BAB I

PENDAHULUAN
1.1 Latar Belakang
Suatu jenis koloni mikroba yang terpisah dari koloni campurannya akan
lebih mudah untuk diamati. Mikroba yang ditemukan di suatu lingkungan
ditemukan dalam populasi campuran, sangat jarang sekali yang ditemukan
sebagai satu spesies tunggal. Bakteri adalah kelompok organisme yang tidak
memiliki membran inti sel. Organisme ini termasuk ke dalam domain
prokariota dan berukuran sangat kecil (mikroskopik), serta memiliki peran
besar dalam kehidupan di bumi. Beberapa kelompok bakteri dikenal sebagai
agen penyebab infeksi dan penyakit, sedangkan kelompok lainnya dapat
memberikan manfaat dibidang pangan, pengobatan, dan industri. Struktur sel
bakteri relatif sederhana: tanpa nukleus/inti sel, kerangka sel, dan organel-
organel lain seperti mitokondria dan kloroplas. Hal inilah yang menjadi dasar
perbedaan antara sel prokariot dengan sel eukariot yang lebih kompleks.
Uji biokimia merupakan salah uji yang digunakan untuk menentukan
spesies kuman yang tidak diketahui sebelumnya. Setiap kuman memiliki sifat
biokimia yang berbeda sehingga tahapan uji biokimia ini sangat membantu
proses identifikasi. Setelah sampel diinokulasikan pada media differensial atau
selektif, kemudian koloni kuman diinokulasikan pada media uji biokimia. Ada
12 jenis uji yang sering digunakan dalam uji biokimia walaupun sebenarnya
masih banyak lagi media yang dapat digunakan. Pentingnya dilakukan
praktikum ini adalah untuk melakukan teknik identifikasi dan karakterisasi
jenis bakteri melalui uji biokimia.
Penentuan teknik penyimpanan atau pengawetan mikroba memerlukan
penelitian yang rumit, jangka waktu lama, dan pemantauan, serta dana yang
besar. Hal ini berkaitan dengan tujuan utama preservasi, yaitu (1) mereduksi
atau mengurangi laju metabolisme dari mikroorganisme hingga sekecil
mungkin dengan tetap mempertahankan viabilitas (daya hidupnya) dan (2)
memelihara sebaik mungkin biakan, sehingga diperoleh angka perolehan
 (recovery) dan kehidupan (survival) yang tinggi dengan perubahan ciri-ciri
yang minimum.
1.2 Rumusan Masalah
1. Apa yang dimaksud dengan mikroorganisme?
2. Bagaimana cara uji biokimia pada bakteri?
3. Bagaimana penanganan dan penyimpanan sampel mikroba?
1.3 Tujuan Makalah
Adapun tujuan dari penulisan ini yaitu mahasiswa dapat mengetahui cara
uji biokimia dan bagaimana cara penanganan dan penyimpanan dari sampel
mikroba.
 BAB II
PEMBAHASAN
2.1 Mikroorganisme
Ilmu yang mempelajari mikroorganisme disebut mikrobiologi. Orang-
orang yang bekerja di bidang ini disebut mikrobiolog. Mikroorganisme atau
mikroba adalah organisme yang sangat kecil sehingga untuk mengamati
bantuan sarana yang diperlukan. Mikroorganisme biasanya dianggap
mencakup semua prokariota, protista dan ganggang mikroskopis. Jamur,
terutama kecil dan tidak terbentuk hifa, juga dapat dianggap sebagai bagian,
meskipun banyak yang tidak setuju. Kebanyakan orang beranggapan bahwa
yang dapat dianggap mikroorganisme adalah semua organisme yang sangat
kecil yang dapat dibudidayakan dalam cawan petri atau inkubator di
laboratorium dan mampu mereproduksi dirinya sendiri melalui mitosis.
Mikroorganisme yang berbeda dari sel makrooganisme. Sel
Makroorganisme tidak bisa hidup bebas di alam melainkan menjadi bagian
dari struktur multiselular yang membentuk jaringan, organ dan sistem organ.
Sementara, sebagian besar mikroorganisme dapat menjalankan proses dengan
hidup mandiri, dapat menghasilkan energi sendiri, dan bereproduksi secara
independen tanpa bantuan sel lain.
2.2 Definisi Uji Biokimia Bakteri
Uji biokimia bakteri merupakan suatu cara atau perlakuan yang
dilakukan untuk mengidentifikasi dan mendeterminasi suatu biakan murni
bakteri hasil isolasi melalui sifat - sifat fisiologinya. Proses biokimia erat
kaitannya dengan metabolisme sel, yakni selama reaksi kimiawi yang
dilakukan oleh sel yang menghasilkan energi maupun yang menggunakan
energi untuk sintesis komponen-komponen sel dan untuk kegiatan selular,
seperti pergerakan. Suatu bakteri tidak dapat dideterminasi hanya berdasarkan
sifat-sifat morfologinya saja, sehingga perlu diteliti sifat-sifat biokimia dan
faktor-faktor yang mempengaruhi pertumbuhannya.
Ciri fisiologi ataupun biokimia merupakan kriteria yang amat penting di
dalam identifikasi spesimen bakteri yang tidak dikenal karena secara
 morfologis biakan ataupun sel bakteri yang berbeda dapat tampak serupa,
tanpa hasil pegamatan fisiologis yang memadai mengenai kandungan organik
yang diperiksa maka penentuan spesiesnya tidak mungkin dilakukan.
Karakterisasi dan klasifikasi sebagian mikroorganisme seperti bakteri
berdasarkan pada reaksi enzimatik maupun biokimia. Mikroorganisme dapat
tumbuh pada beberapa tipe media yang memproduksi tipe metabolit yang
dapat dideteksi dengan reaksi antara mikroorganisme dengan reagen test yang
dapat menghasilkan perubahan warna reagen.
2.3 Macam-Macam Uji Biokimia Bakteri
1. Uji Indol
Media yang dipakai adalah pepton 1%. Uji indol digunakan untuk
mengetahui apakah kuman mempunyai enzim triptophanase sehingga
kuman tersebut mampu mengoksidasi asam amino triptophan membentuk
indol. Adanya indol dapat diketahui dengan penambahan reagen
Ehrlich/Kovac’s yang berisi paradimetil amino bensaldehid. Interpretasi
hasil : negatif (-) : Tidak terbentuk lapisan cincin berwarna merah pada
permukaan biakan, artinya bakteri ini tidak membentuk indol dari
triptophan sebagai sumber karbon. Positif (+) : Terbentuk lapisan cincin
berwarna merah pada permukaan biakan, artinya bakteri ini membentuk
indol dari triptophan sebagai sumber karbon.
2. Uji MR
Media yang digunakan adalah pepton glukosa phosphat. Uji ini
digunakan untuk mengetahui adanya fermentasi asam campuran (metilen
glikon). Interpretasi hasil : negatif (-) : Tidak terjadi perubahan warna
media menjadi merah setelah ditambah methyl red 1%. Positif (+) :
Terjadi perubahan warna media menjadi merah setelah ditambahkan
methyl red 1%. Artinya bakteri menghasilkan asam campuran (metilen
glikon) dari proses fermentasi glukosa yang terkandung Dalam media MR
(Cowan,2004).
3. Uji VP
 Media yang dipakai adalah pepton glukosa phosphat. Uji ini
digunakan untuk mengetahui pembentukan asetil metil karbinol (asetoin)
dari hasil fermentasi glukosa. Interpretasi hasil : negatif (-) : tidak terjadi
perubahan warna media menjadi merah setelah ditambahkan a naphtol 5%
dan KOH 40%. Positif (+) : terjadi perubahan warna media menjadi
merah setelah ditambahkan a naphtol 5% dan KOH 40%, artinya hasil
akhir fermentasi bakteri adalah asetil metil karbinol (asetoin)
4. Uji Citrat
Media yang dipakai adalah Simons citrat. Tujuan dari uji ini adalah
untuk mengetahui apakah kuman menggunakan sitrat sebagai sumber
karbon. Pada media Simons citrat berisi indikator BTB (Brom Tymol
Blue). Apabila bakteri menggunakan sitrat sebagai sumber karbon maka
media berubah menjadi basa dan berubah warna menjadi biru. Interpretasi
hasil: negatif (-): tidak terjadinya perubahan warna media dari hijau
menjadi biru. Artinya bakteri ini tidak mempunyai enzim sitrat permease
yaitu enzim spesifik yang membawa sitrat ke dalam sel. Sehingga kuman
tidak menggunakan citra sebagai salah satu/satu-satunya sumber karbon.
Positif (+): terjadinya perubahan warna media dari hijau menjadi biru,
artinya kuman menggunakan citrat sebagai salah satu/satu-satunya sumber
karbon.
5. Uji Motilitas
Media yang dipakai adalah media yang bersifat semi solid dengan
kandungan agar-agar 0,2-0,4%. Tujuan dari uji ini adalah untuk
mengetahui gerak kuman, bisa memakai media MO (Motilitas Ornitin)
atau SIM (Sulfida Indol Motility). Pada media SIM selain untuk melihat
motilitas bisa juga untuk test indol dan pembentukan H2S. Interpretasi
hasil : negatif (-) : terlihat adanya penyebaran yang berwarna putih seperti
akar hanya pada bekas tusukan inokulasi. Positif (+) : terlihat adanya
penyebaran yang berwarna putih seperti akar disekitar inokulasi. Hal ini
menunjukan adanya pergerakan dari bakteri yang diinokulasikan, yang
berarti bahwa bakteri ini memiliki flagel.
6. Uji Urenase
Tujuan dari uji ini adalah untuk mengetahui apakah kuman
mempunyai enzim urease yang dapat menguraikan urea membentuk
amoniak. Media urea berisi indikator phenol red. Interpretasi hasil :
negatif (-) : tidak terjadi perubahan warna media menjadi pink/merah
jambu, artinya kuman tidak memecah urea membentuk amoniak. Positif
(+) : tidak terjadi perubahan warna media menjadi pink/merah jambu,
artinya kuman memecah urea membentuk amoniak.
7. Uji TSIA (Triple Sugar Iron Agar)
Tujuan dari tes ini adalah untuk mengetahui kemampuan kuman
untuk memfermentasikan karbohidrat. Pada media TSIA berisi 3 macam
karbohidrat yaitu glukosa, laktosa dan sukrosa. Indikatornya adalah
phenol red yang menyebabkan perubahan warna dari merah orange
menjadi kuning dalam suasana asam. Glukosa berada di dasar media
sedangkan laktosa dan sukrosa berada di bagian lereng. Selain
menggunakan media TSIA dapat pula digunakan media KIA (Kligers Iron
Agar), bedanya adalah pada media KIA hanya berisi 2 macam karbohidrat
yaitu glukosa dan laktosa. Interpretasi hasil : hanya memfermentasi
glukosa : Bila pada dasar (butt) media berwarna kuning (bersifat asam)
dan lereng (slant) berwarna merah (bersifat basa). Memfermentasi semua
karbohidrat : bila pada dasar (butt) media berwarna kuning (bersifat asam)
dan lereng (slant) berwarna kuning (bersifat asam). Tidak memfermentasi
semua karbohidrat : bila pada dasar (butt) media berwarna merah (bersifat
basa) dan lereng (slant) berwarna merah (bersifat basa).
Fermentasi pada TSIA juga disertai dengan pembentukan gas CO2
yang dapat dilihat dari pecahnya dan terangkatnya agar. Media TSIA juga
dapat digunakan untuk mengetahui pembentukan H2S yaitu melihat
apakah kuman memfermentasi metionin dan sistein (Asam amino yang
mempunyai gugus S). Pada media TSIA terdapat asam amino metionin
dan sistein, jika kuman memfermentasi kedua asam amino ini maka gugus
 S akan keluar dan gugus S akan bergabung dengan H2O membentuk H2S.
Selanjutnya H2S bergabung dengan Fe2+ membentuk warn hitam
8. Uji Gula-Gula
Uji ini digunakan untuk mengetahui apakah kuman memfermentasi
masing-masing gula diatas membentuk asam. Media gula-gula ini terpisah
dalam 5 tabung yang berbeda dan media yang digunakan adalah masing-
masing gula dengan konsentrasi 1% dalam pepton. Masing-masing gula
gula ditambahkan indikator phenol red. Interpretasi hasil : negatif (-) :
tidak terjadi perubahan warna media dari merah menjadi kuning, artinya
kuman tidak memfermentasi gula. Positif (+) : terjadi perubahan warna
media dari merah menjadi kuning. Artinya kuman memfermentasi gula
membentuk ditandai dengan tinta pada tutup kapas yang berbeda-beda.
Untuk glukosa tidak berwarna, laktosa berwarna ungu, maltosa berwarna
merah, manitol berwarna hijau, dan sukrosa berwarna biru. Didalam
media gula- asam, positif + gas (+g) : Terjadi perubahan warna media dari
merah menjadi kuning. Artinya kuman memfermentasi gula membentuk
asam dan gas. Gas yang diperhitungan minimal 10% dari tinggi tabung
durham.
2.4 Penanganan dan Penyimpanan Mikroba
Penyimpanan jangka pendek mikroba dilakukan dengan memindahkan
secara berkala jangka pendek misalnya sebulan sekali dari media lama ke
media baru. Teknik ini memerlukan waktu dan tenaga yang banyak. Beberapa
teknik penyimpanan sederhana yang efektif untuk penyimpanan isolat jangka
pendek atau menengah, dan biasanya tidak sesuai untuk penyimpanan jangka
panjang. Di antara teknik tersebut ialah penyimpanan dalam minyak mineral,
parafin cair, tanah steril, air steril, manik-manik porselin, lempengan gelatin,
dan P2O5 dalam keadaan vakum. Walaupun tidak digunakan secara luas,
teknik tersebut hanya memerlukan peralatan yang sederhana dan mudah
diperoleh, sehingga dapat bermanfaat bagi lembaga yang belum memiliki
peralatan canggih.
 Metode penyimpanan jangka panjang yang paling efektif dan banyak
dilakukan ialah metode liofilisasi atau kering beku (liophylization atau freeze
drying) dan kriopreser-vasi (cryopreservation atau cryoge-nic preservation).
Kedua teknik tersebut dilaporkan paling berhasil untuk penyimpanan jangka
panjang berbagai mikroba. Kendala utamanya adalah tidak semua
laboratorium mempunyai peralatan tersebut.
1. Peremajaan Berkala
Peremajaan dengan cara memindahkan atau memperbarui biakan
mikroba dari biakan lama ke medium tumbuh yang baru secara berkala,
misalnya sebulan atau dua bulan sekali. Teknik ini meru-pakan cara paling
tradisional yang digunakan peneliti untuk memeli-hara koleksi isolat
mikroba di laboratorium. Cara ini juga digunakan untuk penyimpanan dan
pemeliha-raan isolat mikroba yang belum di-ketahui cara penyimpanan
jangka panjangnya. Peremajaan berkala tidak dianjurkan untuk
penyimpanan jangka panjang. Teknik ini mempunyai berbagai kendala, di
antaranya (1) kemungkinan terjadi perubahan genetik melalui seleksi
varian, (2) peluang terjadinya kontaminasi, dan (3) terjadi kekeliruan
pemberian label. Kendala tersebut memberi peluang yang lebih besar
terjadinya kehilangan isolat dibandingkan dengan teknik lain.
2. Penyimpanan dalam Aquades Steril
Beberapa jenis bakteri, terutama yang berbentuk batang dan bereaksi
Gram negatif seperti Pseudomonas dapat disimpan cukup lama dalam
akuades steril pada suhu ruang atau suhu 10-150 C. Tidak semua bakteri
dapat disimpan dengan baik menggunakan cara ini, misalnya pada anggota
genus Pseudomonas, Agrobacterium, dan Curtobacterium. Pada kondisi
penyimpanan ini bakteri yang disimpan masih berpeluang tumbuh dengan
lambat, sehingga tidak dapat dijamin stabilitas genetiknya untuk jangka
panjang. Penyimpanan dengan cara ini juga memungkinkan terjadinya
kontaminasi. Oleh karena itu, cara ini lebih dianjurkan sebagai alternatif
penyimpanan jangka sedang atau sebagai pendamping penyimpanan
jangka panjang.
3. Penyimpanan dalam Minyak Mineral
Memelihara biakan bakteri, khamir dan jamur adalah dengan cara
menyimpan dalam tabung agar miring dan menutup dengan minyak
mineral atau parafin cair. Dasar teknik penyimpanan ini adalah
mempertahankan viabilitas mikroba dengan mencegah pengeringan
medium, sehingga waktu pere-majaan dapat diperpanjang hingga beberapa
tahun. Beberapa jenis jamur dapat bertahan hidup sampai 20 tahun. Daya
tahan hidup mikroba lebih baik apabila biakan disim-pan pada suhu kulkas
(4o C).
Mikroba yang akan dipelihara ditumbuhkan pada tabung berisi
medium agar miring atau medium cair (broth) yang sesuai, kemudian
permukaan biakan ditutup dengan minyak mineral steril setinggi 10-20
mm dari permukaan atas medium. Teknik ini sederhana, tetapi kurang
praktis untuk ditransportasi. Di samping itu, keberadaan minyak mineral
mengakibatkan peremajaan menjadi kotor.
4. Penyimpanan dalam Tanah Steril
Banyak bakteri dan jamur yang dapat bertahan hidup dengan baik
pada tanah kering yang disimpan pada suhu ruang untuk waktu yang lama,
hingga 20 tahun atau lebih. Teknik penyimpanan mikroba pada tanah
kering terutama berguna untuk fungi, Streptomyces spp., dan bakteri yang
membentuk spora seperti Bacillus spp. dan Clostridium spp. Rhizobium
spp. juga dapat disimpan dengan baik dengan cara ini. Teknik ini
mempunyai beberapa keuntungan, yaitu biaya murah, penyimpanan pada
suhu ruang, dan stabilitas genetik mikroba dapat dipertahankan.
5. Penyimpanan dengan Manik-Manik Porselin
Cara sederhana lain untuk pemeliharaan berbagai jenis mikroba adalah
mengeringkan suspensi sel pada manik-manik porselin (porcelain beads)
atau gelas (glass beads) menggunakan gel silika sebagai pengering. Selapis
gel silika diletakkan di alas botol dengan tutup berdrat, kemudian di
atasnya ditutup dengan lapisan kapas atau slag wool dan di atasnya
diletakkan manik-manik porselin atau kaca yang diimpregnasi dan telah
 dicelupkan dalam suspensi mikroba yang akan disimpan. Kelembaban
yang ada pada manik-manik diserap oleh gel silika yang ada di bawahnya.
Kelebihan gel silika juga berfungsi menjaga kekeringan udara di dalam
botol.
6. Penyimpanan Menggunakan Lempengan Gelatin
Teknik penyimpanan ini sederhana, tetapi sangat efektif untuk
penyimpanan bakteri. Mula-mula teknik ini dilaporkan oleh Stamp pada
tahun 1947 untuk penyimpanan jangka panjang bakteri. Tetapi saat ini sa
ngat sedikit data tentang keefektifan penyimpanan dan daya tahan hidup
bakteri dalam penyimpanan, sehingga teknik ini perlu diuji lebih lanjut.
7. Penyimpanan Menggunakan Potongan Kertas Filter
Teknik penyimpanan ini mirip teknik penyimpanan dengan
lempengan gelatin. Sebagai pengganti lempengan gelatin digunakan
bundaran potongan kertas filter steril. Teknik ini juga sederhana dan
mudah, tetapi sangat efektif untuk penyimpanan bakteri. Namun demikian,
data tentang keefektifan penyimpanan dan daya tahan hidup bakteri dalam
penyimpanan masih sedikit, sehingga perlu diteliti lebih lanjut.
8. Penyimpanan dengan Teknik Kering Beku
Teknik kering beku atau teknik liofilisasi merupakan teknik
penyimpanan yang paling populer dan banyak digunakan untuk
penyimpanan jangka panjang mikroba. Teknik ini cocok untuk menyimpan
berbagai jenis mikroorganisme termasuk virus, bakteri, khamir, jamur
berspora dan jamur yang tidak berspora, bahkan algae dan protozoa. Bagi
lembaga koleksi dan pemasok biakan mikroba, teknik ini juga sangat
sesuai, karena ampul dalam jumlah besar dapat diproduksi dan dengan
mudah disebarluaskan. Banyak biakan mikroba yang disimpan dengan
cara ini dapat bertahan hidup hingga puluhan tahun, tetapi beberapa
mikroba memerlukan media pengawet tertentu yang sesuai.
9. Penyimpanan dengan Teknik Pengeringan Cairan
Beberapa strain bakteri yang peka terhadap proses kering beku dapat
disimpan dengan cara pengeringan suspensi (liquid drying) mikroba.
 Teknik ini dikembangkan oleh Annear pada tahun 1954, 1956, dan 1962
(Sly, 1983) dan berhasil di-gunakan untuk menyimpan bakteri, khamir,
jamur, dan virus. Teknik ini dimodifikasi oleh Banno dan Saka-ne (1979).
Keefektifan teknik ini untuk penyimpanan khamir dibukti-kan oleh Banno
et al. (1979).
10. Penyimpanan Secara Kriogenik
Virus, bakteriofah, khamir, jamur, beberapa jenis algae, dan protozoa
dapat disimpan lama dalam kondisi beku dengan cara mereduksi sebagian
besar aktivitas atau kecepatan metabolismenya. Mikroba tersebut telah
disimpan dalam freezer yang bersuhu -20o C dan -70o C. Semakin rendah
suhu penyimpanan, semakin kecil peluang kehilangan viabilitasnya.
Penyimpanan pada suhu lebih tinggi dari -70o C sebaiknya tidak terlalu
lama dilakukan, paling lama setahun.
2.5 Syarat Penyimpanan Mikroba
1. Tiap isolat biakan paling sedikit dibuat lima duplikat, tetapi semakin
banyak semakin baik, sehingga pengujian viabilitas dapat dilakukan lebih
leluasa.
2. Pemberian label yang jelas, tidak mudah hilang, untuk memu-dahkan
pelacakan data.
3. Pengecekan rutin tidak hanya untuk menguji viabilitas, tetapi juga
stabilitas genetik, terutama virulensinya.
4. Pembuatan database dari koleksi isolat mutlak diperlukan.
 BAB III
PENUTUP
3.1 Kesimpulan
Uji biokimia yang digunakan untuk mengidentifikasi bakteri dapat dilihat
bahwa tiap jenis bakteri dapat mengekspresikan atau menunjukkan
karakternya tersendiri jika dilakukan berbagai macam uji misalnya dalam uji
reduksi nitrat yang menghasilkan warna merah dan terbentuknya gumpalan
jadi bakteri tersebut dapat mereduksi nitrat
Penyimpanan mikroba memiliki syarat-syarat tertentu serta ada berbagai
macam penyimpanan mikroba.
 DAFTAR PUSTAKA
Gandasoebrata R. 2004. Penuntun Laboratorium Klinik. Jakarta : Dian Rakyat.

Machmud, Muhammad. 2001. Teknik Penyimpanan dan Pemeliharaan Mikroba.

Balai Penelitian Bioteknologi Tanaman Pangan, Bogor. VOL 4, NO. 1

Misnadiarly., dan Husjain Djajaningrat. 2014. Mikrobiologi untuk Klinik dan

Laboratorium. Jakarta : Rineka Cipta.