TUGAS METODOLOGI PENELITIAN

MENGARTIKAN JURNAL INTERNASIONAL

“Norepinephrine Transporter (NET) is Expressed in Cardiac Sympathetic
Ganglia of Adult Rat”

PRAMUDIA WARDANI 152210101003

DOSEN : Prof. Drs. Bambang Kuswandi, M.Sc, PhD

UNIVERSITAS JEMBER
2019
 Pengekspresian Norepinefrin Transporter (NET) dalam Ganglia
Simpatis Jantung Tikus Dewasa
Sistem saraf simpatis (SNS) memainkan peran penting dalam mengatur fungsi jantung
baik dalam kesehatan maupun penyakit melalui pelepasan neurotransmitter norepinefrin (NE).
Dalam sistem saraf pusat (SSP), neurotransmisi NE diakhiri melalui reuptake
neurotransmitter yang dilepaskan oleh Na+, transporter norepinefrin Cl-dependent (NET) pada
membran pra-sinaptik (Amara, 1993; Blakely, Felice and Hartzell, 1994). Meskipun serapan
NE dipelajari dengan baik di hati, tetapi dasar molekuler untuk itu masih kurang jelas
(Ganguly et al., no date; Scientific et al., 1990; Nozawa et al., 1998). Peneltian menunjukkan
bahwa mereka tidak dapat mendeteksi mRNA spesifik NET dalam miokardium yang
diselidiki (FEI et al., 2006). Mereka menyatakan bahwa protein transporter norepinefrin dapat
disintesis dalam sel neuronal yang terletak jauh dari jantung dan kemudian diangkut ke saraf
jantung yang berakhir melalui transpor akson. Dalam penelitian ini, kami membuktikan
bahwa NET diekspresikan di kompleks ganglion stellat-serviks tengah (MC-SG) tikus dan
juga menunjukkan bahwa tingkat ekspresi NET yang berbeda antara ganglion kiri dan kanan.
MATERIAL DAN METODE
Binatang
Tikus Sprague-Dawley jantan dengan berat 180-200 g. Setelah masa aklimatisasi, tikus
dikorbankan dan mengisolasi MC-SG kompleks dan bagian miokardium ventrikel kiri dengan
cepat. Kemudian segera dibekukan dalam nitrogen cair dan disimpan pada suhu -70oC.
Persiapan Ekstraksi RNA dan cDNA
Total RNA yang diekstraksi dari MC-SG kompleks dan miokardium ventrikel kiri
menggunakan TRIzol (GIBCO). Setelah perawatan alikuot RNA akhir dengan DNase I untuk
menghilangkan kontaminasi DNA genom, 1 μg dari RNA digunakan untuk transkripsi balik
(RT) menjadi cDNA dengan M-MLV (GIBCO).
Kloning PCR dari NET tikus
Reaksi PCR dilakukan sebanyak 35 siklus pada 94oC selama 1 menit, 65oC selama 1 menit,
dan 72oC selama 3 menit. Kemudia, produk dianalisis pada gel agarosa 1,8%. Pita DNA yang
telah dimurnikan kemudian dikloning menjadi pBluscript KS dan diurutkan dengan metode
dideoxynucleotide.
Analisis Northern blot dari NET
Produk PCR dari NET diberi label dengan 32p-dATP dan digunakan sebagai probe untuk
Northern blot. 12 mg RNA total dari ganglia (n = 5) dan miokardium LV (n = 5) dimasukkan
dalam gel agarose-formaldehyde 1% dan dipindahkan ke membran Hybond-N (Amersham
Co). Pra-hibridisasi dan hibridisasi dilakukan sesuai dengan metode standar dengan probe
NET. Setelah hibridisasi, membran dicuci dua kali dalam 2xSSC pada suhu kamar, sekali
dalam 1xSSC pada 42oC selama 20 menit, kemudian 20 menit dalam 0,1xSSC pada 65oC.
Setelah paparan autoradiografi, membran dilucuti dan hibridisasi ulang dengan probe cDNA
b-aktin berlabel 32P. Sinyal hibridisasi pita spesifik NET diukur dengan densitometri, dan
dinormalisasi dengan sinyal hibridisasi yang sesuai dari β-aktin untuk memperbaiki perbedaan
dalam pemuatan dan transfer.
RESULTS
Transporter neurotransmitter memainkan peran penting dalam mengendalikan
transmisi sinyal saraf, disfungsi dalam ekspresi gen transporter neurotransmitter dapat
menyebabkan penyakit yang berbeda (Fei, 2001). Untuk menentukan apakah NET
diekspresikan dalam sistem simpatis jantung, RT-PCR dilakukan dari total RNA miokardium
tikus dan ganglia simpatis jantung. Gambar 1 menunjukkan bahwa produk PCR dalam ukuran
yang diinginkan diperoleh dari MC-SG diamplifikasi dengan primer NET.

Produk merupakan gel yang telah dipurifikasi dan dikloning dan telah diurutkan
sebagian. Hal ini identik dengan urutan yang diharapkan dalam NET (data urutan tidak
ditampilkan). Sebaliknya, tidak ada pita spesifik yang dapat diamplifikasi dari miokardium
tikus (n = 3), walaupun b-aktin sebagai kontrol sama-sama ada pada semua cDNA. Untuk
menentukan adanya perbedaan dalam ekspresi NET mRNA di kiri dan kanan MC-SG,
dilakukan pengujian Northern blot. Gambar 2 menunjukkan bahwa tingkat NET mRNA di
sebelah kanan adalah 2,2 kali lebih tinggi daripada di sebelah kiri (p = 0,01, n = 5).

SNS mengatur fungsi organ efektor dengan melepaskan neurotransmitter NE (Esler,

1990). Transmiter yang dilepaskan berikatan dengan reseptor pada membran postsinaptik
melalui difusi, di mana sinyal ditransmisikan. Setelah itu, NE harus segera dihilangkan dari
celah sinaptik. Dalam CNS, hal ini dikerjakan oleh protein membran plasma dari transporter
NE-dependen natrium (NET) yang telah dikloning sebelumnya (Pacholczyk, 1991). Namun,
mekanisme pengambilan NE dalam sistem jantung tidak jelas.
 Penelitian terbaru dari Ungerer dan kawan-kawan melaporkan bahwa mereka tidak
dapat mendeteksi ekspresi NET mRNA dalam miokardium. Oleh karena itu, dapat
diasumsikan bahwa NET mRNA mungkin diekspresikan, jika terdapat di soma sel neuron,
yang terletak agak jauh dari jantung. Selanjutnya, Matsuoka, dan kawan-kawan juga
menunjukkan tingkat tinggi NET mRNA di kultur ganglia serviks superior (SCG) (Matsuoka,
Kumagai and Kurihara, 1997). Atas kerja mereka, kami menyelidiki ekspresi NET dalam
sistem saraf simpatis jantung, percobaan ini dengan jelas menunjukkan bahwa ekspresi NET
mRNA terlihat di kompleks MC-SG tetapi tidak di miokardium. Hasil ini mendukung
pendapat bahwa sistem pengambilan NE dalam miokardium dibentuk oleh NET yang dibawa
jauh dari jantung dan juga menunjukkan bahwa SNS dalam jantung memiliki mekanisme
pengaturan konsentrasi NE yang sama dengan CNS. Informasi ini mungkin berguna untuk
pengembangan obat baru yang menargetkan NET untuk pengobatan penyakit jantung.
Ganglia simpatis jantung tikus adalah MCSG. Hal ini dibuktikan dengan eksperimen
pelacak retrograde. Persarafan terutama ipsilateral (sekitar 60%) dengan kontribusi
kontralateral yang signifikan (Scientific et al., 1990; Pardini, Lund and Schmid, 1989).
Penelitian sebelumnya memberikan saran bahwa saraf simpatis jantung kanan dan kiri
mungkin memiliki efek yang berbeda dan spesifik pada rangsangan jantung (Brown, 1976;
Stone et al., 1976). Serat postganglionik dari ganglia stellata kanan (RSG) memainkan peran
yang lebih penting daripada serat dari ganglia stellata kiri (LSG) dalam mempertahankan
kekuatan kontraktil, terutama denyut jantung. Pelemahan detak jantung secara tidak teratur
diamati ketika ganglia stellate kanan (RSG) terganggu, tetapi ganglionektomi stellate kiri
(LSG) tidak terdapat efek pada iregularitas interval jantung. Dimana LSG dianggap mampu
mempengaruhi inotropisme jantung daripada kronotropisme (Lipsitz et al., 1997). MIBG
(metaiodobenzylguanidine) diperkirakan memiliki mekanisme untuk membagi jumlah
serapan, penyimpanan, dan mekanisme pelepasan yang sama dengan NE pada terminal saraf
adrenergik (Glowniak et al., 1993). Nozawa dan rekan melaporkan bahwa jumlah serapan
dan akumulasi MIBG lebih besar pada miokardium ventrikel kanan daripada di kiri pada tikus
(Nozawa et al., 1998). Dalam percobaan kami, menunjukkan bahwa ekspresi NET lebih
tinggi pada ganglia simpatis jantung kanan tikus dewasa. Hasil ini memberikan bukti biologis
molekuler untuk menjelaskan perbedaan antara RSG dan LSG dan untuk kapasitas yang lebih
besar dari pengambilan NE dari miokardium kanan atau kiri.
 Daftar Pustaka
Amara, S. G. (1993) ‘Neurotransmitter Transporters ’:, pp. 73–93.
Blakely, R. D., Felice, L. J. D. E. and Hartzell, H. C. (1994) ‘Molecular Physiology of
Norepinephrine and Serotonin Transporters’, 281, pp. 263–281.
Brown, A. M. (1976) ‘Experimental Effects of Unilateral Ventricular Cardiac Sympathetic
Threshold Denervation on the Fibrillation’, 37(June), pp. 1034–1040.
Esler, Murray. et al. (1990). 'Overflow of Catecholamine Neurotransmitters to the
Circulation : Source, Fate, and Functions'. (2018), 70(4).
Fei, J. (2001) ‘Overexpression of -Aminobutyric Acid Transporter Subtype I Leads to
Susceptibility to Kainic Acid-Induced Seizure in Transgenic Mice Overexpression of
Γ -Aminobutyric Acid Transporter Subtype I Leads to Susceptibility to Kainic Acid-
Induced Seizure in Transgenic Mice’, (April 2014). doi: 10.1038/sj.cr.7290067.
FEI, J. et al. (2006) ‘Norepinephrine Transporter (NET) is Expressed in Cardiac Sympathetic
Ganglia of Adult Rat’, Cell Research, 11(4), pp. 317–320. doi: 10.1038/sj.cr.7290102.
Ganguly, P. K. et al. (no date) ‘Differential Changes in Sympathetic Activity in Left and
Right Ventricles in Congestive Heart Failure After Myocardial Infarction’, pp. 340–
345.
Glowniak, J. V et al. (1993) ‘Evaluation of Metaiodobenzylguanidine Uptake by the
Norepinephrine, Dopamine and Serotonin Transporters’, (May 2018).
Lipsitz, L. A. et al. (1997) ‘Preliminary Evidence for The Evolution in Complexity of Heart
Rate Dynamics During Autonomic Maturation in Neonatal Swine’, pp. 1–9.
Matsuoka, I., Kumagai, M. and Kurihara, K. (1997) ‘Differential and Coordinated Regulation
of Expression of Norepinephrine Transporter in Catecholaminergic Cells in Culture’,
Brain Research, 776(1–2), pp. 181–188. doi: 10.1016/S0006-8993(97)01016-0.
Nozawa, T. et al. (1998) ‘Dual-Tracer Assessment of Coupling Between Cardiac Sympathetic
Neuronal Function and Downregulation of g-Receptors During Development of
Hypertensive Heart Failure of Rats’.
Pardini, B. J., Lund, D. D. and Schmid, P. G. (1989) ‘Organization of The Sympathetic
Postganglionic Innervation of The Rat Heart’, 28, pp. 193–201.
Pacholczyk, Tadeusz. Blakely, R. D., Amara, S. G., (1991). 'Expression Cloning of A Cocaine
and Antidepressant-Sensitive Human Noradrenaline Transporter'.
Scientific, E. et al. (1990) ‘Innervation Patterns of The Middle Cervical- Stellate Ganglion
Complex in The Rat’, 117, pp. 300–306.
Stone, H. L. et al. (1976) ‘Experimental and Laboratory Reports’, 92(5), pp. 589–599.