsentrasi (Gandjar dan Abdul, 2012).

Kriteria presisi diberikan jika metode memberikan simpangan baku relatif

atau koefisien variasi < 2%. Akan tetapi kriteria ini sangat fleksibel tergantung

pada konsentrasi analit yang diperiksa, jumlah sampel, dan kondisi laboratorium.

Dari penelitian dijumpai bahwa koefisien variasi meningkat dengan menurunnya

kadar analit yang dianalisis. Ditemukan bahwa koefisien variasi meningkat seiring

dengan menurunnya konsentrasi analit. Pada kadar 1% atau lebih, nilai koefisien

variasinya adalah sekitar 2,5% ada pada satu per seribu adalah 5%. Pada kadar

19
satu per sejuta (ppm) nilai RSDnya adalah 16%, dan pada kadar part per bilion

(ppb) adalah 32% (Harmita, 2004).

Menurut Sumardi (2005) presisi dinyatakan dengan persentase Relative

Standard Deviasion (% RSD) dengan batas-batas yang masih dapat diterima

berdasarkan ketelitiannya. Tingkat ketelitiannya dapat dilihat pada Tabel 2.

Tabel 2. Tingkat Ketelitian Berdasarkan % RSD

Nilai RSD Kategori
RSD ≤ 1% Sangat teliti
1%<RSD
≤ 2%
Teliti
2%<RSD
≤ 5% Ketelitian
sedang
Ketelitian
RSD> 5% rendah

3. Spesifisitas

Spesifitas suatu metode adalah kemampuan suatu metode yang hanya

mengukur zat tertentu saja secara cermat dan seksama dengan adanya komponen

lain yang mungkin ada dalam matriks sampel. Spesifitas sering kali dapat

dinyatakan dengan derajat penyimpangan metode yang dilakukan terhadap sampel

yang mengandung bahan yang ditambahkan berupa campuran senyawa yang

dianalisis dan membandingkannya (Chan dkk., 2004). Suatu metode analisis dapat

dikatakan selektif jika metode tersebut hanya menggambarkan keberadaan dari

analit yang dituju didalam sampel yang didalamnya terdapat senyawa pengganggu

(Harvey, 2000).

20
4. Linearitas

Linearitas merupakan kemampuan suatu metode untuk memperoleh hasil-

hasil uji yang secara langsung proporsional dengan konsentrasi analit pada kisaran

yang diberikan. Linearitas suatu metode merupakan ukuran seberapa baik kurva

baku yang menghubungkan antara respon (y) dengan konsentrasi (x). Linearitas

dapat diukur dengan melakukan pengukuran tunggal pada konsentrasi yang

bervariasi. Data yang diperoleh selanjutnya diproses dengan metode kuadrat

terkecil, untuk selanjutnya dapat ditentukan nilai kemiringan (slope), intersep,

koefisien korelasinya (Gandjar dan Abdul, 2012).

Sebagai parameter adanya hubungan linier digunakan koefisien korelasi r

pada analisis regresi linier y = a + bx. Hubungan linier yang deal dicapai jika nilai

b = 0 dan r = +1 atau –1 bergantung pada arah garis. Sedangkan nilai a

menunjukkan kepekaan analisis terutama instrumen yang digunakan. Uji linearitas

dilakukan dengan suatu larutan baku yang terdiri atas minimal 5 konsentrasi yang

naik dengan rentang 50-100% dari rentang komponen uji. Kemudian data diproses

dengan menggunakan regresi linear, sehingga dapat diperoleh respon linear

terhadap konsentrasi larutan baku (Harmita, 2004). Menurut Shargel (1985),

daerah regresi linier yang dapat diterima yaitu r = 0,995.

5. Batas Deteksi (LOD) dan Batas Kuantifikasi (LOQ)

Batas deteksi atau LOD (limit of detection) didefinisikan sebagai

konsentrasi analit terendah dalam sampel yang masih dapat dideteksi. Sedangkan

21
batas kuantifikasi atau LOQ (limit quantification) didefinisikan sebagai

konsentrasi analit terendah dalam sampel yang dapat ditentukan dengan presisi,

dan akurasi yang dapat diterima pada kondisi operasional metode yang digunakan

(Gandjar dan Abdul, 2012).

Batas deteksi merupakan jumlah terkecil analit dalam sampel yang dapat

dideteksi yang masih memberikan respon yang signifikan dibandingkan dengan

blanko. Sedangkan batas kuantifikasi merupakan jumlah terkecil analit dalam

sampel yang masih memenuhi kriteria cermat dan seksama dan dapat

dikuantifikasi dengan akurasi dan presisi yang baik (Harmita, 2004).

22
 G. Kerangka Konsep

Kosmetik
n campuran bahan kimia dan atau bahan lainnya yang digunakan untuk memucatkan noda hitam/coklat pad

Krim pemutih

Bahan kimia
s dengan resep dokter. Bahaya penggunaan bahan ini dapat menyebabkan kulit kering,rasa terbakar,dan tera
Suhartini (2013) dan Rahayu (2014) menemukan asam retinoat pada krim pemutih wajah yang b

Asam retinoat

Metode
metode dan analisis asam retinoat pada krim pemutih wajah yang beredar analisissecara spektrofo
di Kota Kendari
KCKT, KLT (Badan
POM, 2011) dan
Spektrofotometri UV-
Vis (Suhartini, dkk.,
2013).

Analisis kualitatif

Analisis kuantitatif Validasi metode

Akurasi
Kadar asam retinoat

Presisi

Spesifisitas

Linearitas, LOD & LOQ

23
 BAB III

METODE PENELITIAN

A. Waktu dan Tempat Penelitian

Penelitian ini akan dilaksanakan pada bulan Mei 2016 sampai Agustus

2016 di Laboratorium Farmasi Fakultas Farmasi Universitas Halu Oleo Kendari.

B. Jenis Penelitian

Penelitian ini merupakan penelitian eksperimental laboratorium yaitu

dilakukan pengujian secara kualitatif terhadap sampel krim pemutih untuk

mengetahui keberadaan asam retinoat. Sampel yang positif mengandung asam

retinoat kemudian dilanjutkan dengan pengujian secara kuantitatif untuk

mengetahui kadar asam retinoat yang terkandung dalam sampel krim pemutih

yang beredar di pasar kota Kendari.

C. Bahan Penelitian

Bahan-bahan yang digunakan pada penelitian ini yaitu sampel krim

pemutih, baku asam retinoat , metanol (pro analis), dan hidrokuinon.

D. Alat Penelitian

Timbangan analitik (Precisa®), spektrofotometer UV-Vis (Jenway®), gelas

kimia (Iwaki Pyrex®), gelas ukur (Iwaki Pyrex®), labu ukur (Duran®), tabung

sentrifus, pipet ukur, pipet tetes, batang pengaduk, spatula, gelas arloji, dan filler.

E. Definisi Operasional

1. Validasi metode analisis adalah suatu tindakan untuk mengevaluasi metode

spektrofotometri, menjamin prosedur analisis, menjamin keakuratan dan

mengurangi resiko penyimpangan yang mungkin terjadi. Parameter validasi

24
 metode analisis meliputi akurasi, presisi, spesifisitas, batas deteksi (LOD) dan

batas kuantifikasi (LOQ).

2. Krim pemutih adalah krim yang diperoleh dari beberapa pasar yang ada di

kota Kendari yang diduga mengandung asam retinoat.

3. Uji kualitatif merupakan cara yang dilakukan untuk menentukan ada tidaknya

asam retinoat dalam krim pemutih menggunakan metode spektrofotometri

UV-Vis.
4. Uji kuantitatif merupakan cara yang dilakukan untuk menentukan kadar asam

retinoat yang terkandung dalam krim pemutih menggunakan metode

spektrofotometri UV-Vis.

F. Prosedur Penelitian

1. Pengambilan Sampel Krim Pemutih

Teknik pengambilan sampel dilakukan dengan metode purposive sampling

yaitu pengambilan sampel berdasarkan pertimbangan peneliti Pengambilan

sampel dilakukan pada beberapa pasar yang ada di Kota Kendari berdasarkan

ketidaklengkapan informasi atau keterangan yang seharusnya tercantumkan dalam

etiket wadah dan atau pembungkus, seperti kode produksi (nomor batch), nomor

izin edar, bulan dan tahun kadaluarsa. Masing-masing pasar diambil satu sampel

sebanyak 5 merek sampel yaitu sampel A, sampel B, sampel C, sampel D dan

sampel E.

2. Pembuatan Larutan Asam Retinoat 1000 µg/mL

Baku asam retinoat ditimbang 10 mg, dimasukkan kedalam labu ukur 10

mL, lalu ditambahkan metanol sampai garis tanda dan dihomogenkan.

25
3. Pembuatan Larutan Asam Retinoat 500 µg/mL

Larutan asam retinoat 1000 µg/mL diambil 5 mL, dimasukkan kedalam

labu ukur 10 mL, lalu ditambahkan metanol sampai garis tanda dan

dihomogenkan.

4. Penentuan Panjang Gelombang Maksimum Larutan Asam Retinoat

Larutan asam retinoat 500 µg/mL dipipet 1,5 mL dan dimasukkan

kedalam labu ukur 25 mL (konsentrasi 30 µg/mL), lalu ditambahkan metanol

sampai garis tanda dan dihomogenkan. Diukur serapan maksimum pada

panjang gelombang 200 – 400 nm dengan menggunakan blanko. Blanko yang

digunakan adalah metanol.

5. Pembuatan Kurva Baku

Larutan asam retinoat 500 µg/mL dipipet, dimasukkan kedalam labu

ukur 25 mL berturut- turut 0,5 mL, 1 mL, 1,5 mL, 2 mL dan 2.5 mL (10 µg/mL,

20 µg/mL, 30 µg/mL, 40 µg/mL dan 50 µg/mL). Kedalam masing-masing labu

ukur tersebut ditambahkan metanol sampai garis tanda dan dihomogenkan.

Diukur serapannya pada panjang gelombang maksimum dan metanol sebagai

blanko.

6. Analisis Kualitatif dan Kuantitatif

a. Preparasi sampel

Sampel uji diimbang 3 g, masukkan ke dalam tabung sentrifus, dibungkus

dengan aluminium foil, ditambahkan 10 mL metanol dan dicampur

menggunakan vortex mixer selama 5 menit. Didinginkan dalam es selama 15

menit dan saring melalui kertas saring Whatman no. 41 (BPOM, 2011). Filtrat

26
ditampung dalam labu ukur 50 mL, ditambahkan metanol sampai tanda tera dan

dihomogenkan. Dipipet 2 mL filtrat hasil pengenceran sampel kemudian

dimasukkan kedalam labu ukur 25 mL, ditambahkan metanol sampai tanda tera

dan dihomogenkan. (Suhartini, 2013).

b. Uji kualitatif

Sampel uji yang telah dipreparasi kemudian diamati spektranya pada

panjang gelombang 200 – 400 nm dan dibandingkan dengan spektra yang

dihasilkan dari larutan baku asam retinoat. Sampel yang memiliki kemiripan

spektra dengan larutan baku asam retinoat, selanjutnya dilakukan uji kuantitatif.

c. Uji kuantitatif

Sampel yang positif mengandung asam retinoat, diukur absorbansinya pada

panjang gelombang maksimum. Kemudian absorbansi yang diperoleh

disubtitusikan kedalam persamaan kurva baku y = bx + a, dengan y adalah nilai

absorbansi dan x adalah kadar terukur.

7. Validasi Metode

a. Akurasi

Sampel krim pemutih yang tidak mengandung asam retinoat ditimbang

sebanyak 1 g, dimasukkan ke dalam tabung sentrifus dan dibungkus

aluminium foil. Metanol sebanyak 10 mL ditambahkan dan dicampur

menggunakan vortex mixer selama 5 menit. Didinginkan dalam es selama 15

menit dan saring melalui kertas saring Whatman no. 41 (BPOM, 2011). Filtrat

ditampung dalam labu ukur 50 mL, ditambahkan metanol sampai tanda tera dan

dihomogenkan. Dipipet 2 mL filtrat hasil pengenceran sampel kemudian

27
dimasukkan kedalam labu ukur 25 mL, ditambahkan metanol sampai tanda tera

dan dihomogenkan. (Suhartini, 2013).

Pengujian akurasi dilakukan dengan metode penambahan baku (standar

adisi), ditambahkan larutan asam retinoat 10 µg/mL, 30 µg/mL dan 50 µg/mL

dalam larutan sampel. Analit uji dimasukkan dalam kuvet kemudian diukur

serapannya pada panjang gelombang maksimum dengan menggunakan

spektrofotometer UV-Vis. Pengukuran serapan 3 variasi konsentraasi (10 µg/mL,

25 µg/mL dan 50 µg/mL) masing-masing dilakukan pengulangan sebanyak 3 kali

(triplo). Nilai yang didapatkan dihitung sebagai nilai % recovery.

b. Presisi

Larutan baku asam retinoat konsentrasi 40 µg/mL dipipet sebanyak 10

mL. Kemudian diukur absorbansinya pada panjang gelombang maksimum dan

diulangi pengukurannya sebanyak 10 kali, selanjutnya dapat diketahui nilai

standar deviasi dan relativ standar deviasi dari data yang didapatkan.

c. Spesifisitas

Ditimbang 1 g sampel krim pemutih yang tidak mengandung asam

retinoat, dimasukkan ke dalam tabung sentrifus, dibungkus dengan aluminium

foil, kemudian ditambahkan 10 mL metanol dan dicampur menggunakan vortex

mixer selama 5 menit. Didinginkan dalam es selama 15 menit dan disaring

melalui kertas saring Whatman no. 41. Diambil 4 mL dari larutan sampel, 4 mL

hidrokuinon 20 µg/mL, 4 mL larutan standar asam retinoat 20 µg/mL, kemudian

masing-masing larutan tersebut dimasukkan ke dalam kuvet dan diamati spektra

yang terbentuk pada panjang gelombang 200-400 nm. Hal yang sama dilakukan

28
pada campuran dari semua larutan tersebut (sampel, larutan baku asam retinoat

20 µg/mL, dan hidrokuinon 20 µg/mL).

d. Linearitas

Pengujian linearitas berdasarkan nilai koefisien korelasi (r) pada

persamaan regresi linear. Data yang diperoleh selanjutnya diproses dengan metode

kuadrat terkecil, untuk selanjutnya dapat ditentukan nilai kemiringan (slope),

intersep, dan koefisien korelasinya.

e. Batas Deteksi (LOD) dan Batas Kuantifikasi (LOQ)

Batas deteksi dan batas kuantitasi dihitung secara statistik melalui

persamaan regresi linear dari kurva baku. Perhitungan tersebut dapat dilakukan

dengan cara memasukkan absorbansi larutan baku hasil pengukuran ke dalam

persamaan regresi linier yang diperoleh.

G. Pengolahan Data

Hasil penelitian berupa data nilai absorbansi baik data dari sampel maupun

validasi yang dilakukan. Kadar dari sampel diketahui berdasarkan persamaan

kurva baku yang didapatkan yakni y = bx + a, dengan y adalah nilai absorbansi

dan x adalah kadar terukur. Pembacaan sampel didapatkan absorbansi sebagai y

dan x adalah kadar terukur dengan kadar b/v.

1. Akurasi

Pengujian akurasi dapat dihitung melalui % perolehan kembali (%

recovery) dengan rumus sebagai berikut (Riyanto, 2014):

¿
AxB
% Perolehan kembali = 100 . . . (persamaan 1)
C

29
Keterangan :
A = kadar analit terhitung
C = kadar analit yang ditambahkan
B* = faktor pengenceran (*jika ada)

2. Presisi

Presisi dapat dihitung dengan rumus sebagai berikut (Miller dan Miller,
2010):

√
2
∑ ( x i− x́ )
SD= . . . (persamaan 2)
n−1

SD
%RSD= x 100
x́ . . . (persamaan 3)

Keterangan :
RSD = relative standard deviasi
SD = standar deviasi
x = kadar hidrokuinon yang terukur
x́ = kadar rata-rata hidrokuinon dalam sampel
n = perlakuan

3. Spesifisitas

Pengujian spesifisitas dapat dihitung melalui absorbansi total pada setiap

panjang gelombang seperti rumus sebagai berikut (Sastrohamidjojo, 2001) :

Pada λ1 :
λ1 λ1 λ1 λ1
AI = ε1 bc1 dan A II = ε II bcII
A
λ1
= A 1λ1 + A λ1
II = ε 1λ1 bc1 + ε λ1
II bcII . . .
(persamaan 4)
Pada λ2 :

A λ2
I = ε 1λ2 bc1 dan A λ2
II = ε λ2
II bcII

30
 A λ2 = A 1λ2 + A λ2
II = ε 1λ2 bc1 + ε λ2
II bcII . . .

(persamaan 5)

Keterangan :

A λ1 dan A λ2 = absorbansi-absorbansi yang teramati dari campuran

pada panjang gelombang λ1 dan λ2.
λ1 λ2
A I dan A I = absorbansi-absorbansi komponen I dalam campuran pada
λ1 dan λ2.
λ1 λ2
A II dan A II = absorbansi-absorbansi komponen II dalam campuran
pada λ1 dan λ2.
λ1 λ2 λ1 λ2
ε 1 , ε 1 , ε II , ε II = serapan molar dari komponen I dan II pada λ 1 dan
λ2.
C1 dan C2 = Konsentrasi komponen I dan II dalam campuran

4. Linearitas

Pengujian linearitas berdasarkan nilai r pada persamaan regresi linear.

Data yang diperoleh selanjutnya diproses dengan metode kuadrat terkecil, untuk

selanjutnya dapat ditentukan nilai kemiringan (slope), intersep, koefisien

korelasinya. Slope, intersep dan koefisien regresi dapat ditentukan dengan rumus

sebagai berikut (Gandjar dan Abdul, 2012):

n

∑ ( ( x i−x ) ( y i− y ) )
i
b= n . . . (persamaan 6)
∑ ( y i− ý )2
i

a = y-bx . . . (persamaan 7)
n

∑ ( ( x i−x́ ) ( y i− ý ) )
i
r= . . . (persamaan 8)
√∑ (
n n
2 2
x i− x́ ) ∑ ( y i− ý )
i i

31
Keterangan :
y = bx + a
y = menyatakan absorbansi
x = konsentrasi
b = koefisien regresi (juga menyatakan slope = kemiringan)
a = tetapan regresi dan juga disebut dengan intersep

5. LOD dan LOQ

Metode perhitungan LOD dan LOQ berdasarkan persamaan garis regresi

dari kurva baku yakni y = bx + a, kemudian diolah dengan rumus (Harmita, 2004)

3 x SD
LOD (Limit of Detection) = Slope . . . (persamaan 9)

10 x SD
LOQ (Limit of Quantition) = Slope . . . (persamaan 10)

y− y i2
∑ (¿¿)
SD = n−2 . . . (persamaan 11)
¿
¿
√¿

Keterangan:
SD = Standar Deviasi
LOD = Batas Deteksi
LOQ = Batas Kuantisasi
y = Absorbansi yang terbaca
yi = Absorbansi yang sudah dimasukkan ke persamaan
n = Perlakuan

6. Penetapan Kadar Asam Retinoat Dalam Sampel

Perhitungan kadar asam retinoat dalam sampel dapat dihitung dengan

rumus sebagai berikut (Sulaeman, 2005):

32
 x (µg /mL )× jumlah pelarut (L)
% Asam Retinoat = ×100 . . . (persamaan 12)
bobot sampel

H. Jadwal Penelitian

Tabel 3. Jadwal penelitian

Bulan
N
Kegiatan Agu
o Mei Juni Juli
stus
1
Pengambilan Sampel Penelitian
.
2 Pembuatan Larutan Asam Retinoat
. 1000 µg/mL
3 Pembuatan Larutan Asam Retinoat
. 500 µg/mL
4 Penentuan Panjang Gelombang
. Maksimum
5
Pembuatan Kurva Baku
.
6
Analisis Kualitatif
.
7
Analisis Kuantitaf
.
8
Validasi Metode
.
9
Pengolahan Data
.
1
0 Pembuatan Laporan Hasil Penelitian
.

33
 DAFTAR PUSTAKA

Anief, 2006, Ilmu Meracik Obat, Gadjah Mada University Press, Yogyakarta.

Anonim, 2007, Spektroskopi, Universitas Sanata Dharma, Yogyakarta.

Badan POM RI, 2006, Kosmetik Pemutih (Whitening), Naturoks, 1 (1).

Badan POM RI, 2007, Public Warning / Peringatan Tentang Kosmetik

Mengandung Bahan Berbahaya dan Zat Warna yang Dilarang. Jakarta.

Badan POM RI, 2011, Mewaspadai Asam Retinoat Dalam Kosmetik, Info POM,
12 (3).

Badan POM RI, 2011, Peraturan Kepala Badan Pengawas Obat Dan Makanan
Republik Indonesia Nomor Hk.03.1.23.08.11.07331 Tahun 2011 Tentang
Metode Analisis Kosmetika, Jakarta.

Badan POM RI, 2013, Public Warning Terhadap 17 Kosmetika Yang

Mengandung Bahan Berbahaya, Jakarta.

Bandem, A.W., 2013, Medical Review : Analisis Pemilihan Terapi Kelainan Kulit
Hiperpigmentasi, Medicinus, 26 (2).

Chan, C.C., Herman L.Y.C., dan Lee, X.M.Z., 2004, Analitical Method
Validation and Instrument Performance Verification, John Willey & Sons ,
Inc Publication, New Jersey.

Chan, R. A., 2008, Randomized Controlled Trial of the Efficacy and Safety of
Fixed Triple Combination (FluocinoloneAcetonide 0.01%, Hydroquinone
4%, Tretinoin 0.05% ) Compared with Hydroquinone 4% Cream in Asian
Patient with Moderate to Severe Melasma, Br J Dermatol, 159:697-703.

Ditjen POM, 1995, Farmakope Indonesia, Edisi Keempat, Departemen

Kesehatan Republik Indonesia, Jakarta.

Djajadisastra, J., 2003, Pemutih yang Tepat dan Aman Bagi Wanita Indonesia,
Pharmacy Beauty and Health Expo, Kampus UI Depok, 12 September 2003.

Djajadisastra, J., 2009, Tekhnologi Kosmetik, Departemen Farmasi FMIPA

Universitas Indonesia, Tangerang.

Elzanfaly, E.S., Ahmed, S.S., Abd-Elaziz, B., dan Abd-Elaleem, 2012,

Simultaneous Determination of Retinoic Acidand Hydroquinone in Skin
Ointment Using Spectrophotometric Technique (Ratio Difference Method),
Saudi Pharmaceutical Journal, 20 : 249–253

34
Gandjar, I.G., dan Abdul, R., 2012, Kimia Farmasi Analisis, Pustaka Pelajar,
Jakarta..

Harmita, 2004, Petunujuk Pelaksanaan Validasi Metode dan Cara Perhitungannya,

Majalah Ilmu Kefarmasian, 1 (3).

Harvey, D., 2000, Modern Analytical Chemystri, McGraw Hill, USA.

Menaldi, S.L., 2003, Peremajaan Kulit, Fakultas Kedokteran Universitas

Indonesia, Jakarta.

Miller, J.N., dan Miller J.C., 2010, Statistics And Chemometrics For Analytical
Chemistry, Sixth Edition, Pearson Education, England.

Nastiti, A.A., 2014, Analisis Asam Retinoat Pada Krim Pemutih Wajah
Menggunakan Kromatografi Lapis Tipis Dan Kromatografi Cair Kinerja
Tinggi, Skripsi, Universitas Islam Bandung, Bandung.

Nijhu, R.S., Dewan T.A., dan Yeakuty M.J., 2011, Development and Validation of
UV Spectrophotometric Method for Quantitative Estimation of
Nitroglycerin In Pharmaceutical Dosage Form, International Current
Pharmaceutical Journal, 1 (1).

Pudjaatmaka, A.H., 1994, Buku Ajar Vogel: Kimia Analisis Kuantitatif Anorganik,
EGC, Jakarta.

Purwanto A., Dan Farida E., 2012, Metode Spektrofotometri Uv-Vis Untuk
Pengujian Kadar Silika Dalam Natrium Zirkonat , Prosiding Seminar
Penelitian Dan Pengelolaan Perangkat Nuklir, Pusat Teknologi Akselerator
Dan Proses Bahan, Yogyakarta, 26 September 2012.

Ragno, G., Veronico, M., Maddalena, R., dan Vetuschi, C., 1996, Tretinoin Assay
in Cosmetics and Pharmaceuticals by Carbon Phase Extraction, Journal of
The Society of Cosmetic Chemists, 47 : 325-336

Rahayu, W.S., Nunuk A.N., dan Dyah A.S., 2014, Analisis Asam Retinoat Dalam
Sediaan Krim Pemutih Yang Dijual Bebas Di Wilayah Purwokerto,
Prosiding Seminar Nasional dan Workshop “Perkembangan Terkini Sains
Farmasi dan Klinik IV” tahun 2014.

Riyanto, 2014, Validasi dan Verifikasi Metode Uji, Deepublish , Yogyakarta.

Sastrohamidjojo, H., 2007, Spektroskopi, Liberty, Yogyakarta.

35
Shai, A., Howard, I.M., dan Robert, B., 2009, Handbook of Cosmetic Skin Care,
Second Edition, Informa Healthcare, UK.

Shargel, L., 1985, Biofarmasetika dan Farmakokinetik Terapan, Ed. 2,

diterjemahkan oleh Fasich, Universitas Airlangga, Surabaya.

Suhartini, S., Fatimawali, dan Gayatri, C., 2013, Analisis Asam Retinoat Pada
Kosmetik Krim Pemutih Yang Beredar Di Pasaran Kota Manado,
Pharmacon Jurnal Ilmiah Farmasi, 2 (1).

Sumardi, 2005, Tinjauan Umum Validasi metode Analisis, Pusat Penelitian Kimia
LIPI, Bandung

Sweetman, S.C., 2009, Martindale : The Complete Drug Reference, 36th Edition,
Pharmaceutical Press, London.

The United State Pharmacopeia Convention, 2008, The United State

Pharmacopeia (USP), 31th Edition, United States.

Torok, H.M., Jones, T., Rich, P., Smith, S., dan Tschen, E. 2005. Hydroquinone
4%, Tretinoin 0,05%, Fluocinolone Acetonide 0,01%: A Safe and
Efficacious 12-Month Treatment for Melasma, Cutis, 75:57-62.

Tranggono, R.I., dan Fatma L., 2007, Ilmu Pengetahuan Kosmetik, Penerbit
Pustaka Utama, Jakarta.

Victor, F.C., Gelber J., dan Rao, B., 2004, Melasma: A Review, J Cutan Med and
Surg. 8 (2).

Wood, R. A. N., dan H. Wallin, 1998, Quality in The Food Analysis Laboratory,
The Royal Society of Chemistry, Cambrige.

36
 LAMPIRAN

Lampiran 1: Prosedur penelitian

1. Pembuatan Larutan Baku Asam Retinoat 1000 µg/mL

Asam Retinoat
-Ditimbang 10 mg
-Dimasukkan dalam labu ukur 10 mL
- Dilarutkan dengan larutan metanol sampai tanda tera dan
dihomogenkan

Larutan baku 1000 µg/mL

2. Pembuatan Larutan Asam Retinoat 500 µg/mL

Larutan baku 1000 µg/mL

-Ditimbang 5 mg
-Dimasukkan dalam labu ukur 10 mL
- Dilarutkan dengan larutan metanol sampai tanda tera dan
dihomogenkan

Larutan baku 500 µg/mL

2. Penentuan Panjang Gelombang

Larutan baku 500 µg/mL

- Dipipet 1,5 mL
- Dimasukkan dalam labu ukur 25 mL
- Ditambahkan methanol sampai tanda tera dan
dihomogenkan
Larutan baku 30 µg/mL
- Diukur absorbansinya pada panjang gelombang 200-400
nm

λmaks

37
3. Pembuatan Kurva Baku

Larutan baku 500 µg/mL

- Dipippet 0,5 mL, 1 mL, 1,5 mL, 2 mL, dan 2,5 mL.
- Dimasukkan masing-masing ke dalam labu ukur 25
mL
- Ditambahkan methanol hingga tanda tera
- Dikocok hingga homogen
Larutan kurva standar 10
µg/mL, 20 µg/mL, 30 µg/mL,
40 µg/mL dan 50 µg/mL

4. Preparasi Sampel

Baku asam retinoat

- Ditimbang 3 gram
- Dimasukkan masing-masing ke dalam tabung
sentrifus dan dibungkus dengan aluminium foil
- Ditambahkan 10 mL methanol dan dicampur
menggunakan vortex mixer selama 5 menit
- Didinginkan dalam es selama 15 menit
- Disaring melalui kertas saring Whatman no. 41

Filtrat

- Dimasukkan kedalam labu ukur 50 mL dan

ditambahkan metanol sampai tanda tera dan
dihomogenkan
- Dipipet 2 mL dimasukkan kedalam labu ukur 25 mL,
- Ditambahkan metanol sampai tanda tera dan
dihomogenkan.

Sampel uji

Lampiran 2. Perhitungan Bahan

38
1. Pembuatan Larutan Baku Asam Retinoat 1000 µg/mL
Diketahui : Konsentrasi larutan = 1000 µg/mL

: Volume yang akan dibuat = 10 mL

Ditanyakan : Berapa mg baku asam retinoat yang ditimbang untuk

membuat larutan baku asam retinoat 1000 µg/mL dalam 10 mL

metanol?
Penyelesaian:
berat zat (mg)
Konsentrasi (µg/mL) = volume larutan( mL)

x
1000 µg/mL = 10 mL

x = 10.0000 µg
x = 10 mg
Jadi, diperlukan 10 mg baku asam retinoat untuk membuat larutan baku asam

retinoat 1000 µg/mL dalam 10 mL metanol.

2. Pembuatan Larutan Baku Asam Retinoat 500 µg/mL
Diketahui : Konsentrasi larutan = 500 µg/mL
: Volume yang akan dibuat = 10 mL
Ditanyakan : Berapa mL larutan baku asam retinoat 1000 µg/mL yang dipipet

untuk membuat larutan baku asam retinoat 500 µg/mL dalam 10

mL metanol?
Penyelesaian:

V1 x M1 = V2 x M2

V 2xM2
V1 = M1

10 ml x 500 µg / mL
V1 = 1000 µg /mL

V1 = 5 ml

39
 Jadi diperlukan 5 mL larutan baku asam retinoat 1000 µg/mL yang dipipet

untuk membuat larutan baku asam retinoat 500 µg/mL dalam 10 mL

metanol.

3. Pembuatan Larutan Kurva Baku

Diketahui : Konsentrasi larutan = 500 µg/mL
Ditanyakan : Berapa mL larutan baku asam retinoat 500 µg/mL yang

dipipet untuk membuat larutan baku asam retinoat 10

µg/mL, 20 µg/mL, 30 µg/mL, 40 µg/mL dan 50 µg/mL

dalam 25 mL metanol?
Penyelesaian :
V1 x M1 = V2 x M2
V 2xM2
V1 = M1

a. Konsentrasi 10 µg/mL
25 mL x 10 µg /mL
V1 = 500 µg /mL

V1 = 0,5 mL

b. Konsentrasi 20 µg/mL
25 mL x 20 µg /mL
V1 = 500 µg /mL

V1 = 1 mL

c. Konsentrasi 30 µg/mL
25 mL x 30 µg /mL
V1 = 500 µg /mL

V1 = 1,5 mL

d. Konsentrasi 40 µg/mL

40
 25 mL x 40 µg/mL
V1 = 500 µg /mL

V1 = 2 mL

e. Konsentrasi 50 µg/mL
25 mL x 50 µg /mL
V1 = 50 µg /mL

V1 = 2,5 mL

Jadi untuk membuat larutan baku asam retinoat 10 µg/mL, 20 µg/mL, 30

µg/mL, 40 µg/mL dan 50 µg/mL dalam 25 mL metanol, masing-masing

dipipet larutan baku asam retinoat 500 µg/mL sebanyak 0,5 mL, 1 mL, 1,5

mL, 2 mL, dan 2,5 mL.

41