Universitas Indonesia

Tugas Resume II

Using the Aggregation of Latex Polymers in the Fabrication

of Reproducible Enzyme Electrodes

Oleh :
Andriyani Budi Listyo
1806242296

Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam

Program Studi Pascasarjana Ilmu Kimia
Universitas Indonesia
Depok
2019
I. Pendahuluan
Matriks imobilisasi untuk pembuatan elektroda enzim harus mempertahankan enzim
yang berdekatan dengan permukaan elektroda, yang dapat menstabilkan enzim, inert
terhadap reaksi enzim, stabil secara termal dan kimiawi, biokompatibel, dapat
mengecualikan spesies yang mengganggu tetapi memungkinkan substrat dan kosubstrat
untuk melewati dengan mudah ke dalam matriks dan dapat disimpan secara reproduktif pada
matriks permukaan elektroda dengan metode deposisi yang kompatibel dengan metode
pembuatan massal. Matriks imobilisasi yang sedang dikembangkan yaitu dengan
penggunaan film koloid polimer. Lateks ini terdiri dari suspensi koloid dari partikel polimer,
berukuran 102 nm, distabilkan oleh surfaktan ionik dan / atau polimerik, dan biasanya
dihasilkan oleh proses polimerisasi radikal bebas heterogen yang dikenal sebagai
polimerisasi emulsi. Kontrol yang sangat baik atas proses polimerisasi radikal yang diberikan
oleh teknik ini (termasuk metode baru menggunakan polimerisasi radikal terkontrol )
memberikan potensi untuk sintesis polimer emulsi untuk imobilisasi enzim.
Pengembangan polimer lateks untuk imobilisasi enzim menunjukkan bahwa
imobilisasi enzim dengan aktivitas yang baik menggunakan mikroenkapsulasi dalam
lingkungan biokompatibilitas dengan cara adsorpsi ke partikel lateks melalui hubungan
silang dengan butiran lateks polystyrene atau dengan perlekatan kovalen ke lateks.

Kelemahan utama polimer lateks untuk pembuatan elektroda enzim muncul pada
pelapisan drop yaitu teknik dengan volume suspensi enzim tertentu yang mengandung lateks
dilapiskan pada permukaan elektroda dan kemudian dikeringkan. Metode terbaru deposisi
film polimer yang dimodifikasi enzim pada permukaan elektroda dapat memberikan film
polimer yang dapat direproduksi dan yang kompatibel dibuat dengan massal. Pendekatan
baru ini adalah untuk membekukan lapisan enzim ke permukaan elektroda dengan metode
yang mirip dengan yang biasa digunakan dalam pembuatan barang-barang karet seperti
sarung tangan dan kondom. Efek waktu koagulasi enzim-polimer terhadap sensitivitas,
rentang dinamis dan reproduktifitas elektroda enzim yang dihasilkan dan stabilitas biosensor
akan dibahas lebih mendalam.

II. Eksperimental
a. Alat dan bahan
Lateks dibuat dengan prosedur polimerisasi emulsi konvensional dengan campuran
monomer (butil akrilat dan metil metakrilat dalam proporsi equimolar) yang akan
menghasilkan polimer pada suhu kamar yang distabilkan oleh surfaktan anionik dan
penstabil elektrosterik yang berasal dari poli (akrilik) AC id. Sejumlah ekivalen butil akrilat
dan metil metakrilat (35% berat, keduanya dari Aldrich, disaring melalui alumina dasar, dan
didistilasi di bawah tekanan yang berkurang pada sekitar 70ºC sebelum digunakan), 6,1%
dari asam akrilat, 65 mM AMA-80 (natrium diheksil sulfosuksinat, Cyanamid) sebagai
surfaktan, 6,7 mM potassium persulfate sebagai inisiator, suhu polimerisasi 55ºC. MMA dan
BA, kemudian diberikan lebih dari 3 jam. Prosedur ini menghasilkan lateks yang terdiri atas
23,7% padatan dengan ukuran partikel berdiameter 153,3 nm yang diukur dengan
spektroskopi korelasi foton pada pH 2 (jari-jari hidrodinamik dari lateks yang distabilkan
secara elektrosterik bervariasi dengan pH).

Glukosa oksidase (E.C. 1.1.3.4) dari Aspergillus niger (tipe VII-S), -glukosa, 1-etil-
3 (3-dimetilaminopropil) -carbodiimide hydrochloride (EDC), N-hydroxysuccinimide
(NHS) Larutan buffer fosfat yang mengandung 0,05 M KH2PO4 dan 0,05 M KCl sebagai
elektrolit pendukung , pH dosesuikan 5,5 ± 7,0 dengan penambahan larutan K2HPO4. Reagen
kopling adalah 0,015M EDC dan 0,03M NHS dalam larutan buffer fosfat (pH 5,5). Larutan
stok glukosa dilarutkan dalam larutan buffer dan dibiarkan mutarotate selama 24 jam pada
suhu 4 ºC sebelum digunakan.
Semua pengukuran amperometrik dilakukan dalam sel tiga elektroda menggunakan
potentiostat BAS 100 B (Sistem Bioanalitik, W. Lafayette, IN). Elektroda piringan platinum
komersial (BAS) dengan luas 0,017 cm2 digunakan sebagai elektroda kerja, elektroda
referensi adalah Ag / AgCl dari BAS dan bendera platinum buatan sendiri (1 cm x 1 cm)
digunakan sebagai elektroda tambahan
b. Prosedur

Suspensi lateks dicampur dengan larutan buffer dan etanol sebagai koagulan dengan
perbandingan masing-masing 1: 2,5: 0,5. Tekniknya dengan cara menggumpalkan lateks
karet ke dalam cetakan untuk membentuk film yang seragam dengan sifat penghalang yang
baik. Campuran ini disimpan dalam rendaman ultrasonik selama satu jam untuk memastikan
lateks terdispersi dengan baik dan kemudian diatur hingga pH 5,5 dengan penambahan asam
klorida atau larutan natrium hidroksida. Selanjutnya sejumlah glukosa oksidase (GOx)
ditambahkan (biasanya 5 mg / mL larutan lateks) dan dicampur secara menyeluruh. Elektroda
piringan platina yang bersih dicelupkan ke dalam suspensi GOx-lateks untuk sementara
waktu (antara 1 menit dan 1 jam) untuk memungkinkan koagulasi suspensi pada permukaan
elektroda. Elektroda kemudian dibilas dengan larutan buffer dan dikeringkan pada suhu
kamar, yang mengarah ke pembentukan film. Dalam proses ini enzim diimobilisasi dijebak
dalam polimer. Untuk mencegah enzim keluar dari film lateks, glukosa oksidase yang
terperangkap secara kovalen melekat pada kelompok karboksil dari kerangka polimer
menggunakan 0,015 M EDC dan 0,03 M larutan penyangga fosfat NHSin (pH 5,5) selama
satu jam. EDC dan NHS mengubah gugus asam karboksilat dari asam akrilat polimer menjadi
ester suksinimida yang rentan terhadap serangan nukleofilik dari amina. Dengan film lateks
yang dimodifikasi oleh enzim, gugus amina bebas pada rantai lisin enzim menyediakan
nukleofil, yang secara kovalen menempelkan enzim ke polimer dengan ikatan peptida. Cara
ini dapat meningkatkan stabilitas polimer yang dimodifikasi enzim untuk aplikasi elektroda
enzim. Pengukuran amperometrik menggunakan elektroda yang dimodifikasi enzim
dilakukan dalam larutan buffer fosfat pada suhu kamar. Dalam oksidasi glukosa oleh GOx,
dengan regenerasi enzim oleh oksigen, glukololakton dan hidrogen peroksida diproduksi.
Hidrogen peroksida dioksidasi pada elektroda platinum yang bias menjadi + 0,65V versus
Ag/AgCl. Arus sebanding dengan konsentrasi glukosa dalam larutan. Dalam percobaan uji
yang dilakukan dalam penelitian ini, arus steady state diukur sebagai fungsi konsentrasi
glukosa

III. Hasil dan pembahasan

1. Respon elektroda terhadap glukosa
Polimer teragregasi pada permukaan elektroda dengan aktivitas enzim yang ditahan.
Arus steady state dicapai dalam dua menit setelah menyuntikkan larutan glukosa buffer.
Sensitivitas (Tabel 1) merupakan urutan besarnya lebih rendah dari elektroda enzim
lainnya dengan glukosa oksidase diimobilisasi melalui polimer lateks. Namun, rentang
dinamis dari membran enzim-enzim yang terkoagulasi secara signifikan lebih luas
daripada yang diamati sebelumnya, menanggapi perubahan konsentrasi glukosa hingga
100 mM. Karena rentang dinamis dari elektroda enzim paling sering dibatasi oleh suplai
oksigen kosubstrate, rentang dinamis luas menunjukkan kelarutan yang baik dan / atau
akses oksigen dalam polimer.
2.Efek waktu Koagulasi pada respon elektroda Enzim
Variasi waktu pada metode koagulasi berfungsi untuk mengendalikan ketebalan
lapisan enzim. Elektroda enzim bergantung pada kosubstrate (oksigen) dan mengikuti
mekanisme Ping-pong yakni respon elektroda enzim tergantung pada aktivitas katalitik
relatif, yang dapat dinyatakan dalam kuantitas tak berdimensi, modulus Thiele, Ø0, di mana

k2 adalah konstanta laju untuk disosiasi kompleks substrat enzim ke produk, [Etot]
adalah konsentrasi enzim dalam elektroda, d adalah ketebalan membran enzim, D0 adalah
koefisien difusi oksigen kosubstrat dalam membran enzim, K0 adalah koefisien partisi
oksigen antara larutan dan membran dan C0 adalah konsentrasi massal dari kosubstrat. Ø0
menggambarkan persaingan antara reaksi dan difusi. Ketika Ø0 rendah (<<1) respons
sensor dibatasi oleh kinetika enzim, dan ketika Ø0 besar (>>1) keterbatasan transpor
menjadi dominan.
 Untuk jenis polimer tertentu dua parameter yang dikontrol adalah ketebalan lapisan
enzim dan jumlah enzim yang diimobilisasi. Peningkatan waktu koagulasi akan
meningkatkan dalam ketebalan lapisan enzim dan pemuatan enzim sehingga meningkat Ø.
Respons elektroda enzim dengan waktu koagulasi berbeda ditunjukkan pada Gambar 1
sedangkan karakteristik elektroda tersaji pada Tabel 1.
Peningkatan sensitivitas diikuti oleh penurunan dengan peningkatan aktivitas
katalitik membran enzim. Dalam film tipis dengan akses oksigen yang baik, biosensor
terbatas oleh kinetika reaksi enzim. Substrat dan oksigen terletak di seluruh lapisan enzim
dan reaksi enzim terjadi di dalam seluruh lapisan polimer. Dengan waktu koagulasi yang
lebih besar (ketebalan film) ada lebih banyak enzim di seluruh lapisan untuk bereaksi
dengan analit sehingga menyebabkan arus meningkat. Pada akhirnya transportasi substrat
atau co-substrat menjadi terbatas. Setelah arus menjadi terbatas transport, reaksi enzim
tidak lagi meluas ke seluruh lapisan enzim. Semakin tinggi aktivitas katalitik lapisan enzim,
semakin kompak zona reaksi ini pada antarmuka ini. Hasilnya adalah fluks hidrogen
peroksida yang lebih kecil ke elektroda dan lebih banyak hidrogen peroksida yang hilang
karenanya arus lebih kecil.
 Variasi arus pada Gambar 1 menunjukkan bahwa waktu koagulasi dapat digunakan
untuk menyesuaikan respons elektroda enzim yang dibuat dengan cara ini. Namun, untuk
metode koagulasi menjadi pendekatan yang layak untuk membuat enzim elektroda
membutuhkan membran enzim yang akan disimpan secara reproduktif. Reproduksibilitas
untuk membran enzim yang diendapkan dengan 5 menit waktu koagulasi adalah 5,7% dan
reproduktifitas untuk waktu koagulasi lainnya dirangkum dalam Tabel 1. Reproduktifitas
dengan waktu koagulasi lima menit secara signifikan lebih baik daripada waktu koagulasi
lainnya. Dihipotesiskan bahwa dengan waktu koagulasi yang lebih lama agregasi pada
permukaan elektroda menjadi lebih rentan terhadap variasi suhu dan konveksi alami
sementara dengan variasi waktu koagulasi yang lebih pendek pada permukaan elektroda
memiliki efek yang lebih signifikan.
3.Stabilitas
Stabilitas elektroda enzim-lateks dilakukan dengan disimpan dalam 0,05 M larutan
buffer fosfat pH 7,0 pada temperatur 4ºC. Evaluasi stabilitas menggunakan elektroda enzim
yang dibuat dengan waktu koagulasi 15 menit. Gambar 3 menunjukkan pengukuran plot
kalibrasi menggunakan elektroda yang sama selama 35 hari. Di antara hari pertama dan
kedua hilangnya aktivitas yang cepat (kehilangan 16%) dimana ada penurunan bertahap
yang lebih besar. Penurunan cepat awalnya diikuti oleh penurunan bertahap lebih banyak
untuk membran enzim lateks. Penurunan awalyang cepat dikaitkan dengan hilangnya
enzim yang tidak terikat secara kovalen, sedangkan penurunan yang lebih bertahap
mewakili degradasi polimer saat melewati siklus pembasahan untuk pengukuran diikuti
dengan pengeringan selama penyimpanan. Strain yang dihasilkan oleh pembasahan
berulang dan pengeringan membran enzim metakrilat diusulkan sebagai penyebab
hilangnya kinerja elektroda daripada hilangnya aktivitas enzimatik.
IV. Kesimpulan
Metode pembuatan film lateks tipis dengan mencelupkan objek ke dalam larutan
koagulasi dapat digunakan untuk membuat elektroda enzim yang dapat direproduksi. Metode
fabrikasi ini menggunakan agregasi lateks dan perangkap enzim. Partikel lateks yang
distabilkan secara elektro yang disintesis oleh polimerisasi emulsi dalam batch dari asam
akrilat, metil metakrilat dan butil akrilat, dan glukosa oksidase dikoagulasi bersama pada pH
5,5 dalam etanol. Elektroda piringan platina yang dicelupkan ke dalam larutan menjadi
dilapisi dengan lateks / enzim. Ketebalan relatif film dan jumlah relatif enzim dapat dikontrol
pada saat elektroda bersentuhan dengan larutan. Enzim kemudian diimobilisasi dengan
perlekatan kovalen gugus amina ke gugus karboksilat dalam polimer menggunakan 1-etil-3
(3-dimetilaminopropil) karbodiimida hidroklorida dan N hidroksisuksinimid. Interaksi
selama lima menit dengan larutan lateks/enzim dan kopling amida berikutnya, memberikan
elektroda dengan reproduktifitas 5,7% RSD, rentang dinamis luas (0 ± 100 mM) dan sifat
penyimpanan yang baik.