PENGARUH SUHU DAN LAMA FERMENTASI TERHADAP PRODUKSI

EKSOPOLISAKARIDA DARI TETES TEBU OLEH Lactobacillus

plantarum DAN IDENTIFIKASI SENYAWA GULA PENYUSUNNYA

SKRIPSI

Oleh :
AIDA FITRIA
NIM. 12630099

JURUSAN KIMIA
FAKULTAS SAINS DAN TEKNOLOGI
UNIVERSITAS ISLAM NEGERI
MAULANA MALIKIBRAHIMMALANG
2017
PENGARUH SUHU DAN LAMA FERMENTASI TERHADAP PRODUKSI
EKSOPOLISAKARIDA DARI TETES TEBU OLEH Lactobacillus
plantarum DAN IDENTIFIKASI SENYAWA GULA PENYUSUNNYA

SKRIPSI

Oleh:
AIDA FITRIA
NIM. 12630099

DiajukanKepada:
Fakultas Sains danTeknologi
Universitas Islam Negeri (UIN) Maulana Malik IbrahimMalang
UntukMemenuhi Salah Satu Persyaratan dalam
Memperoleh Gelar Sarjana Sains (S.Si)

JURUSAN KIMIA
FAKULTAS SAINS DAN TEKNOLOGI
UNIVERSITASISLAM NEGERI
MAULANA MALIK IBRAHIM MALANG
2017

i
PENGARUH SUHU DAN LAMA FERMENTASI TERHADAP PRODUKSI
EKSOPOLISAKARIDA DARI TETES TEBU OLEH Lactobacillus
plantarum DAN IDENTIFIKASI SENYAWA GULA PENYUSUNNYA

SKRIPSI

Oleh:
AIDA FITRIA
NIM. 12630099

Telah Diperiksa dan disetujui untuk Diuji

Tanggal: 25 Januari 2017

Pembimbing I Pembimbing II

Akyunul Jannah, S.Si., M.P Ahmad Abtokhi, M.Pd

NIP. 19750410 200501 2 009 NIP. 19761003 200312 1 004

Mengetahui,
Ketua Jurusan Kimia

Elok Kamilah Hayati, M.Si

ii
 NIP. 19790620 200604 2 002
PENGARUH SUHU DAN LAMA FERMENTASI TERHADAP PRODUKSI
EKSOPOLISAKARIDA DARI TETES TEBU OLEH Lactobacillus
plantarum DAN IDENTIFIKASI SENYAWA GULA PENYUSUNNYA

SKRIPSI

Oleh:
AIDA FITRIA
NIM. 12630099

TelahDipertahankan di Depan DewanPenguji Skripsi

Dan Dinyatakan Diterima Sebagai Salah Satu Persyaratan
Untuk Memperoleh Gelar Sarjana Sains (S.Si)
Tanggal: 25 Januari 2017

Penguji Utama : A. Ghanaim Fasya, M.Si (..............................)

NIP. 1977020200312 2 001
Ketua Penguji : Anik Maunatin, S.T., M.P (...............................)
NIPT. 20140201 2 412
Sekretaris Penguji : Akyunul Jannah, S.Si., M.P (...............................)
NIP. 19750410 200501 2 009

Anggota Penguji : Ahmad Abtokhi, M.Pd (...............................)

NIP. 19761003 200312 1 004

Mengesahkan,
Ketua Jurusan Kimia

Elok Kamilah Hayati, M.S

iii
 PERNYATAAN KEASLIAN TULISAN

Saya yang bertanda tangan di bawah ini:

Nama : Aida Fitria
NIM : 12630099
Jurusan : Kimia
Fakultas : Sains dan Teknologi
Judul Penelitian : Pengaruh Suhu dan Lama Fermentasi terhadap Produksi
Eksopolisakarida dari Tetes Tebu oleh Lactobacillus
plantarum dan Identifikasi Senyawa Gula Penyusunnya

menyatakan dengan sebenarnya bahwa skripsi yang saya tulis ini benar-benar
merupakan hasil karya saya sendiri, bukan merupakan pengambilalihan data,
tulisan atau pikiran orang lain yang saya akui sebagai hasil tulisan atau pikiran
saya sendiri, kecuali dengan mencantumkan sumber cuplikan pada daftar pustaka.
Apabila dikemudian hari terbukti atau dapat dibuktikan skripsi ini hasil jiplakan,
maka saya bersedia menerima sanksi atas perbutan tersebut.

Malang, 25 Januari 2017

Yang membuat pernyataan,

Aida Fitria
NIM. 12630099

iv
 KATA PENGANTAR

Alhamdulillahirobbil „alamin, puji syukur kehadirat Ilahi Robbi yang telah

melimpahkan taufiq, hidayah sertah inayahnya sehingga penulis dapat

menyelesaikan skripsi dengan judul “Pengaruh Suhu dan Lama Fermentasi

terhadap Produksi Eksopolisakarida dari Tetes Tebu oleh Lactobacillus

plantarum dan Identifikasi Gula Penyusunnya” dengan tepat waktu, meskipun

tak luput dari kekurangan.

Shalawat beriringkan salam keharibaan Abu Fathimah Az-Zahra

Muhammad SAW, yang telah membimbing kita dari zaman kebodohan hingga

zaman yang sarat akan penemuan dengan cahaya islam. Semoga kita dapat

mendapatkan syafa‟atnya kelak di hari kiamat.

Penulis menyadari masih terdapat banyak kekurangan dalam penulisan

skripsi karena keterbatasan pengetahuan penulis, sehingga dalam penyelesaian

skripsi ini penulis dibantu oleh beberapa pihak. Untuk itu dengan segala ketulusan

hati penulis mengucapkan terimakasih kepada:

1. Bapak Prof. Dr. H. Mudjia Raharjo, M.Si, selaku Rektor Universitas Islam

Negeri (UIN) Maulana Malik Ibrahim Malang.

2. Ibu Dr. Hj. Bayyinatul M. drh, M.Si selaku Dekan Fakultas Sains dan

Teknologi UIN Maulana Malik Ibrahim Malang.

3. Ibu Elok Kamilah Hayati, M.Si, selaku Ketua Jurusan Kimia Fakultas

Sains dan Teknologi UIN Maulana Malik Ibrahim Malang.

4. Ibu Akyunul Jannah, M.P selaku dosen pembimbing penelitian yang telah

membimbing dan memotivasi penulis untuk segera skripsi.

v
5. Bapak Abtokhi, M. Pd selaku dosen pembimbing agama yang telah

memberikan pengarahan dan nasihat.

6. Ibu Anik Ma‟unatin, M.P selaku konsultan penelitian dengan arahan dan

bimbingan beliau semua dengan sabar dan semua ilmu yang diberikan

kepada penulis, sehingga penulis dapat menyusun skripsi dengan

memperoleh pengetahuan serta pengalaman yang sangat berharga.

7. Seluruh dosen, laboran dan karyawan jurusan kimia yang telah

memberikan ilmu, pengalaman wacana dan wawasannya, sebagai

pedoman dan bekal bagi penulis.

Akhirnya atas segala kekurangan dari penyusunan skripsi, penulis sangat

mengharapkan kritik dan saran yang bersifat konstruktif dari semua pembaca

demi sempurnanya skripsi ini. Semoga skripsi yang telah penulis susun dapat

bermanfaat bagi kita semua, Amin.

Malang, Januari 2017

Penulis

vi
 DAFTAR ISI

HALAMAN JUDUL .......................................................................................... i

HALAMAN PERSETUJUAN ......................................................................... ii
HALAMAN PENGESAHAN .......................................................................... iii
LEMBAR PERNYATAAN KEASLIAN TULISAN .................................... iv
KATA PENGANTAR ........................................................................................ v
DAFTAR ISI .................................................................................................... vii
DAFTAR GAMBAR ........................................................................................ ix
DAFTAR TABEL .............................................................................................. x
DAFTAR LAMPIRAN ...................................................................................... xi
ABSTRAK .......................................................................................................... xii

BAB I PENDAHULUAN ................................................................................... 1

1.1 Latar Belakang ................................................................................... 1
1.2 Rumusan Masalah .............................................................................. 7
1.3 Tujuan Penelitian ............................................................................... 8
1.4 Batasan Masalah ................................................................................. 8
1.5 Manfaat Penelitian ............................................................................. 8

BAB II TINJAUAN PUSTAKA ........................................................................ 9

2.1 Tetes Tebu dalam Perspektif Islam .................................................... 9
2.2 Kandungan Tetes Tebu ...................................................................... 11
2.3 Fermentasi dalam Perspektif Islam .................................................... 12
2.4 Fermentasi Eksopolisakarida oleh Bakteri Asam Laktat ................... 14
2.5 Eksopolisakarida ................................................................................ 19
2.6 Biosintesis Eksopolisakarida .............................................................. 24
2.7 Bakteri Asam Laktat .......................................................................... 27
2.7.1 Bakteri Asam Laktat Penghasil Eksopolisakarida .............. 28
2.7.2 Lactobacillus plantarum ..................................................... 31
2.8 Pengukuran Brix ................................................................................ 32
2.9 Pengukuran Kadar Total Gula Metode Sulfat-Fenol ......................... 34
2.10 Spektrofotometer UV-Vis ................................................................ 35
2.11 Analisis Eksopolisakarida Menggunakan Fourier Transform
Infra Red (FTIR) .............................................................................. 37

BAB III METODE PENELITIAN ................................................................... 41

3.1 Waktu dan Tempat Penelitian ............................................................ 41
3.2 Alat dan Bahan ................................................................................... 41
3.2.1 Alat ...................................................................................... 41
3.2.2 Bahan .................................................................................. 41
3.3 Rancangan Penelitian ......................................................................... 41
3.4 Tahapan Penelitian ............................................................................. 42
3.5 Pelaksanaan Penelitian ....................................................................... 43
3.5.1 Preparasi Sampel ................................................................. 43
3.5.1.1 Sterilisasi Alat ...................................................... 43
3.5.1.2 Pengukuran Brix .................................................. 43
3.5.1.3 Preparasi Tetes Tebu ............................................ 43

vii
 3.5.2 Analisis Kadar Total Gula Metode Fenol H2SO4 .................43
3.5.2.1 Pembuatan Kurva Standar Glukosa
dengan Metode Fenol H2SO4 .................43
3.5.2.2 Perhitungan Kadar Total Gula Tetes Tebu
dengan Metode Fenol H2SO4 ..................44
3.5.3 Preparasi Bakteri Lactobacillus plantarum ..........................44
3.5.3.1 Pembuatan media MRSA ..................................... 44
3.5.3.2 Pembuatan media MRSB ..................................... 44
3.5.3.3 Peremajaan Lactobacillus plantarum ................... 45
3.5.3.4 Pembuatan stok inokulum .................................... 45
3.5.3.5 Pengukuran Optical Density ................................ 45
3.5.3.6 Pengukuran Total Plate Count (TPC) .................. 45
3.5.4 Uji Pengaruh Suhu dan Lama Fermentasi Terhadap Produksi
Eksopolisakarida ..................................................................44
3.5.5 Isolasi Eksopolisakarida ....................................................... 44
3.5.6 Identifikasi Eksopolisakarida Menggunakan FTIR ............ 44
3.5.7 Analisis Data ....................................................................... 44

BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN ............................................................45

4.1 Preparasi Sampel .................................................................................45
4.2 Pembuatan Media ................................................................................47
4.3 Peremajaan dan Pembuatan Inokulum Lactobacillus plantarum.........47
4.4 Pengukuran Optical Density dan Perhitungan Total Plate Count .......49
4.5Analisis Pengaruh Suhu dan Lama Fermentasi Terhadap Produksi
Eksopolisakarida .................................................................................50
4.6 Pengukuran Kadar Total Gula EPS .....................................................57
4.7 Pengukuran Kadar Gula Terpakai Selama Fermentasi .......................60
4.8 Hasil Analisis Menggunakan FTIR .....................................................61
4.9 Pemanfaatan Tetes Tebu untuk Memproduksi Eksopolisakarida dalam
Perspektif Islam ....................................................................................62

BAB V PENUTUP ...............................................................................................68

5.1 Kesimpulan .........................................................................................68
5.2 Saran ....................................................................................................68

DAFTAR PUSTAKA ......................................................................................... 69

LAMPIRAN ........................................................................................................ 76

viii
 DAFTAR GAMBAR

Gambar 2.2. Tetes Tebu .....................................................................................11

Gambar 2.5.1 Struktur Dextran ............................................................................20
Gambar 2.5.2 Stutur Kefiran ...............................................................................21
Gambar 2.5.3 Struktur Gellan .............................................................................21
Gambar 2.5.4 Struktur Curdlan ...........................................................................22
Gambar 2.5.5 Struktur Xanthan ..........................................................................23
Gambar 2.5.6 Struktur Alginat ............................................................................23
Gambar 2.5.7 Struktur Pullulan ..........................................................................24
Gambar 2.6.8 Jalur Biosintesis EPS ....................................................................25
Gambar 2.7.2 Lactobacillus plantarum ...............................................................31
Gambar 2.8.1 Piknometer ...................................................................................32
Gambar 2.8.2 Hidrometer ...................................................................................33
Gambar 2.8.3 Hand Brix Refractometer .............................................................34
Gambar 2.9.1 Reaksi dehidrasi karbohidrat ........................................................34
Gambar 2.9.2 (a) Pentosa, (b) Heksosa, (c) 6-dioksiheksosa, (d) Keto-heksosa 35
Gambar 2.10 Bagian-bagian spektrometer UV–Vis dual beam .........................36
Gambar 2.11.1 Spektra FTIR eksopolisakarida dengan penambahan Se ..............38
Gambar 2.11.2 Spektra FTIR eksopolisakarida tanpa penambahan Se ................38
Gambar 2.11.3 (a) spektra FTIR eksopolisakarida yang diproduksi oleh L.
plantarum NTMI05, (b) spektra FTIR eksopolisakarida yang
diproduksi oleh L. plantarum NTMI20 .......................................39
Gambar 4.5.1 Reaksi hidrolisis sukrosa (Iswanto, 2014) ...................................54
Gambar 4.5.2 Hasil Produksi eksopolisakarida .................................................55
Gambar 4.6.1 Reaksi dehidrasi karbohidrat .......................................................58
Gambar 4.8.1 Spektra FTIR perlakuan suhu 30 oC selama 18 jam ...................61
Gambar 7 Grafik kurva standar glukosa ......................................................87

ix
 DAFTAR TABEL

Tabel 2.2 Komponen yang terkandung dalam tetes tebu ...................................12

Tabel 2.7.1 Kondisi ferementasi untuk menghasilkan EPS ..................................30
Tabel 3.3 Kombinasi perlakuan antara suhu dan lama fermentasi .....................42
Tabel 4.1 Karakteristik bahan baku ....................................................................47
Tabel 4.2.2 Kadar gula terpakai rata-rata molase ..................................................53
Tabel 4.2.3 Uji lanjut Beda Nyata Jujur (BNJ) suhu terhadap kadar
gula terpakai ......................................................................................54
Tabel 4.5.1 Uji lanjut Beda Nyata Jujur (BNJ) interaksi suhu dengan lama
fermentasi terhadap kadar eksopolisakarida ......................................57
Tabel 4.6.1 Rata-rata kadar total gula EPS ............................................................59
Tabel 4.7.1 Uji lanjut Beda Nyata Jujur (BNJ) interaksi suhu dengan lama
fermentasi terhadap kadar gula terpakai ............................................60
Tabel 4.8.1 Gugus fungsi dari spektra FTIR perlakuan S2L1 ................................62
Tabel 7 Data absorbansi glukosa standar ........................................................86
Tabel 8.1.1 Absorbansi bahan baku ......................................................................87
Tabel 8.1.2 Kadar total gula bahan baku ...............................................................88
Tabel 8.2.1 Absorbansi sampel sebelum fermentasi .............................................88
Tabel 8.2.2 Kadar total gula sampel sebelum fermentasi .....................................89
Tabel 8.3.1 Absorbansi sampel setelah fermentasi ...............................................89
Tabel 8.3.2 Kadar total gula sisa fermentasi .........................................................90
Tabel 8.4.1 Kadar gula terpakai pada fermentasi ulangan I ..................................91
Tabel 8.4.2 Kadar gula terpakai pada fermentasi ulangan II ................................91
Tabel 8.4.3 Kadar gula terpakai pada fermentasi ulangan III ...............................92
Tabel 8.4.4 Rata-rata kadar gula terpakai .............................................................92
Tabel 8.5.1 Absorbansi eksopolisakarida .............................................................93
Tabel 8.5.2 Rata-rata kadar total gula eksopolisakarida .......................................94
Tabel 9.1 Rata-rata hasil produksi eksopolisakarida ..........................................94
Tabel 9.2 Rata-rata kadar eksopolisakarida .......................................................95
Tabel 10.1 Perhitungan TPC ulangan I ................................................................95
Tabel 10.2 Perhitungan TPC ulangan II ...............................................................96
Tabel 10.3 Perhitungan TPC ulangan III .............................................................96

x
 DAFTAR LAMPIRAN

Lampiran 1 Diagram Alir ......................................................................................76

Lampiran 2 Skema Kerja ......................................................................................77
Lampiran 3 Perhitungan ........................................................................................83
Lampiran 4 Dokumentasi ......................................................................................97
Lampiran 5 Data Panjang Gelombang Maksimum ...............................................99
Lampiran 6 Kurva Standar Glukosa ....................................................................100
Lampiran 7 Hasil Uji Statistik .............................................................................102

xi
 ABSTRAK

Fitria, A. 2016. Pengaruh Suhu dan Lama Fermentasi Terhadap Produksi

Eksopolisakarida dari Tetes Tebu oleh Lactobacillus plantarum
dan Identifikasi Gula Penyusunnya. Pembimbing I: Akyunul
Jannah, M.P; Pembimbing II: Ahmad Abtokhi, M.pd; Konsultan:
Anik Maunatin, M.P.

Tetes tebu merupakan hasil samping dari proses pengolahan gula yang
mengandung sumber karbon cukup tinggi, sehingga dapat dijadikan media
fermentasi alternatif bagi Lactobacillus plantarum untuk memproduksi
eksopolisakarida. Eksopolisakarida (EPS) adalah polisakarida yang disekresikan
dari mikroba ke lingkungan. Tujuan dari penelitian ini adalah untuk mengetahui
pengaruh suhu dan lama fermentasi terhadap produksi EPS dari tetes tebu.
Produksi eksopolisakarida oleh Lactobacillus plantarum pada penelitian ini
menggunakan Rancangan Acak Kelompok Faktorial (RAKF) yang terdiri dari dua
faktor, yaitu suhu (25, 30, dan 35 oC) dan lama fermentasi (18 dan 24 jam).
Masing-masing perlakuan dilakukan tiga kali ulangan. Data kadar EPS, kadar
total gula EPS dan kadar gula terpakai selama fermentasi dianalisis menggunakan
Two Way ANOVA dengan selang kepercayaan 5 %, dan dilanjutkan dengan uji
Beda Nyata Jujur (BNJ) 5 %. Hasil penelitian menunjukkan suhu dan Lama
fermentasi berpengaruh nyata terhadap terhadap kadar EPS dan kadar gula
terpakai selama fermentasi, lama fermentasi tidak berpengaruh nyata terhadap
kadar total gula EPS. Diperoleh kadar EPS tertinggi 740 mg/L, kadar total gula
EPS tertinggi 5,97 %, dan kadar gula terpakai tertinggi 14,67 % pada perlakuan
suhu 30 oC dan lama fermentasi 18 jam. Spektra hasil analisis FTIR menunjukkan
bahwa EPS termasuk polisakarida dengan adanya vibrasi peregangan C-H pada
cincin gula mannosa atau galaktosa dan sebuah gugus fungsi vibrasi peregangan
(C-O) dari gugus eter.

Kata kunci: Lactobacillus plantarum; eksopolisakarida; tetes tebu; analisis FTIR

xii
 ABSTRACT

Fitria, A. 2016. Effect of Temperature and Long Fermentation to The

Exopolysaccharide Production from Molasses by
Lactobacillus plantarum and Identification of its Sugar
Compound. Supervisor I: Akyunul Jannah, S.Si., M.P;
Supervisor II: Ahmad Abtokhi, M.Pd; Consultant: Anik
Maunatin, S.T., M.P.

Molasses is a side product from the sugar manufacturing process that

contain high enough of carbon source, so it become fermentation medium
alternative for Lactobacillus plantarum to produce exopolysaccharide.
Exopolysaccharide (EPS) is polysaccharide that secreted from microbe to their
external environment. The aim of this research were to determine effect of
temperature and long fermentation on exopolysaccharide production from
molasses. Production of exopolysaccharide by Lactobacillus plantarum in this
study used Randomized Factorial Design that consist of two factors, those are
temperature (25, 30, and 35oC) and long fermentation (18 and 24 hour). Each
treatment was done in three replication. EPS content, total sugar content of EPS,
and used sugar content from fermentation process was analyzed used Two Way
ANOVA within 5 % interval of confidence, and continued by Tukey test 5 %. The
result showed that temperature and long fermentation affect on EPS content and
used sugar content. Long fermentation gave not significant different on total sugar
content of EPS. The maximum of EPS content 740 mg/L, total sugar content from
EPS 5,97 % and used sugar content from fermentation process 14,67 % at
temperature 30 oC and long fermentation 18 hours. FTIR analysis showed that
functional group suggested to polysaccharide, With presence C=C stretching
vibration in the sugar ring mannosa and galactosa and stretching vibration (C–O)
from eter are the typical absorption peaks of a polysaccharide.

Keywords: Lactobacillus plantarum; exopolysaccharide; molasses; FTIR analysis

xiii
Beda ANOVA Two Way
BNT/Nyata Terkecil

FTIR
C–O ‫ على حلقات السكر‬C=C

FTIR

xiv
 BAB I

PENDAHULUAN

1.1 Latar Belakang

Eksopolisakarida (EPS) adalah suatu polisakarida yang diproduksi dan

disekresikan dari mikroba ke lingkungan. EPS adalah polimer biosintetik terutama

terdiri dari karbohidrat yang disekresikan oleh bakteri (Freitas dkk., 2009). EPS

diteliti karena memiliki berbagai macam potensi, antara lain dalam bidang

farmasi, pangan dan kesehatan. Potensi-potensi yang terdapat pada EPS

merupakan suatu bukti bahwa segala yang Allah ciptakan baik di langit maupun di

bumi pasti mengandung manfaat. Seperti halnya firman Allah SWT. dalam QS.

Shaad: 27:

              

   

Artinya: “dan Kami tidak menciptakan langit dan bumi dan apa yang ada antara
keduanya tanpa hikmah. yang demikian itu adalah anggapan orang-
orang kafir, Maka celakalah orang-orang kafir itu karena mereka akan
masuk neraka” (QS. Shaad: 27).

Tafsir ayat tersebut dalam tafsir al Qurthubi (2009) adalah Allah tidak

bermain-main dalam menciptakan alam semesta. Tidak ada kesia-sia an dan tanpa

arah tujuan yang benar. Seandainya penciptaan alam ini tanpa tujuan yang haq,

maka apa yang dilakukan Allah SWT. yang menyangkut kehidupan dan kematian

makhluk, serta penciptaan serta pemusnahannya dilakukan-Nya tanpa tujuan.

Tetapi karena memang bertujuan untuk permainan, maka pastilah Allah yang

1
 2

Maha kuasa itu tidak dapat membedakan antara yang berbuat baik dan buruk, lalu

memberi ganjaran sesuai amal perbuatan masing-masing.

Kalimat baathilaa mengandung arti sia-sia atau tanpa hikmah jika kita

pahami, makna sia-sia atau tanpa hikmah yaitu tidak terdapat manfaat yang

diambil, dan hanyalah sebuah sifat yang tidak menguntungkan. Namun ciptaan

Allah tidak demikian, Allah SWT menciptakan segala makhluk di dunia, baik itu

makhluk hidup maupun benda mati selalu disertai manfaat yang melekat. Ada

kalanya manfaat itu tidak dapat dirasakan secara langsung, namun harus melalui

pengolahan akal fikiran manusia dengan memperluas wawasan keilmuan baik

secara teoritis maupun eksperimental.

Menurut Malik, dkk. (2008) di bidang pangan, eksopolisakarida

bermanfaat sebagai stabilisator, pengental, emulgator, pembentuk gel dan

memiliki kemampuan mengikat air yang baik sehingga dapat mempertahankan

tekstur makanan agar tetap lembut selama penyimpanan. EPS berperan penting

dalam psikokimia, reologi produk, rasa komposisi makanan fermentasi (Yilmaz,

dkk., 2015), dan memberikan manfaat bagi kesehatan manusia seperti aktivitas

antitumor dengan rasio hambat sebesar 88,34 ± 1,97 % terhadap sel tumor

lambung BGC-823 (Wang, dkk., 2014), dan 39,24 % terhadap sel tumor usus HT-

29 (Wang, dkk., 2015), antibakteri dengan zona hambat sebesar 15.67 ± 1.53 mm

terhadap bakteri E. coli O157:H7 (Li, dkk., 2014), antioksidan dengan EC50

sebesar 1,07 mg/mL terhadap radikal DPPH (Li, dkk., 2014), antibiofilm dengan

rasio hambat terhadap pembentukan biofilm Staphylococcus aureus AC1 sebesar

45,13 % (Wang, dkk., 2015). Menurut penelitian Dilna, dkk., (2015) EPS yang
 3

diproduksi oleh L. plantarum RJF4 dapat menurunkan konsentrasi kolesterol

sebesar 42,24 % melalui adsorpsi.

Eksopolisakarida dapat diproduksi oleh Bakteri Asam Laktat (BAL). EPS

yang diproduksi BAL berfungsi sebagai bentuk perlindungan sel bakteri terhadap

kondisi lingkungan yang ekstrim sebagai bentuk pertahanan diri dari sel lain dan

bakteriofag. EPS yang diproduksi BAL mempunyai risiko kontaminasi toksik

yang kecil sehingga dapat diaplikasikan pada makanan karena EPS aman

dikonsumsi manusia (dalam kata lain GRAS–Generally Recognized as Safe)

(Amalia, 2012). BAL yang bersifat probiotik memiliki kemampuan untuk

menghasilkan eksopolisakarida seperti Lactobacillus plantarum, Lactobacillus

reuteri, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus rhamnosus, Lactobaciluus casei,

Bifidobacterium longum (Tallon, dkk., 2006), Lactobacillus delbrueckii B3,

Lactobacillus bulgaris G12, Streptococcus thermophiles W22 (Yuksegdag dan

Salim, 2008), Pediococcus parvulus (Velasco, dkk., 2006), Lactobacillus

paracasei (Xu, dkk., 2010), Micrococcus luteus (Asker, dkk., 2014).

Diantara bakteri asam laktat yang dapat memproduksi EPS, Lactobacillus

plantarum sering digunakan secara luas dalam industri fermentasi makanan

seperti sayur-sayuran, dan produk olahan daging (Wang, dkk., 2015).

Lactobacillus plantarum adalah salah satu spesies BAL yang banyak diteliti,

karena pada umumnya beberapa strain tersebut bersifat probiotik (Zubaidah, dkk.,

2008). Penelitian tentang EPS produksi Lactobacillus plantarum yang diisolasi

dari berbagai habitat memiliki manfaat diantaranya sebagai antioksidan,

antitumor, antimikroba, antibiotik, antiadesi, antiinflamatori dan biofilm. Oleh

karena itu, adanya berbagai dampak menguntungkan dari EPS yang diproduksi
 4

oleh BAL memunculkan kesadaran akan pentingnya menambahkan EPS pada

makanan yang dikonsumsi setiap hari sehingga diperlukan EPS dalam jumlah

besar (Sunjaya, dkk., 2012).

Beberapa penelitian tentang produksi eksopolisakarida menunjukkan

bahwa eksopolisakarida yang dihasilkan oleh BAL dapat dipengaruhi oleh kondisi

fermentasi antara lain suhu dengan EPS maksimum 354 mg/L pada suhu 38 oC

(Kimmel, dkk., 1998), lama fermentasi dengan EPS maksimum 730 mg/L selama

60 jam (Lin dan Chien, 2007), medium fermentasi seperti sumber karbon dengan

EPS maksimum 2843 mg/L menggunakan tetes tebu 5 % (Sirajunnisa, dkk., 2012)

dan sumber nitrogen dengan perolehan EPS maksimum 1781 mg/L menggunakan

(NH4)2HPO4 0,3% (Zubaidah, dkk., 2008). Selain itu juga dipengaruhi oleh pH

dengan EPS maksimum 650 mg/L pada pH 6,5 (Haroun, dkk., 2013).

Berdasarkan alasan di atas, kondisi fermentasi harus dioptimalkan untuk

mendapatkan hasil produksi eksopolisakarida terbaik dengan biaya yang efektif

dan efisien (Freitas, dkk., 2011). Menurut Haroun, dkk., (2013) produksi

eksopolisakarida dari substrat glukosa 20 g/L oleh Lactobacillus plantarum

mencapai nilai maksimum sebesar 650 mg/L pada suhu 30 oC. Zubaidah, dkk.,

(2008) melaporkan bahwa produksi eksopolisakarida dari substrat sari buah

murbei dengan penambahan laktosa dilakukan pada suhu 37 oC karena pada suhu

tersebut L. plantarum B2 tumbuh optimum. Diperoleh total EPS kasar sebesar

1955,78 mg/L.

Lama fermentasi merupakan parameter lingkungan yang berpengaruh

terhadap massa molekul, isi dan komposisi gula pada EPS yang dihasilkan (Lin

dan Chien, 2005). Haroun, dkk., (2013) melaporkan bahwa hasil tertinggi
 5

produksi EPS oleh L. plantarum NRLL-B4496 diperoleh pada lama fermentasi 24

jam dengan koefisien perhitungan hasil produksi eksopolisakarida sebesar 323

mg/g. Penelitian produksi eksopolisakarida oleh Lactobacillus plantarum C88

yang dilakukan oleh Zhang, dkk., (2013) menunjukkan hasil maksimum sebesar

69 mg/L ketika baru memasuki fase stasioner (32 jam).

Mikroba penghasil eksopolisakarida membutuhkan substrat yang

mengandung glukosa, sukrosa, dan fruktosa demi menunjang hasil fermentasi

(Fifendy, dkk., 2013). Salah satu substrat yang dapat digunakan adalah tetes tebu.

Tetes tebu merupakan hasil samping dari pengolahan gula tebu (Saccharum

officinarum) (Juwita, 2012). Tetes tebu banyak mengandung gula dan asam-asam

organik. Kandungan gula dalam tetes tebu yaitu sukrosa 40–50 % (Simanjutak,

2009), glukosa 4–9 %, fruktosa 5–12 % dan gula reduksi lain 1–5 % (Toharisman

dan Santosa, 1999). Tetes tebu mengandung cukup tinggi nutrisi untuk kebutuhan

bakteri sehingga dapat dijadikan alternatif sumber karbon sebagai penyedia makro

nutrien bagi Lactobacillus plantarum (Kusmiati, 2007).

Menurut pusat data dan sistem informasi pertanian (2014), Jumlah tetes

tebu di Indonesia mencapai 0,55 juta ton/tahun. Adapun perkembangan produksi

tetes tebu sejak tahun 1980–2013 memiliki rata-rata pertumbuhan 12,19 %.

Simanjutak (2009) mengungkapkan bahwa tetes tebu dari industri gula di

Indonesia lebih banyak diekspor ke luar negeri dengan harga yang relatif murah

karena masih sedikit digunakan dan mengandung kalsium oksida yang dapat

mencemari lingkungan.

Sebagai khalifah di bumi, manusia hendaknya menjaga kelestarian alam.

Salah satunya dengan melakukan pengolahan limbah dari proses produksi agar
 6

tidak menimbulkan kerusakan pada lingkungan. Oleh karena itu limbah tetes tebu

harus diolah terlebih dahulu sebelum dibuang, atau digunakan untuk suatu hal

yang lebih bermanfaat. Allah SWT sangat peduli terhadap kelestarian alam. Hal

ini tercermin pada QS. al A‟raf ayat 56:

            

   

Artinya: „‟ Dan janganlah kamu membuat kerusakan di muka bumi sesudah Allah
memperbaikinya, dan berdoalah kepada – Nya dengan rasa takut
(tidak akan diterima) dan harapan (akan dikabulkan). Sesungguhnya
rahmat Allah amat dekat kepada orang-orang yang berbuat baik (QS.
al A‟raf: 56).

Ayat tersebut dengan jelas merupakan sebuah larangan yang ditujukan

kepada umat manusia terutama umat Islam, agar tidak melakukan kerusakan di

muka bumi dalam bentuk apapun. Allah SWT. dengan kasih sayang-Nya yang

tidak terbatas telah menganugrahkan kemampuan, kecerdasan dan bakat kepada

manusia serta menjadikan manusia sebagai khalifah di muka bumi tak lain agar

dapat memanfaatkan isi alam semesta secara bijaksana, demi terbentuknya

keselarasan diantara makhluk hidup. Larangan Allah sekaligus mengandung

perintah tersebut hendaknya kita amalkan dalam kehidupan, sehingga beberapa

penelitian terdahulu menjadikan kelimpahan tetes tebu sebagai alternatif substrat

fermentasi untuk produksi eksopolisakarida. Diharapkan dengan mengubah tetes

tebu menjadi substrat, dapat mengurangi pencemaran lingkungan serta dapat

memanfaatkan tetes tebu secara optimal.

Saat ini eksplorasi EPS dari BAL semakin meningkat karena EPS dinilai

penting bagi kesehatan dan pengolahan makanan. Beberapa penelitian melaporkan

bahwa esopolisakarida yang diproduksi oleh strain Lactobacillus plantarum

 7

mengandung monomer-monomer gula penyusun. Lactobacillus plantarum EP56

memproduksi EPS yang terdiri dari glukosa, galaktosa dan N-asetilgalaktosamin

(Tallon, dkk., 2006). Liu, dkk., (2011) melaporkan bahwa EPS yang diproduksi

oleh Lactobacillus plantarum NTU102 mengandung senyawa monomer gula yang

terdiri dari fruktosa, arabinosa, galaktosa, glukosa, mannosa dan maltosa. Wang,

dkk., (2010) dari hasil penelitiannya menunjukkan bahwa Lactobacillus

plantarum KF5 menghasilkan EPS yang terdiri dari mannosa, glukosa dan

galaktosa. Sedangkan eksopolisakarida yang dihasilkan dari Lactobacillus

plantarum BC–25 terdiri dari mannosa, galaktosa dan glukosa dengan rasio molar

92,21 : 1,79 : 6,00 (Zhou, dkk., 2010).

Penambahan suplemen terhadap medium fermentasi juga mungkin dapat

merubah kandungan gula dalam EPS. Seperti halnya dalam penelitian Wang, dkk.,

(2015) menunjukkan bahwa penambahan suplemen 20 % (v/v) gliserol ke dalam

medium MRSB menghasilkan EPS yang diproduksi oleh Lactobacillus plantarum

YW32 mengandung monomer gula mannosa, fruktosa, galaktosa, dan glukosa

dengan rasio molar 8,2:1:4,1:4,2, sehingga diharapkan pada penelitian kali ini,

penggunaan substrat tetes tebu sebagai medium dapat memperbesar kadar

monomer gula yang terkandung di dalam EPS, serta dapat memperbanyak jenis

monomer gula lainnya. Penelitian ini menggunakan parameter fermentasi, seperti

suhu dan lama fermentasi yang dioptimasi untuk substrat tetes tebu.

1.2 Rumusan Masalah

1. Bagaimana pengaruh suhu dan lama fermentasi terhadap produksi

eksopolisakarida oleh Lactobacillus plantarum dari substrat tetes tebu?

 8

2. Bagaimana profil senyawa gula yang terkandung dalam eksopolisakarida

hasil produksi menggunakan FTIR?

1.3 Tujuan Penelitian

1. Untuk mengetahui pengaruh suhu dan lama fermentasi terhadap produksi

eksopolisakarida oleh Lactobacillus plantarum dari substrat tetes tebu.

2. Untuk mengetahui gugus fungsi senyawa gula yang terkandung dalam

eksopolisakarida hasil produksi menggunakan FTIR.

1.4 Manfaat Penelitian

Masyarakat dapat mengetahui lama fermentasi dan suhu optimum

produksi eksopolisakarida sehingga dapat memproduksi eksopolisakarida secara

efisien dan menghasilkan randemen yang besar.

1.5 Batasan Masalah

1. Tetes tebu dari Pabrik Gula Krebet Malang.

2. Analisis gugus fungsi senyawa gula dari eksopolisakarida dengan kadar

gula tertinggi menggunakan FTIR (Fourier Transform Infra Red).

 BAB II

TINJAUAN PUSTAKA

2.1 Tetes Tebu dalam Perspektif Islam

Tetes tebu merupakan limbah pabrik gula yang dikategorikan sebagai

limbah cair yang diperoleh dari hasil pemisahan sirup low grade dimana gula

dalam sirup tersebut tidak dapat dikristalkan lagi karena mengandung pecahan

sukrosa yaitu glukosa dan fruktosa. Limbah ini memiliki kandungan sukrosa

sekitar 30 % serta gula pereduksi sekitar 25 % berupa glukosa dan fruktosa.

Sukrosa dalam tetes tebu merupakan komponen sukrosa yang sudah tidak dapat

lagi dikristalkan di dalam industri gula (Pertiwi, 2009). Selain senyawa gula,

senyawa-senyawa yang terkandung dalam tetes tebu diantaranya biotin, asam

pantotenat, tiamin, fosfor dan sulfur. Kandungan nitrogen organik sedikit.

Pemanfaatan tetes tebu sangat dianjurkan, disamping karena senyawa-

senyawa yang terkandung di dalamnya, pemanfaatan tetes tebu dapat mengurangi

pencemaran lingkungan. Selain itu, kandungan tetes tebu yang kaya akan gula

dapat dijadikan substrat fermentasi untuk membentuk senyawa lain yang lebih

bermanfaat seperti halnya eksopolisakarida. Potensi pada tetes tebu terutama

dalam bidang pangan dan farmasi berperan penting dalam pengembangan ilmu

pengetahuan. Berdasarkan uraian di atas, sangat jelaslah bahwa segala sesuatu

yang Allah ciptakan merupakan nikmat yang tidak ada sedikitpun kesia-siaan.

9
 10

Sebagaimana firman Allah dalam surat Ali Imran ayat 190-191:

          

          

           
Artinya: "Sesungguhnya dalam penciptaan langit dan bumi, dan silih bergantinya
malam dan siang terdapat tanda – tanda bagi orang – orang yang
berakal,(yaitu) orang-orang yang mengingat Allah sambil berdiri atau
duduk atau dalam keadan berbaring dan mereka memikirkan tentang
penciptaan langit dan bumi (seraya berkata): "Ya Tuhan Kami, Tiadalah
Engkau menciptakan ini dengan sia-sia, Maha suci Engkau, Maka
peliharalah Kami dari siksa neraka” (QS. Ali Imran: 190-191).
Makna ayat tersebut dalam Tafsir Ibnu Katsir (2001) bahwa pada

ketinggian dan keluasan langit dan juga kerendahan bumi serta kepadatannya,

terdapat tanda-tanda kekuasaan-Nya pada segala sesuatu yang Allah ciptakan,

baik berupa bintang-bintang, komet, daratan dan lautan, pegunungan dan

pepohonan, tumbuh-tumbuhan, tanaman, buah-buahan, binatang, barang tambang,

serta berbagai macam warna dan aneka ragam makanan dan bebauan. Semuanya

itu merupakan ketetapan Allah yang Maha perkasa lagi Maha mengetahui dan

merupakan tanda-tanda bagi orang-orang yang berakal (Ulul Albab), yaitu mereka

yang mempunyai akal yang bersih dan mengetahui hakikat banyak hal secara jelas

dan nyata. Mereka tidak putus-putus berdzikir dalam setiap keadaan baik dengan

hati maupun lisan mereka. Mereka juga memahami apa yang terdapat pada

keduanya (langit dan bumi) dari kandungan hikmah yang menunjukkan

keagungan al Khaliq (Allah), kekuasaan-Nya, keluasan ilmu-Nya, hikmah-Nya,

pilihan-Nya dan juga rahmat-Nya.

 11

2.2 Kandungan Tetes Tebu

Tetes tebu berwarna hitam gelap atau hitam kemerahan, mempunyai pH

5,5–6,5 yang disebabkan oleh adanya asam-asam organik bebas (Harahap, 2003).

Tetes tebu mengandung kurang lebih 39 % sellulosa dan 27,5 % hemisellulosa

(Gusmailina, 2010).

Gambar 2.2. Tetes tebu

Tetes tebu yang mengandung nutrisi cukup tinggi untuk kebutuhan bakteri,

telah dijadikan bahan alternatif untuk pengganti glukosa sebagai sumber karbon

dalam media pertumbuhan mikroorganisme (Paturau, 1982). Komposisi rata-rata

tetes tebu dipengaruhi oleh jenis tanah, suhu, kelembaban, musim produksi,

varietas, dan proses produksi. Dari berbagai faktor tersebut berpengaruh pada

kandungan nutrisi, rasa, warna, viskositas dan kadar gula (Pertiwi, 2009).

Pada umumnya tetes tebu digunakan sebagai media untuk produksi

alkohol secara komersial pada industri fermentasi alkohol karena tetes tebu mudah

didapatkan secara luas, murah, serta dianggap sebagai bahan baku yang

berkualitas. Tetes tebu yang akan digunakan sebagai bahan baku terutama pada

produksi alkohol harus memenuhi parameter % brix. Kondisi tetes tebu yang

pekat menghasilkan konsentrasi gula dalam tetes tebu cukup tinggi sehingga dapat

memberikan efek pengawetan pada tetes tebu (Prescott dan Dunn, 1990). Menurut
 12

Prescott dan Dunn (1990), kualitas tetes tebu yang baik harus mempunyai % brix

antara 85–95 % brix.

Berikut ini adalah tabel komponen yang terkandung dalam tetes tebu.

Tabel 2.2 Komponen yang terkandung dalam tetes tebu (Toharisman dan
Santosa, 1999)
Kandungan Kisaran (%) Rata-rata (%)
Air 17–25 20
Senyawa organik
Sakarosa 30–40 35
Glukosa 4–9 7
Fruktosa 5–12 9
Gula reduksi lain 1–5 3
Protein kasar 2,5–4,5 4
Asam amino 0,3–0,5 0,4
Senyawa anorganik
K 2O 4,80
CuO 1,20
MgO 0,98
Na2O 0,10
Fe2O3 0,12
SO3 1,90
Cl 1,80
P2O3 0,60
SiO2 tak larut 0,60
Wax, fosfolipid dan sterol 0,40
Vitamin
Biotin (H) 2
Cholin (B4) 8,80
Asam folat (B komplek) 0,35
Niacin (B komplek) 23
Riboflavin (B2) 40
Asam panthotenat (B komplek) 2,50
Pyridoxine (B6) 4
Thiamine (B1) 0,80

2.3 Fermentasi dalam Perspektif Islam

Produksi eksopolisakarida dari tetes tebu melalui serangkaian proses

fermentasi. Fermentasi menurut pengertian ahli biokimia merupakan segala proses

yang menghasilkan suatu produk dengan perombakan senyawa organik oleh

kultur mikroorganisme. Fermentasi dapat juga dapat diartikan sebagai proses

disimilasi senyawa-senyawa organik yang disebabkan oleh aktivitas

 13

mikroorganisme. Disimilasi merupakan reaksi kimia yang membebaskan energi

melalui perombakan nutrien (Sulistyaningrum, 2008). Asal kata fermentasi

sebenarnya berasal dari bahasa Latin yaitu ferfere, yang berarti mendidih. Kata

tersebut digunakan karena menggambarkan aksi ragi pada ekstrak buah selama

pembuatan minuman berakohol.

Al Qur‟an sebagai sumber acuan utama mengisyaratkan istilah fermentasi

pada buah-buahan sebagaimana tertulis dalam surat an Nahl ayat 67:

            

   

Artinya: “Dan dari buah korma dan anggur, kamu buat minimuman yang
memabukkan dan rezki yang baik. Sesunggguhnya pada yang demikian
itu benar-benar terdapat tanda (kebesaran Allah) bagi orang yang
memikirkan” (QS. an Nahl:67).

Berdasarkan ayat tersebut, kata Sakaron artinya adalah segala sesuatu

yang bisa memabukkan. Istilah yang umum digunakan secara bahasa. Ibnu Abbas

berkata, “Ayat ini turun sebelum pengharaman khamer dan yang dimaksud

dengan sesuatu yang memabukkan adalah khamer. Ada pula yang berpendapat

“Sesuatu yang memabukkan adalah perasan buah manis yang halal” dinamakan

memabukkan karena sesuatu tersebut dapat memabukkan jika dibiarkan, jika telah

sampai kepada kondisi yang memabukkan maka diharamkan. Sedangkan menurut

tafsir al Qurthubi (2009) yang dimaksud sakaron dalam ayat ini adalah minuman

baik dari kurma maupun anggur yang direndam dengan air jika telah lama akan

mengalami fermentasi sehingga menjadi memabukkan (sakaron). Diantara faktor-

faktor yang mempengaruhi fermentasi, suhu dan lama fermentasi berpengaruh

terhadap hasil fermentasi.

 14

2.4 Fermentasi Eksopolisakarida oleh Bakteri Asam Laktat

Secara umum, fermentasi adalah merupakan suatu bentuk respirasi

anaerobik, akan tetapi Dirmanto (2006) mendefinisikan fermentasi sebagai

respirasi dalam lingkungan anaerobik dengan atau tanpa akseptor elektron

eksternal. Berikut adalah hal-hal yang mempengaruhi produksi EPS oleh BAL

antara lain:

2.4.1 Media

Media yang digunakan untuk mengoptimalkan produksi EPS sangat

beragam, karena rantai utama dari polimer ini adalah glukosa. Yilmaz, dkk.,

(2015) menggunakan ayran (minuman tradisional yogurt Turki) sebagai substrat

pada produksi eksopolisakarida oleh Streptococcus thermophilus dan

menghasilkan eksopolisakarida sebesar 29,31 mg/L, Ozkaya, dkk., (2007)

menggunakan substrat susu skim (10 g/100 mL) untuk memproduksi

eksopolisakarida oleh L. delbrueckii subsp. bulcaricus dan menghasilkan EPS

sebesar 350 mg/L. Sementara peneliti lainnya menggunakan substrat glukosa

sebesar 30 g/L untuk menghasilkan EPS menggunakan isolat L. delbrueckii B-3

(Xu, dkk., 2010).

Bakteri biasanya memperoleh energi dari oksidasi kimia. Kebanyakan

bakteri memperoleh nutrisi yang diperlukan selnya untuk mensintesis protoplasma

dari berbagai sumber nutrien, seperti sumber karbon (misalnya karbohidrat),

sumber nitrogen (protein atau amoniak), ion-ion anorganik tertentu, metabolit

penting (vitamin, mungkin juga asam amino) dan air (Volk dan Wheeler, 1988).
 15

1. Sumber Karbon

Kemampuan suatu isolat dalam memproduksi eksopolisakarida juga

dipengaruhi oleh komposisi media (tidak hanya sumber karbon) (Ruas-Madiedo

dan Gavilá, 2005). Media kultur harus mengandung semua elemen yang

dibutuhkan untuk pertumbuhan mikroba, dalam proporsi yang serupa dengan yang

ada pada sel mikroba (Hidayat dkk., 2006). Sumber karbon yang biasa digunakan

adalah karbohidrat berupa glukosa, hidrokarbon dan minyak sayuran seperti

minyak kacang kedelai yang digunakan oleh bakteri dalam pertumbuhannya.

Salah satu jenis sumber karbon dari limbah yang dapat digunakan adalah tetes

tebu dan limbah kedelai (Kosaric, 1992).

Penggunaan beberapa sumber karbon seperti glukosa, laktosa, fruktosa

sebagai suplemen dari komposisi media menunjukkan hasil yang bermacam-

macam pada setiap spesies (Halim dan Zubaidah, 2013). Zubaidah, dkk., (2008)

melaporkan bahwa medium fermentasi untuk Lactobacillus plantarum B2 dengan

penambahan laktosa menghasilkan jumlah total eksopolisakarida kasar sebesar

1955,78 mg/mL, jumlah ini lebih besar dibandingkan dengan penambahan

glukosa (1327,00 mg/mL) dan penambahan sukrosa (709,89 mg/mL).

Berbagai gula (karbohidrat) dapat ditambahkan pada media biakan.

Medium macam ini dipakai untuk menentukan apakah jenis bakteri yang

diidentifikasi itu mampu menggunakan gula untuk pertumbuhannya, dalam media

jenis ini yang lazim dipakai adalah gula, seperti glukosa, manosa, galaktosa,

sukrosa, galaktosa, maltosa dan laktosa. Di samping itu, digunakan pula alkohol-

alkohol gula seperti manitol, gliserol dan dulsitol. Apabila gula digunakan oleh

bakteri (Volk dan Wheeler, 1988).

 16

2. Sumber Nitrogen

Semua protein dan asam nukleat mengandung nitrogen, sehingga sejumlah

nitrogen dibutuhkan untuk pertumbuhan (Volk dan Wheeler, 1988). Nitrogen

adalah salah satu dari beberapa unsur nutrisi yang mampu dimanfaatkan oleh

mikroorganisme untuk kebutuhannya. Nitrogen ini terdapat dalam dua bentuk

senyawa kimia yaitu N-organik dan N-anorganik. Senyawa N-organik merupakan

senyawa utama yang paling dibutuhkan oleh mikroorganisme (Muharni, 2007).

Sumber nitrogen yang biasa digunakan adalah amonium nitrat (NH4NO3),

urea, KNO3, NH4Cl, dan NaNO3 (Looijesteijn, dkk., 2001; Mozzi, dkk., 2006).

Berbagai penelitian telah dilakukan untuk mendapatkan rasio yang terbaik antara

karbon, nitrogen, fosfor dan besi yang dibutuhkan untuk mendapatkan produksi

yang tinggi (Huang, dkk., 2015).

Penelitian yang dilakukan oleh Zubaidah, dkk. (2008) menunjukkan

bahwa penambahan sumber nitrogen dan fosfor berupa diamonium hidrogen

phospat ((NH4)2HPO4) sebesar 0,3 % ke dalam substrat sari buah murbei

menghasilkan jumlah eksopolisakarida kasar paling tinggi yaitu 1618,67 mg/L,

sedangkan jumlah eksopolisakarida kasar paling rendah diperoleh pada

konsentrasi (NH4)2HPO4 0,1 % dengan jumlah eksopolisakarida kasar sebesar

1087,89 mg/L.

Unsur nitrogen dan fosfat sangat berpengaruh terhadap pertumbuhan dan

perkembangan bakteri sebagai pembentukan dinding sel. Adanya penambahan

(NH4)2HPO4 menyebabkan peningkatan jumlah nutrisi yang diperlukan oleh L.

plantarum untuk tumbuh dan berkembang biak. Semakin tinggi kadar

(NH4)2HPO4 menyebabkan peningkatan nilai total EPS kasar karena (NH4)2HPO4

 17

merupakan sumber nitrogen dan fosfat pada pembentukan senyawa metabolit L.

plantarum. (Zubaidah, dkk., 2008). Eksopolisakarida tersusun dari gugus asetil,

fosfat, sn-gliserolfosfat dan N-asetilaminosakarida (Tallon, dkk., 2006). Menurut

Harrah, dkk. (2006), unit penyusun heteropolisakarida kadang-kadang

mengandung N-asetilglukosamin, N-asetilgalaktosamin, fukosa, asam glukuronat,

dan gugus non-karbohidrat seperti fosfat, asetil, dan gliserol.

2.4.2 Suhu

Suhu merupakan salah satu faktor yang cukup penting pertumbuhan

mikroba. Suhu fermentasi yang terlalu tinggi akan berpengaruh terhadap mikroba

dan enzim yang dihasilkan oleh mikroba itu sendiri. Suhu yang terlalu tinggi akan

mengakibatkan enzim mengalami denaturasi sehingga akan rusak. Pada umumnya

enzim bekerja sangat lambat pada suhu di bawah titik beku dan keaktifannya akan

meningkat sampai suhu 45 °C. Haroun, dkk. (2013) melakukan penelitian

mengenai produksi eksopolisakarida oleh Lactobacillus plantarum NRRL B-

4496 menggunakan variasi suhu (20, 25, 30, 35 dan 40 oC) untuk mengevaluasi

pengaruh suhu terhadap produksi EPS. Hasil penelitian tersebut mengungkapkan

bahwa eksopolisakarida mencapai nilai maksimum 650 mg/L pada suhu 30 oC.

2.4.3 Lama Fermentasi

Penggunaan variasi lama fermentasi (12, 18, 24, 36 dan 48 jam) untuk

mengetahui pengaruh lama fermentasi terhadap pertumbuhan produksi

eksopolisakarida oleh Lactobacillus plantarum NRLL B-4496 telah diteliti oleh

Haroun dkk. (2013). Hasil produksi EPS sebesar 650 mg/L pada lama fermentasi

24 jam.
 18

2.4.4 pH

pH merupakan salah satu parameter kritis lingkungan yang mempengaruhi

total BAL dalam medium fermentasi, total asam laktat dan total eksopolisakarida

kasar yang dihasilkan (Zubaidah, dkk., 2008). Produksi eksopolisakarida oleh

Lactobacillus plantarum B2 pada produk probiotik berbasis buah murbei

menghasilkan jumlah eksopolisakarida kasar paling tinggi yaitu 1955,78 mg/mL

pada pH 4,33 (Zubaidah, dkk., 2008). Kimmel, dkk. (1998) menyebutkan bahwa

produksi eksopolisakarida optimum dari isolat Lactobacillus delbrueckii subsp.

bulgaricus RR adalah pada pH 5,0 dengan jumlah eksopolisakarida kasar sebesar

30 g/L setelah diprediksikan sebelumnya sebesar 295 mg/L. produksi EPS oleh

Streptococcus thermophilus 1275 pada variasi pH 4,5, 5,5, dan 6,5 menghasilkan

EPS tertinggi yaitu 458 mg/L pada pH 5,5 (Zisu dan Shah, 2003).

2.4.5 Konsentrasi Substrat

Kecepatan reaksi enzimatis pada umumnya tergantung pada konsentrasi

substrat. Kecepatan reaksi akan meningkat apabila konsentrasi substrat

meningkat. Peningkatan kecepatan reaksi ini akan semakin kecil hingga tercapai

suatu titik batas yang pada akhirnya penambahan konsentrasi substrat hanya akan

sedikit meningkatkan kecepatan reaksi (Lehniger, 1997). Hal ini disebabkan

semua molekul enzim telah membentuk ikatan kompleks dengan substrat yang

selanjutnya kenaikan konsentrasi substrat tidak berpengaruh terhadap kecepatan

reaksinya (Trenggono dan Sutardi, 1990).

2.4.6 Konsentrasi Inokulum

Inokulum merupakan biakan bakteri yang dimasukkan kedalam media cair

yang siap digunakan untuk fermentasi (Pelczar, dkk., 2007). Kadar inokulum pada
 19

fermentasi menunjukkan pengaruh terhadap produk fermentasi. Hasil biosintesis

EPS dengan variasi inokulum 1,0, 2,5, 5,0, 10, 15 dan 20 mL/L menghasilkan

jumlah eksopolisakarida tertinggi yaitu 650 mg/L pada konsentrasi inokulum 10

mL/L (Haroun, dkk., 2013).

2.5 Eksopolisakarida

Eksopolisakarida (EPS) merupakan polimer dari gula pereduksi dengan

berat molekul tinggi yang disekresikan oleh mikroorganisme ke lingkungan

eksternalnya. Polimer ini merupakan salah satu polimer yang mampu disintesis

oleh bakteri asam laktat. EPS umumnya terdiri dari monosakarida dan beberapa

substituen non-karbohidrat seperti asetat, piruvat, suksinat, dan fosfat (Van

Hijum, dkk., 2002) juga biomolekul seperti protein, asam nukleat, lipid dan zat

humat (Vu, dkk., 2009).

EPS biasanya dihasilkan oleh bakteri asam laktat yang merupakan ciri

kontribusi bakteri ini sebagai probiotik yang memiliki efek positif bagi kesehatan

(Suresh dan Mody, 2009). Polimer ini memiliki daya bioaktivasi yang dapat

digunakan dalam penggunaan obat seperti fungsinya sebagai anti virus, anti

inflamasi (Llamas, dkk., 2010). EPS dalam industri makanan dapat berfungsi

sebagai pengental, pembuatan gel hingga pengemulsi. Beberapa EPS yang telah

banyak digunakan dalam bidang kesehatan diantaranya β-glukan, β-mannan,

xanthan, curdlan, gellan, dan dekstran (Malik dkk, 2008). Struktur

eksopolisakarida sangat beragam, beberapa jenis eksopolisakarida antara lain :

 20

1. Dekstran

Dekstran merupakan polimer kompleks dari glukosa yang mengalami

percabangan dengan membentuk ikatan α-1,6 dan α-1,3 glikosidik.

Dekstran yang di biosintesis oleh bakteri asam laktat memiliki berat

molekul yang besar antara 10–150 kDa. Dekstran dalam bidang kesehatan

memiliki fungsi yang beragam seperti anti inflamasi, anti trombotik, anti

koagulan, hingga memiliki peran yang penting sebagai intraarterial dan

intravenous (Veronese and Caliceti, 2006).

Gambar 2.5.1 Struktur Dextran (Lapasin, 1999)

2. Kefiran

Kefiran merupakan kapsular polisakarida yang diproduksi oleh strain

Lactobacillus pada pembuatan susu fermentasi kefir. Struktur polimer

kefiran dibentuk dari monomer D-glukosa atau heteropolisakarida D-

galaktosa yang mengalami percabangan pada dua unit rantai serta delapan
 21

unit rantai. Polimer ini menunjukkan aktivitas anti bakteri, anti jamur, dan

anti kanker (Vu, dkk., 2009).

Gambar 2.5.2 Struktur Kefiran (Micheli, dkk., 1999)

3. Gellan

Gellan merupakan polimer linier yang bermuatan negatif (anionik

polisakarida). Polimernya tersusun dari perulangan tetrasakarida unit yang

merupakan kombinasi antara dua molekul glukosa dengan asam D-

glukoronat atau L-ramnosa. Gellan biasanya digunakan untuk mensubtitusi

agar, juga dapat digunakan sebagai eksipien obat sebagai bagian dari drug

delivery system (Vu, dkk., 2009; Fialho, dkk., 2008).

Gambar 2.5.3. Struktur Gellan (Lapasin, 1999)

 22

4. Curdlan

Curdlan merupakan polimer linier yang terbentuk dari ikatan β-1,3-

glikosidik dari D-glukosa. Polimer ini bersifat sangat larut dalam air.

Curdlan dapat dihasilkan dari bakteri strain Alcaligenes faecalis dan juga

Agrobacterium. Keunikan curdlan adalah sifat gelnya yang elastis ketika

dipanaskan pada suhu di atas 55 °C, sehingga sering digunakan untuk

memperbaiki tekstur makanan dan dalam bidang farmasi dijadikan sebagai

polimer yang berfungsi sebagai eksipien drug delivery (Rehm, 2009;

Gumadi, dkk., 2005).

Gambar 2.5.4. Struktur Curdlan (Jin, dkk., 2010)

5. Xanthan

Xanthan merupakan heteropolimer anionik yang disusun oleh glukosa

dengan rantai samping trisakarida dari α-D-manosa yang memiliki gugus

asetil. Xanthan diproduksi oleh strain Xanthomonas dengan berat molekul

yang sangat besar (Rehm, 2009). Sifat yang ditunjukkan xanthan adalah

pseudoplastik dan pengemulsi yang stabil, sehingga kegunaannya sangat

luas dibidang industri makanan, kosmetik, maupun farmasi (Sutherland,

1999).
 23

Gambar 2.5.5. Struktur Xanthan (Sutherland, 2001)

6. Alginat

Alginat merupakan homopolimer linier dari kopolimer D-manuronat yang

membentuk ikatan β-1,4-glikosidik dan epimer α-L-glukoronat. Alginat

banyak ditemukan pada tumbuh-tumbuhan terutama rumput laut. Alginat

dalam bidang farmasi digunakan untuk eksipien (gavicson, bisodol dan

asilone) dan dapat membentuk gel yang stabil. Sediaan bahan obat yang

banyak beredar di pasaran adalah kalsium alginat (Raymond, 2009).

Gambar 2.5.6. Struktur Alginat (Ertesvag, 1998)

7. Pullulan

Pullulan merupakan polimer yang tersusun atas unit maltotriosa. Ikatan

yang terdapat pada unit maltotriosa adalah α-1,4-glikosidik, sedangkan

unit-unit maltotriosa dihubungkan dengan ikatan α-1,6-glikosidik.

 24

Penggunaan pullulan yang paling dikenal adalah pada produk-produk yang

berhubungan dengan penyegar dan pembersih mulut (Raymond, 2009).

Gambar 2.5.7. Struktur Pullulan (Vu, dkk., 2009)

2.6 Biosintesis Eksopolisakarida

EPS disintesis oleh bakteri gram-positif atau gram-negatif , melalui dua

mekanisme yang sangat berbeda. EPS Bakteri gram-positif (seperti: levan,

alternan dan dextran) disintesis oleh proses ekstraseluler (Vanhooren, dkk., 1998)

tapi pada bakteri gram-negatif, EPS disintesis secara intraseluler (seperti: xanthan,

gellan, selulosa, suksinoglikan) (Sutherland, 2001). Berikut adalah gambar jalur

biosintesis EPS:
Gambar 2.5.8 Jalur Biosintesis EPS (De Vuyst, dkk. 2007)
25
 26

Biosintesis EPS jenis heteropolisakarida (HePS) menggunakan substrat

berupa sukrosa terdiri atas beberapa tahapan. Substrat sukrosa diubah menjadi

sukrosa 6-P melaului jalur Phosphoenolpyruvate-phosphotransferase system

(PEP-PTS), kemudian dihidrolisis menjadi fruktosa dan glukosa 6-P yang

dikatalisis oleh enzim SacA/ScrB (sukrosa 6-fosfat hidrolase), fruktosa dan

glukosa 6-P tersebut dapat diubah menjadi fruktosa 6-P dengan katalis enzim

SacK/ScrK (6-fruktokinase). Fruktosa 6-P menjadi glukosamin 6-P dengan katalis

enzim GlmS (glutamin-fruktosa 6-fosfat transaminase), glukosamin 6-P menjadi

N-asetil-glukosamin 6-P dengan katalis enzim NagA (N-asetilglukosamin 6-fosfat

deasetilase), N-asetilglukosamin 6-P menjadi N-asetilglukosamin 1-P dengan

katalis enzim NagM (N-asetilglukosamin fosfomutase), N-asetilglukosamin 1-P

menjadi UDP-N-asetilglukosamin dengan katalis enzim GlmU (UDP-N-

asetilglukosamin pirofosforilase), UDP-N-asetilglukosamin melakukan

pengulangan unit baik rantai maupun cabang dengan bantuan Glikosiltransferase.

Setelah terjadi penggabungan, selanjutnya polisakarida yang terbentuk

dikeluarkan dari sel dan terlarut di media fermentasi.

Biosintesis HePS melalui pengubahan Fruktosa 6-P menjadi mannosa 6-P

dengan katalis enzim MannA (mannosa 6-fosfat isomerase), kemudian mannosa

6-P menjadi mannosa 1-P dikatalisis oleh enzim mannB (fosfomannomutase),

mannosa 1-P menjadi GDP-mannosa dikatalisis oleh enzim Gtp (mannosa 1-fosfat

guaniltransferase), GDP-mannosa menjadi GDP-4-dehidro-6-deoksimannosa

dikatalisis oleh enzim Gmd (GDP-mannosa-4,6-dehidratase), GDP-4-dehidro-6-

deoksimannosa menjadi GDP fukosa dikatalisis oleh enzim GDP-fukosa sintase,

kemudian nukleotida gula berupa GTF (glikosiltransferase) berperan untuk

 27

menggabungkan monosakarida-monosakarida yang melakukan pengulangan unit

hingga membentuk HePS.

Biosintesis intraseluler diatur oleh enzim yang terletak pada berbagai

bagian sel (Gambar 2.5.8.). Pada sitoplasma, glukosa-1-fosfat dikonversi ke

molekul utama pada sintesis eksopolisakarida, uridin difosfat glukosa (UDP-

glukosa). Setelah itu, pada membran periplasmik sel, glikosiltransferase

mentransfer gula nukleosida difosfat (NDP) untuk membentuk pengulangan unit

melekat pada sebuah lipid pembawa glikosil. Kemudian makromolekul

dipolimerisasi dan disekresikan dalam bentuk eksopolisakarida (Kumar, dkk.,

2007).

2.7 Bakteri Asam Laktat

Bakteri asam laktat seperti Lactobacillus termasuk golongan organisme

food-grade yang memiliki status GRAS (Generally Recognized as Safe) dan

diketahui memproduksi sejumlah jenis molekul ekstraseluler polisakarida (EPS)

yang berkontribusi untuk tekstur pada makanan fermentasi. EPS dibagi dua

golongan yaitu homopolisakarida dan heteropolisakarida. EPS dari bakteri ini

memungkinkan pengembangan generasi baru dari food-grade polisakarida.

Bakteri asam laktat juga sering berkontribusi positif pada rasa, bau, atau

preservasi dari produk akhir (Van Hijum, dkk., 2002; De Vuyst, dkk., 2001).

Bakteri Asam Laktat (BAL) telah digunakan secara luas dalam industri

pangan sebagai kultur starter untuk berbagai ragam fermentasi daging, susu,

sayuran, roti, atau produk bakteri. Bakteri asam laktat dikenal pula sebagai agen

biokontrol untuk meningkatkan keamanan pangan olah minimal yang direfrigerasi

 28

tanpa penambahan asam (Rahmadi, dkk., 2002). Peranan bakteri asam laktat

adalah untuk memperbaiki cita rasa, tetapi bakteri asam laktat ini ternyata juga

memiliki efek pengawetan pada produk fermentasi yang dihasilkan. Bakteri asam

laktat dapat memproduksi dan melakukan sekresi berupa senyawa penghambat

selain asam laktat dan asam asetat, seperti hidrogen peroksida, bakteriosin,

antibiotik, dan reuterin yang kurang dikenal atau belum terungkap kemampuannya

sebagai senyawa penghambat.

Bakteri asam laktat bersifat Gram-positif, tidak membentuk spora dan

dapat berbentuk koki, kokobasili atau batang, dan mempunyai komposisi basa

DNA kurang dari 50 % mol G + C. Pada umumnya tidak mempunyai katalase,

walupun katalase semu dideteksi dalam kultur yang ditumbuhkan pada

konsentrasi gula rendah, dan membutuhkan karbohidrat yang dapat difermentasi

untuk pertumbuhannya (Jenie, 1996, Djide, 2005). Glukosa akan dikonversi

menjadi asam laktat (homofermentatif), atau karbon dioksida, etanol, atau menjadi

asam asetat (heterofermentatif).

2.7.1 Bakteri Asam Laktat Penghasil Eksopolisakarida

Bakteri asam laktat terutama dari genus Lactococcus, Lactobacillus,

Leuconostoc, Pediococcus, dan Steptococcus telah digunakan secara tradisional

sebagai kultur starter untuk fermentasi makanan dan minuman karena

kontribusinya terhadap pembentukan citarasa dan aroma serta penghambatan

kerusakan (Jenie, 1996). Kontribusi terhadap sifat-sifat organoleptik dan

pengawetan dilakukan dengan memproduksi secara in situ senyawa-senyawa

seperti asam laktat dan asetat, hidrogen proksida, bakteriosin, dan lain-lain.
 29

Terdapat kira-kira 30 spesies lactobacillus yang dapat memproduksi EPS.

Diantaranya adalah L. casei, L. acidophilus, L. brevis, L. curvats, L. delbrueckii

bulgaricus, L. helveticus, L. rhamnosus, L. plantarum, L. johnsonii dll. Spesies

bakteri tersebut dikultivasi antara 30 sampai dengan 37 oC pada media MRS (Man

Rogosa Sharp), susu atau turunannya (Badel, dkk., 2011). Turunan susu (media

berbasis laktosa) dan MRS (media berbasis glukosa) adalah media yang paling

disarankan untuk memproduksi EPS menggunakan Lactobacillus. Adanya media

karbohidrat kompleks terutama dalam ekstrak ragi menegaskan bahwa media

kompleks tidak tepat jika digunakan sebagai media untuk ekstraksi polisakarida

dan analisis (Cerning, dkk., 1992). Beberapa jenis bakteri asam laktat penghasil

EPS yang telah diteliti oleh beberapa peneliti kurun waktu 10 tahun terakhir dapat

dilihat pada Tabel 2.7.1.

 30

Tabel 2.7.1 Kondisi ferementasi untuk menghasilkan EPS

Strain Bakteri Karakter Fermentasi Produk EPS Referensi

Lactobacillus Semi-Defined Broth 641,7 mg/L Wang, dkk.,

plantarum dengan suhu 31oC selama 2014
70810 24 jam

Nostoc Media 200 mL BG11, 1210 mg/L Hussein, dkk.,

carneum dengan suhu 30oC selama 2015
49 hari

Micrococcus Medium cair yang 13600 mg/L Asker, dkk.,

luteus mengandung 30 g sukrosa, 2014
1,0 g ekstrak daging sapi,
0,5 g (NH4)2SO4, 2,5 g
K2HPO4.3H2O, 2,5 g
KH2PO4, 1,0 g NaCl, 0,2 g
MgSO4.7H2O, dan 0,001 g
FeSO4.7H2O dalam 1000
mL air pada pH 7,0
dengan suhu 30oC selama
5 hari

Lactobacillus MRS yang disuplementasi Glukosa: 130,08 Berecka, dkk.,

rhamnosus oleh gula (20 g/L: glukosa, mg/L 2013
galaktosa, sukrosa
maltosa, laktosa) yang Galaktosa: 81,08
dikultivasi dalam mg/L
bioreaktor 1,5 L
Laktosa: 219,25
mg/L

Sukrosa: 31,55
mg/L

Maltosa: 37,37
mg/L

Pleurotus Media cair mengandung 6150 mg/L Sun, dkk.,

eryngii SI-02 200 g/L ekstrak kentang 2013
20 g/L, glukosa 20 g/L,
ekstrak ragi 3 g/L, pepton
0,3 g/L, KH2PO4 1,5 g/L,
dan MgSO4.7H2O 1 g/L
dengan pH alami dan
diinkubasi pada 25oC
selama 24 jam tanpa
pengocokan
 31

2.7.2 Lactobacillus plantarum

Lactobacillus plantarum adalah bakteri gram-positif, non patogen yang

secara alami terdapat dalam air liur manusia dan sistem pencernaan. Bakteri ini

termasuk ke dalam Bakteri Asam Laktat (BAL), dan secara umum digunakan

pada fermentasi makanan. Jika digunakan sebagai probiotik, aplikasi bioterapi

dari Lactobacillus plantarum meningkat. Lactobacillus plantarum berbentuk

batang, dan mempunyai genom yang terbesar dibandingkan dengan BAL lainnya

yang telah disekuensi. BAL ini dapat hidup dengan oksigen atau tanpa oksigen

(fakultatif anaerobik) dan dapat merubah oksigen menjadi hidrogen peroksida

pada jalur mangan-dependen (Jiang, dkk., 2016).

Gambar 2.7.2 Bakteri Lactobacillus plantarum (Arasu, dkk., 2015)

Genus bakteri ini juga bersifat mikroaerofilik, katalase negatif, gram positif dan

memfermentasi gula dengan asam laktat sebagai produk utama. Berikut adalah

Klasifikasi ilmiah dari L. plantarum:

Kerajaan : Bacteria
Divisi : Firmicutes
Kelas : Bacilli
Ordo : Lactobacillales
Famili : Lactobacillaceae
Genus : Lactobacillus
Spesies : L. plantarum
 32

2.8 Pengukuran Brix

Derajat brix adalah jumlah zat padat semu yang larut (satuan gram) dalam

setiap 100 g larutan (Kuswurj, 2008). Diperlukan suatu alat ukur untuk

mengetahui banyaknya zat padat yang terlarut dalam larutan (brix). Adapun

pengukuran brix dapat dilakukan dengan berbagai cara sebagai berikut (Kuswurj,

2008):

1. Pengukuran brix dengan piknometer

Prinsip pengukuran brix dengan piknometer adalah dengan mengetahui

volume piknometer pada suhu tertentu, maka kerapatan suatu zat dapat

dihitung dengan membandingkan massa zat dengan volume piknometer.

Alat ini terbuat dari gelas berbentuk seperti botol kecil dilengkapi dengan

tutup lubang kapiler. Alat ini mempunyai volume tertentu dan dibuat

sedemikian sehingga pada to yang sama selalu terukur volume yang sama

(Kuswurj, 2008).

Gambar 2.8.1. Piknometer

 33

2. Penentuan brix dengan hidrometer (timbangan brix)

Alat ini paling umum digunakan di pabrik, karena pemakaiannya mudah

dan cepat. Terbuat dari bahan gelas, berbentuk silindris yang bagian

bawahnya berbentuk bola. Pada bagian atas meruncing dan terdapat skala

yang meunjukkan derajat brix. Prinsip kerjanya adalah bahwa gaya ke atas

yang dialami oleh suatu benda yang dicelupkan dalam caran tergantung

dari berat jenis cairan. Jadi semakin kecil berat jenis maka hidrometer

semakin tenggelam. Kemudian brix akan ditunjukkan pada skala yang

berada di permukaan cairan tersebut (Kuswurj, 2008).

Gambar 2.8.2. Hidrometer

3. Pengukuran brix dengan refraktometer

Menurut Kuswurj (2008), indeks bias suatu larutan gula atau nira

mempunyai hubungan yang erat dengan brix. Indeks bias nira yang diukur,

dapat digunakan untuk mneghitung brix nira. Alat untuk mengukur brix

dengan indeks bias disebut refraktometer. Kelebihan alat ini adalah sampel

nira yang digunakan sedikit dan alatnya tidak mudah rusak. Metode

pengukuran brix dengan refraktometer dipilih dalam penelitian ini karena

dapat dilakukan dengan cepat dan mudah, dalam skala laboratorium.

Kekurangan dalam metode ini adalah akan menjadi sangat tidak efektif

dalam skala industri.

 34

Gambar 2.8.3. Hand Brix Refactometer

2.9 Pengukuran Kadar Total Gula Menggunakan Metode Sulfat-Fenol

Metode kimia yang diterapkan pada penentuan gula total adalah metode

sulfat-fenol dan metode anthron, merupakan metode klasik dengan sejarah yang

panjang dalam penggunaannya, walaupun begitu metode sulfat–fenol lebih

popular dibandingkan dengan metode anthrone. Metode sulfat–fenol dapat

dimanfaatkan untuk menentukan kadar glukosa dalam sampel (Brummer, 2005).

Gula merupakan golongan karbohidrat. Apabila karbohidrat ditambahkan

asam kuat dan dipanaskan, karbohidrat tersebut akan mengalami serangkaian

reaksi yang mengarah pada pembentukan derifat furan seperti furanaldehid dan

hidroksimetil furaldehida. Reaksi awal yaitu reaksi dehidrasi diikuti dengan

pembentukan turunan furan (Brummer, 2005). Reaksi dehidrasi karbohidrat dapat

dilihat pada Gambar 2.3.

Gambar 2.9.1. Reaksi dehidrasi karbohidrat

 35

Senyawa turunan furan yang terbentuk tergantung pada jenis karbohidrat

yang ada. Turunan furan yang terbentuk dapat dilihat pada gambar 2.9.2

Gambar 2.9.2. (a) Pentosa, (b) Heksosa, (c) 6-dioksiheksosa, (d) Keto-heksosa

Prinsip dasar dari metode ini adalah bahwa karbohidrat, ketika didehidrasi

melalui reaksi dengan asam sulfat pekat, menghasilkan turunan furfural. Reaksi

selanjutnya antara turunan furfural dan fenol menghasilkan warna yang dapat

dideteksi (Albalasmeh, 2013).

2.10 Spektrofotometer UV-Vis

Spektrofotometer yang sesuai untuk pengukuran di daerah spektrum

ultraviolet dan sinar tampak terdiri atas suatu sistem optik dengan kemampuan

menghasilkan sinar monokromatis dalam jangkauan panjang gelombang 200–800

nm (Gandjar dan Rohman, 2007). Senyawa organik mampu mengabsorbsi cahaya,

sebab semua senyawa organik mengandung elektron valensi yang dapat dieksitasi

ke tingkat energi yang lebih tinggi. (Melanti, 2013). Penyelidikan spektroskopi

senyawa-senyawa organik dilakukan pada daerah ultraviolet yang panjang

gelombangnya lebih besar dari 185 nm. Pengabsorbsian sinar ultraviolet dan sinar

tampak yang panjang gelombangnya lebih besar terbatas pada sejumlah gugus

fungsional yang mengandung elektron valensi dengan energi eksitasi rendah

(Pertiwi, 2009).
 36

Berikut adalah gambar diagram skematis spektrofotometer UV-Vis (Gandjar

dan Rohman, 2007):

Gambar 2.10. Bagian-bagian spektrometer UV-Vis double beam

1) Sumber-sumber lampu; lampu-lampu yang digunakan untuk daerah UV

pada panjang gelombang 190–350 nm, sementara lampu halogen kuarsa

atau lampu tungsten digunakan untuk daerah visible (pada panjang

gelombang antara 350–900 nm).

2) Monokromator; digunakan untuk mendispersikan sinar ke dalam

komponen-komponen panjang gelombangnya yang selanjutnya akan

dipilih oleh celah (slit). Monokromator berputar sedemikian rupa sehingga

kisaran panjang gelombang dilewatkan pada sampel sebagai scan

instrument melewati spektrum.

3) Optik-optik; dapat didesain untuk memecah sumber sinar sehingga

sumber sinar melewati dua kompartemen, dan sebagaimana dalam

spektrofotometer berkas ganda (double beam). Suatu larutan blanko dapat

digunakan untuk mengoreksi pembacaan atau spectrum sampel. Balnko

yang paling sering digunakan adalah semua pelarut yag digunakan untuk

melarutkan sampel atau pereaksi.

 37

4) Detektor; berfungsi menangkap cahaya yang diteruskan dari sampel dan

mengubahnya menjadi arus listik. Detektor akan menangkap sinar yang

diteruskan oleh larutan. Sinar kemudian diubah menjadi nyala listrik oleh

amplifier dan dalam rekorder dan ditampilkan dalam bentuk angka-angka

pada reader (komputer). Detektor dapat memberikan respons terhadap

radiasi pada berbagai panjang gelombang.

5) Read out; merupakan suatu sistem baca yang menangkap besarnya isyarat

listrik yang berasal dari detektor.

2.11 Analisis Eksopolisakarida Menggunakan Fourier Transform Infra Red

(FTIR)

Analisis spektra menggunakan FTIR berfungsi untuk menentukan gugus

fungsi yang terdapat dalam eksopolisakarida. Beberapa penelitian menunjukkan

bahwa dalam eksopolisakarida yang diproduksi oleh Lactobacillus plantarum

mengandung beberapa gugus fungsi. Hasil analisis Eksopolisakarida yang

diproduksi oleh Lactobacillus plantarum BC-25 dengan penambahan Se atau

tanpa Se menggunakan Fourier Transform Infra Red (FTIR) pada penelitian

Zhou, dkk., (2016) ditunjukkan pada gambar berikut:

 38

Gambar 2.11.1 Spektra FTIR eksopolisakarida dengan penambahan Se

Gambar 2.11.2 Spektra FTIR eksopolisakarida tanpa penambahan Se

Puncak yang muncul sekitar 3200-3600 cm-1 adalah gugus hidroksil (O-H)

(Kanmani, dkk., 2011). Puncak pada 2930 cm−1 berhubungan dengan vibrasi

peregangan C-H pada cincin gula. Puncak pada 1650 cm−1 termasuk vibrasi

peregangan dari ikatan C=O, dan puncak pada 1064 cm−1 adalah puncak absorpsi
 39

dari polisakarida. Puncak yang muncul pada daerah 1398 cm-1 sampai 1420 cm-1,

pada daerah 1335 cm-1 dan 1248 cm-1 berturut-turut adalah vibrasi peregangan C-

O dan vibrasi bengkokan C-H dan vibrasi peregangan S=O. Absorpsi kuat yang

tidak lebih dari daerah 950 cm-1 to 1200 cm−1 didominasi oleh cincin piranosa

ikatan eter C-O-C dan vibrasi peregangan gugus hidroksil alkohol O-H (Ye, dkk.,

2014). Absorpsi pada 1030 cm-1 menunjukkan glukosil (Patel, dkk., 2012),

absorpsi pada 879 cm-1 dan 810 cm-1 berhubungan dengan adanya mannosa.

Sedangkan penelitian lainnya mengungkapkan bahwa analisis spektra

FTIR dari eksopolisakarida yang diproduksi oleh Lactobacillus plantarum

NTMI05 menunjukkan adanya peregangan yang luas pada daerah 3275,62 cm−1

(gugus O-H), dimana hal ini mewakili vibrasi peregangan dari gugus karboksil

karbohidrat.

Gambar 2.11.3 (a) spektra FTIR eksopolisakarida yang diproduksi oleh L.

plantarum NTMI05, (b) spektra FTIR eksopolisakarida yang diproduksi
oleh L. plantarum NTMI20

Peregangan gugus C-C ditunjukkan melalui pita absorpsi pada 1637.25

cm−1 (Gambar 2.11.3. a). Pita absorpsi pada daerah 1320–1000 cm-1, biasanya

mewakili vibrasi peregangan dari gugus alkohol, asam karboksilat, ester dan eter
 40

(C-O), dimana seluruhnya identik dengan puncak absorpsi dari polisakarida. Pita

absorpsi tajam pada 1026,46 cm−1 mewakili vibrasi peregangan C-O. Daerah

frekuensi dari 1200 sampai 800 cm−1 adalah daerah fingerprint dan dapat

digunakan untuk mengkarakterisasi polisakarida yang berbeda. Pita absorpsi pada

1218 cm−1 biasanya mewakili vibrasi peregangan dari C alkohol, asam

karboksilat, ester dan eter. Spektra FTIR dari EPS yang diproduksi oleh L.

plantarum NTMI20 ditunjukkan pada gambar 2.11.3 (b). pita absorpsi sekitar

3283.87 cm−1 (gugus O-H), 1644.56 cm−1 (gugus C-C), 1216.13 cm−1 (gugus C-

O), 1409.87, (C-C) dan 1025.53 (gugus C-O) adalah puncak absorpsi dari

polisakarida.
 BAB III
METODE PENELITIAN

3.1 Waktu dan Tempat Penelitian

Penelitian ini dilaksanakan pada bulan Mei–November 2016 di
Laboratorium Bioteknologi, Laboratorium Instrumentasi UV-Vis, Laboratorium
Instrumentasi FTIR Jurusan Kimia Fakultas Sains dan Teknologi Universitas
Islam Negeri (UIN) Maulana Malik Ibrahim Malang.

3.2 Alat dan Bahan

3.2.1 Alat
Alat-alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah gelas beker 500 mL,
pipet ukur 5 mL dan 10 mL, pipet tetes, gelas ukur 100 mL, erlenmeyer 250 mL,
labu ukur 10 mL, 25 mL, dan 100 mL, bola hisap, botol semprot, spatula, gelas
arloji, batang pengaduk, korek api, bunsen spiritus, kawat ose, corong gelas,
cawan petri, penangas air, mikro pipet, blue tip, hot plate, tabung reaksi, rak
tabung, tabung sentrifuge, sentrifuge, magnetic stirrer, autoclave, shaker
incubator, lemari asap, oven, lemari es, laminar air flow, vortex, UV−Vis dan
FTIR.
3.2.2 Bahan
Bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah tetes tebu yang
diperoleh dari limbah Pabrik Gula Krebet Malang, MRSA (de Mann Rogose
Sharpe Agar) MRSB ( de Mann Rogose Sharpe Broth ), urea, etanol PA 96%,
alkohol 70% untuk desinfektan, kertas saring halus, fenol 5%, H2SO4 98%, NaOH
0,5 N, H2C2O4 0,5 N, NaCl, KBr, aquades, kapas, kertas label, aluminium foil,
plastik wrap, plastik, karet, dan starter Lactabacillus plantarum.

3.3 Rancangan Penelitian

Rancangan penelitian ini terdiri dari dua tahap. Tahap pertama merupakan
Rancangan Acak Kelompok (RAK) faktorial 2x3. Faktor pertama adalah variasi
suhu (S1= 25 oC, S2= 30 oC, S3=35 oC) dan faktor kedua adalah variasi lama
fermentasi (L1= 18 jam, dan L2= 24 jam). Perlakuan dilakukan pengulangan

42
 43

sebanyak tiga kali. Kombinasi perlakuan suhu dan lama fermentasi digambarkan
pada Tabel 3.3.
Tabel 3.3 Kombinasi Perlakuan antara Suhu dengan Lama Fermentasi
L L1=18 jam L2=24 jam

S1=25 oC S1L1 S1L2

S2=30 oC S2L1 S2L2

S3=35 oC S3L1 S3L2

Tahap kedua dari penelitian ini adalah deskriptif eksploratif untuk mengetahui
komposisi senyawa gula beserta strukturnya dari hasil analisis menggunakan
FTIR.
Variabel bebas pada penelitian ini adalah suhu dan lama fermentasi,
sedangkan variabel terikatnya adalah kadar eksopolisakarida, kadar total gula
eksopolisakarida dan kadar gula terpakai selama fermentasi. Sampel tetes tebu
diukur brixnya dan dibuat konsentrasi 18 % (v/v), kemudian dilakukan
perhitungan kadar total gula menggunakan metode sulfat fenol. Setelah
mengetahui kadar total gula yang terkandung dalam sampel tetes tebu sebelum
fermentasi, dilakukan uji pengaruh suhu dan lama fermentasi terhadap produksi
eksopolisakarida. Selanjutnya dilakukan perhitungan kadar gula sisa fermentasi
untuk mengetahui kadar gula terpakai oleh Lactobacillus plantarum dalam proses
fermentasi, kemudian dilakukan identifikasi komposisi senyawa gula penyusun
eksopolisakarida dengan randemen tertinggi. Proses identifikasi komposisi
senyawa gula penyusun dalam eksopolisakarida hasil produksi dengan randemen
tertinggi dilakukan menggunakan instrumen Fourier Transform Infra Red (FTIR).

3.4 Tahapan Penelitian

Penelitian ini dilakukan melalui tahapan-tahapan berikut:
1. Preparasi sampel;
2. Analisis kadar total gula metode Fenol H2SO4;
3. Preparasi Bakteri Lactobacillus plantarum;
 44

4. Uji pengaruh suhu dan lama fermentasi terhadap produksi

eksopolisakarida;
5. Isolasi eksopolisakarida;
6. Identifikasi gugus fungsi eksopolisakarida menggunakan Fourier
Transform Infra Red (FTIR);
7. Analisis data.

3.5 Pelaksanaan Penelitian

3.5.1. Preparasi Sampel
3.5.1.1 Srerilisasi Alat
Seluruh alat gelas yang akan digunakan dalam penelitian dicuci dan
dikeringkan terlebih dahulu. Kemudian dibungkus dengan aluminium foil atau
ditutup dengan kapas dan plastik wrap. Semua alat gelas disterilisasi dalam
autoklaf pada suhu 121 oC dengan tekanan 15 psi selama 15 menit.
3.5.1.2 Pengukuran Brix (Kultsum, 2009)
Sebanyak 3 mL tetes tebu dimasukkan ke dalam alat hand brix
refractometer, yaitu pada celah antara prisma penutup yang kering dengan yang
basah. Diamati garis antara gelap dengan terang tepat pada titik potong sumbunya.
Skala (berupa angka) dapat diketahui dengan mengatur ketepatan batas antara
gelap dan terang tersebut, serta tidak boleh terlihat garis pelangi di antaranya.
3.5.1.3 Preparasi Tetes Tebu
Tetes tebu yang telah diketahui nilai brixnya dibuat dengan konsentrasi 18
% (v/v). Tetes tebu dimasukkan ke dalam 18 erlenmeyer 250 mL, masing-masing
erlenmeyer diisi sebanyak 100 mL dan ditambahkan urea sebanyak 0,3 %.
Selanjutnya disterilisasi dengan autoklaf pada suhu 121oC dengan tekanan 15 psi
selama 15 menit.
3.5.2Analisis Kadar Total Gula Metode Fenol H2SO4 (Dubois dkk., 1956)
3.5.2.1 Pembuatan Kurva Standar Glukosa dengan Metode Fenol H2SO4
(Dubois dkk., 1956)
Sebanyak 2 mL larutan glukosa standar yang mengandung 10, 20, 30, 40,
50, dan 60 ppm glukosa masing-masing dimasukkan ke dalam tabung reaksi,
ditambahkan 1 mL larutan fenol 5 % (b/v) dan divortex. Kemudian 5 mL asam
 45

sulfat pekat ditambahkan dengan cepat, divortex lalu tempatkan dalam penangas
air selama 15 menit dan diukur absorbansinya pada panjang gelombang 485 nm.
Selanjutnya ditentukan nilai regresi linier.
3.5.2.2 Perhitungan Kadar Total Gula Tetes Tebu dengan Metode Fenol
H2SO4 (Dubois dkk., 1956)
Dipipet tetes tebu sebanyak 2 mL, dimasukkan ke dalam tabung reaksi,
ditambahkan 1 mL larutan fenol 5 % (b/v) dan divortex. Kemudian 5 mL asam
sulfat pekat ditambahkan dengan cepat. Dibiarkan selama 10 menit, divortex lalu
ditempatkan dalam penangas air selama 15 menit. Absorbansinya diukur pada
panjang gelombang 485 nm. Dihitung kadar total gula pada tetes tebu dengan
mensubtitusikan absorbansi tetes tebu ke persamaan regresi linier dari kurva
standar larutan glukosa standar dan ditentukan nilai total gula tetes tebu dengan
rumus (Lestari, 2013):
Y = ax + b
Keterangan: Y = nilai absorbansi
a = slope
b = intersep
x = kadar gula yang dicari (ppm)
3.5.3 Preparasi Bakteri Lactobacillus plantarum
3.5.3.1Pembuatan Media MRSA
MRS Agar ditimbang Sebanyak 6,2 gram, dilarutkan ke dalam 100 mL
aquades, dihomogenkan dengan hot plate dan magnetic stirrer sampai homogen
dan mendidih. Larutan tersebut kemudian dituangkan sebanyak masing-masing 5
mL ke dalam tabung reaksi dan ditutup memakai cotton plug (sumbat kapas) dan
plastik wrap, dilanjutkan dengan sterilisasi menggunakan autoklaf 121 ºC tekanan
15 psi selama 15 menit. Kemudian disimpan pada cetakan papan miring selama 1
malam sampai memadat.
3.5.3.2 Pembuatan Media MRSB
MRS Broth ditimbang sebanyak 5,515 gram, dilarutkan ke dalam 100 mL
aquades, dihomogenkan dengan hot plate dan magnetic stirrer sampai homogen.
Larutan tersebut kemudian dituangkan masing-masing sebanyak 50 mL ke dalam
labu erlenmeyer 100 mL, ditutup memakai cotton plug (sumbat kapas) dan plastik
 46

wrap, dilanjutkan dengan sterilisasi menggunakan autoklaf 121 ºC tekanan 15 psi

selama 15 menit.
3.5.3.3 Peremajaan Lactobacillus plantarum (Nudyanto dan Zubaidah, 2015)
Kultur diambil dua ose dan ditumbuhkan pada 5 mL media MRSA padat
posisi miring, kemudian diinkubasi pada suhu ruang selama 24 jam. Kultur
tersebut dapat langsung digunakan dan diremajakan setiap dua minggu sekali. L.
plantarum yang telah diremajakan digunakan untuk pembuatan stok inokulum.
3.5.3.4 Pembuatan Stok Inokulum (Kultsum, 2009)
Lactobacillus plantarum yang sudah diregenerasi diambil sebanyak 2 ose,
dimasukkan ke dalam 100 mL media MRSB, ditutup dengan cotton plug (sumbat
kapas) dan plastik wrap, kemudian dishaker dengan kecepatan 100 rpm pada suhu
30 oC selama 24 jam.
3.5.3.5 Pengukuran Optical Density (Yuliana termodifikasi, 2008)
Pengukuran OD menggunakan metode turbiditas dengan cara kultur
diambil sebanyak 4 mL pada media MRSB, kemudian OD diamati menggunakan
instrumen UV–Vis pada panjang gelombang 600 nm. Hasl pengukuran OD
diencerkan sampai nilai OD 0,5.
3.5.3.6 Pengukuran Total Plate Count (TPC) (Fardiaz termodifikasi, 1989)
Pengukuran TPC dilakukan dengan metode sebar, sebanyak 1 mL kultur
pada media MRSB diinokulasikan ke dalam cairan NaCl fisiologis 0,85 % dengan
metode pengenceran bertingkat mulai dari pengenceran 10-1 sampai dengan
pengenceran 10-10. Kemudian penanaman ke media MRSA dimulai dari
pengenceran 10-3 sampai pengenceran 10-10 dan diinkubasi pada suhu ruang
selama 48 jam.
3.5.4 Uji Pengaruh Suhu dan Lama Fermentasi Terhadap Produksi
Eksopolisakarida dari Tetes Tebu (Trabelsi, dkk. termodifikasi, 2014)
Sebanyak 100 mL tetes tebu yang telah disterilisasi ditambahkan inokulum
Lactobacillus plantarum sebanyak 10 %, kemudian dishaker dengan kecepatan
100 rpm selama waktu inkubasi (18 dan 24 jam) dan variasi suhu (25, 30 dan 35
o
C).
 47

3.5.5 Isolasi Eksopolisakarida (Nudyanto dan Zubaidah, 2015)

Sebanyak 25 mL sampel dimasukkan ke tabung sentrifuge 50 ml, kemudian
disentrifugasi pada 5000 rpm selama 20 menit. Supernatan yang mengandung
EPS dari sel bakteri selanjutnya diendapkan dengn etanol dingin (96 %) (2 kali
dari volume) selama semalam. Berikutnya disentrifugasi pada 5000 rpm selama
25 menit. Pellet yang diperoleh dikeringkan pada suhu 105 oC selama 15 menit
lalu ditimbang berat kering EPS dan ditentukan randemennya dengan rumus:

Kadar EPS (mg/L) =

3.5.6 Identifikasi Gugus Fungsi Eksopolisakarida Menggunakan FTIR

(Zhou, dkk., 2016)
Hasil isolasi EPS sebanyak 1 mg digerus dengan bubuk KBr dan kemudian
di tekan vakumkan hingga menjadi pellet. Selanjutnya dianalisis menggunakan
FTIR pada rentang frekuensi 4000 cm-1 sampai 400 cm-1.
3.5.7 Analisis Data
Setelah dilakukan serangkaian prosedur penelitian di atas, maka diperoleh
data dari dua tahapan penelitian. Data dari tahap pertama adalah kadar EPS, kadar
total gula EPS dan kadar gula terpakai selama fermentasi, sedangkan data dari
tahap kedua adalah gugus fungsi penyusun dari eksopolisakarida dengan kadar
total gula tertinggi setelah dilakukan analisis menggunakan FTIR. Data dari tahap
pertama dianalisis menggunakan analisis ragam varian (Two Way ANOVA) dan
dilanjutkan dengan uji BNJ (Beda Nyata Jujur) menggunakan selang kepercayaan
5 %.
 BAB IV
HASIL DAN PEMBAHASAN

4.1 Preparasi Sampel

Analisis bahan baku meliputi pengukuran nilai % brix tetes tebu dan

pengukuran kadar total gula tetes tebu. Menurut Hartina (2014), kadar total gula

dan nilai % brix dari tetes tebu dipengaruhi oleh tingkat kematangan tebu, varietas

tebu, kondisi iklim maupun kondisi tanah. Sampel tetes tebu berasal dari Pabrik

Gula Krebet Malang diperoleh dari agen tetes tebu di sekitar pabrik. Tetes tebu

tersebut diukur nilai brix nya menggunakan hand brix refractometer. Hasil skala

yang terbaca dikonversikan ke dalam % brix. Nilai % brix tetes tebu

mempengaruhi kadar total gulanya. Semakin tinggi kadar total gula yang

terkandung dalam tetes tebu maka semakin tinggi juga nilai % brix dan begitu

juga sebaliknya. Kadar total gula tetes tebu diperoleh dengan mensubtitusikan

absorbansi tetes tebu ke persamaan regresi linear dari kurva standar larutan

glukosa standar. Hasil analisis bahan baku sebagaimana tertera pada Tabel 4.1.

Tabel 4.1 Karakteristik bahan baku

Komponen Analisa Hasil

Nilai % Brix 80,03 % brix

Kadar total gula rata-rata 46,90 %

Warna Hitam

Berdasarkan tabel di atas, diperoleh nilai % Brix bahan baku tetes tebu

sebesar 80,03%, dengan kadar total gula rata-rata sebesar 46,90 %. Media dengan

kadar gula yang tinggi kurang baik digunakan sebagai media fermentasi karena

48
 49

akan menyebabkan bakteri mengalami tekanan osmotik yang tinggi, sehingga

bakteri tersebut akan mengalami stress dan sangat mempengaruhi kinerja

fermentasi (Ishmayana, dkk., (2011). Menurut Wanto dan Soebagyo (1980) kadar

gula dalam tetes tebu untuk media fermentasi harus mengandung 12–17%

sehingga diencerkan terlebih dahulu dengan menambahkan air sebanyak empat

kali volume tetes tebu. Oleh karena itu, tetes tebu yang telah diukur nilai % Brix

diencerkan sehingga konsentrasinya menjadi 18% (b/v) dengan cara menimbang

tetes tebu sebanyak 18 gram tetes tebu 80,03% Brix kemudian dilarutkan ke

dalam 100 mL akuades. Selanjutnya tetes tebu dimasukkan ke dalam 18

erlenmeyer 250 mL, masing-masing Erlenmeyer diisi sebanyak 100 mL. Tetes

tebu dengan konsentrasi 18 % dianalisis kadar total gula sebelum fermentasi.

Rata-rata kadar total gula tetes tebu sebelum fermentasi adalah 15,47 %.

Urea sebanyak 0,3% ditambahkan sebagai sumber nitrogen karena

menurut Zubaidah dkk. (2008) unsur nitrogen sangat berpengaruh terhadap

pertumbuhan dan perkembangan bakteri yaitu sebagai pembentuk dinding sel.

Selain itu, Nofemele dkk. (2012) dalam jurnalnya menyebutkan bahwa produksi

etanol secara optimal setelah ditambahkan urea dengan konsentrasi 3 g/L atau

sama dengan 0,3 g/mL ke dalam media tetes tebu, pada konsentrasi ini, hanya

2,4% (b/v) gula yang tidak terfermentasi. Berdasarkan hasil penelitian tersebut

dapat diasumsikan bahwa adanya sumber nitrogen dalam media fermentasi dalam

hal ini tetes tebu dapat meningkatkan nutrisi bagi bakteri sehingga bakteri dapat

tumbuh dan berkembang dengan baik. Menurut Fardiaz (2003), nutrisi yang

dibutuhkan oleh mikrob sebagai sumber energi untuk pertumbuhan,

perkembangan dan biosintesis produk-produk metabolit meliputi air, sumber

 50

karbon, sumber nitrogen, vitamin dan mineral. Sampel yang telah ditambahkan

urea 0,3% disterilisasi denganautoklaf pada suhu 121 oC dengan tekanan 15 psi

selama 15 menit untuk menghilangkan kontaminan mikroorganisme.

4.2 Pembuatan Media

Media yang digunakan untuk regenerasi kultur Lactobacillus plantarum

dan membuat inokulum adalah media dari jenis MRS, yaitu MRSA dan MRSB.

Media MRSA dalam satu liternya mengandung: pepton protease 10 gram, beef

extract 10 gram, yeast extract 5 gram, dekstrosa 20 gram, polisorbat 80 1 gram,

ammonium sitrat 2 gram, sodium asetat 5 gram, magnesium sulfat 0,1 gram,

mangan sulfat 0,05 gram, dipotassium fosfat 2 gram dan agar 15 gram. Media

MRSB mempunyai komposisi yang sama, akan tetapi tidak mengandung agar.

Penggunaan media MRS Agar dan Broth dalam penelitian ini karena MRS

merupakan media selektif yang mengandung glukosa dan mineral yang lebih

disukai oleh Lactobacillus. Hal ini didukung oleh hasil penelitian Haroun, dkk.,

(2013) yang menyebutkan bahwa dari lima macam media (M17 Broth, TGY

Broth, MRS Broth, Nutrient Broth dan Brain Hearth Infusion Broth), MRS Broth

adalah medium yang terbaik dan menghasilkan yield EPS tertinggi, yaitu 650

mg/L.

4.3 Peremajaan dan Pembuatan Inokulum Lactobacillus plantarum

Setelah membuat media, maka tahapan selanjutnya adalah peremajaan

bakteri Lactobacillus plantarum. Peremajaan bakteri bertujuan untuk

memperbarui nutrisi makanan yang terkandung dalam media sehingga bakteri

 51

akan tetap hidup. Peremajaan biakan bakteri Lactobacillus plantarum dilakukan

dengan memindahkan atau memperbarui biakan bakteri dari biakan lama ke

medium tumbuh yang baru secara berkala. Mahmud (2011) meyatakan bahwa

teknik peremajaan biakan merupakan cara paling tradisional yang digunakan

peneliti untuk memelihara koleksi isolat mikroba di laboratorium dan memberikan

penyegaran pada nutrien yang dibutuhkan untuk pertumbuhan bakteri. Charlena,

dkk., (2009) menjelaskan bahwa peremajaan bateri dilakuan untuk mengaktifkan

kembali bakteri yang inaktif karena disimpan dalam lemari pendingin sehingga

bakteri dapat menghasilkan enzim secara optimal. Biakan Lactobacillus

plantarum diremajakan dan diperbanyak dengan cara mengambil satu ose untuk

ditumbuhkan pada 5 mL media MRSA padat dengan posisi miring dan diinkubasi

pada suhu ruang selama 24 jam. Menurut Pelczar dan Chan (2008) waktu inkubasi

yang digunaan untuk peremajaan pada umumnya adalah 24 jam.

Peremajaan ini menggunakan media MRSA, karena sifatnya yang

memadat(agar), sehingga koloni bakteri Lactobacillus plantarum yang digoreskan

menggunakan kawat ose pada permukaan media MRSA miring akan mudah

diamati seperti goresan zig-zag berwarna putih. Proses penanaman bakteri hanya

dilakukan di permukaan media saja. Teknik ini lebih efisien dalam segi ekonomi

dan waktu, akan tetapi memerlukan keterampilan-keterampilan dalam

menggoreskan kultur bakteri sehingga menghasilkan koloni yang terpisah di

sepanjang goresan. Peremajaan kultur bakteri dengan menggunakan medium segar

dengan jenis yang sama seperti medium awal bertujuan untuk mempercepat fase

adaptasi dan mempersiapkan sel pada fase eksponensial. Menurut Hartanti (2010),

bakteri yang berada dalam fase eskponensial atau tahap propagasi ini mensintesis
 52

enzim dan mengatur aktivitasnya sehingga mampu tumbuh lebih efisien dalam

kondisi baru. Peremajaan juga memberikan nutrisi baru bagi bakteri sehingga sel-

selnya dapat tumbuh sehat.

Pembuatan inokulum Lactobacillus plantarum dilakukan menggunakan

media MRSB yang berbentuk cair, karena dibandingkan medium berbentuk padat,

medium cair memiliki beberapa kelebihan yaitu jenis dan konsentrasi komponen-

komponen medium dapat diatur sesuai dengan yang diinginkan, dapat

memberikan kondisi optimum untuk pertumbuhan, dan pemakaian medium lebih

efisien. Adapun Proses fermentasi oleh Lactobacillus plantarum yang dilakukan

dalam penelitian ini termasuk ke dalam kategori fermentasi anaerob karena tidak

membutuhkan oksigen dalam pertumbuhannya.Hasil dari peremajaan diambil

sebanyak dua ose dan dimasukkan ke dalam media MRSB. Kemudian dishaker

pada kecepatan 100 rpm selama 24 jam. Inokulum diambil pada jam ke-24 karena

pada jam ke-24 merupakan jam akhir dari fase logaritmik. Berakhirnya fase

logaritmik menunjukkan bahwa bakteri akan segera memasuki fase stasioner

dimana metabolit sekunder terbentuk karena pada fase tersebut karena kondisi

lingkungan merugikan, terutama kondisi sel yang menjadi kering, kekurangan

nutrisi, komponen racun, kondisi stress dan antagonis. Menurut Yuliana (2007),

bakteri asam laktat mencapai fase logaritmik pada inkubasi 18–24 jam tergantung

media dan jenis BAL.

4.4 Pengukuran Optical Density dan Perhitungan Total Plate Count

Pengukuran Optical Density (OD) termasuk ke dalam metode pengukuran

pertumbuhan mikroorganisme. Metode ini menggunakan kekeruhan/turbiditas

 53

dengan melihat massa sel. Pertumbuhan sel bakteri dalam suatu medium cair

meningkatkan kekeruhan media, sehingga akan mempengaruhi jumlah sinar yang

dapat ditransmisikan menembus medium. Pengukuran OD dari inokulum ini

dilakukan dengan cara mengambil inokulum induk sebanyak 4 mL kemudian

diamati menggunakan spektrofotometer UV-Vis Cary pada panjang gelombang

600 nm. Dimana panjang gelombang yang digunakan disesuaikan dengan warna

komplementer media yang digunakan.Melalui alat ini dapat ditentukan nilai

absorbansi (a) atau kerapatan optik (Optical Density).Pengukuran OD dalam

penelitian ini dilakukan sebanyak tiga kali, yaitu ulangan I, ulangan II dan

ulangan III.

Perhitungan jumlah bakteri menggunakan metode Total Plate Count.Uji

TPC menggunakan media padat MRSA dengan hasil akhir berupa koloni yang

dapat diamati secara visual dan dihitung. Inokulum kerja yang akan di uji TPC

harus diencerkan terlebih dahulu dengan tingkat pengenceran 10-1 sampai dengan

10-10 agar jumlah koloni yang muncul dapat dihitung. Perhitungan koloni

dilakukan pada cawan petri dengan jumlah koloni antara 30–300. Hasil TPC

dinyatakan sebagai jumlah koloni bakteri yang dapat dihitung, dikalikan faktor

pengencerannya. Hasil pengukuran TPC dari masing-masing ulangan secara

berturut-turut adalah 2,17 x 109 cfu, 2,76 x109cfudan2,05 x 109 cfu.

4.5 Analisis Pengaruh Suhu dan Lama Fermentasi Terhadap Produksi

Eksopolisakarida

Produksi eksopolisakarida dari tetes tebu oleh Lactobacillus plantarum

dilakukan dengan variasi perlakuan suhu dan lama fermentasi. Hal ini bertujuan
 54

untuk mengetahui suhu dan lama fermentasi optimum bagi pertumbuhan dan

produksi metabolit sekunder (EPS) dari Lactobacillus plantarum. Tetes tebu

dipilih sebagai substrat fermentasi karena tersedia dan mudah didapat;

mengandung sumber karbon dan sumber nutrisi lainnya yang dibutuhkan bakteri

untuk proses fermentasi; dan harga yang relatif murah. Proses fermentasi ini

melibatkan Lactobacillus plantarum karena merujuk pada hasil penelitian Haroun,

dkk., (2013) menyebutkan bahwa diantara lima strain Lactobacillus,

(Lactobacillus acidophilus NRRL B-4495, Lactobacillus delbrueckii NRRL B-

4525, Lactobacillus plantarum NRRL B-227, Lactobacillus plantarum NRRL B-

4496 dan Lactobacillus plantarum NRRL B-14768) Lactobacillus plantarum

NRRL B-4496 menghasilkan yield EPS tertinggi yaitu 650 mg/L. selain itu,

bakteri dari genus Lactobacillus ini diketahui aman digunakan untuk fermentasi

makanan, dan memiliki daya tahan hidup yang baik dalam saluran pencernaan,

dan memiliki kemampuan untuk menghambat penyakit. Lactobacillus Plantarum

tergolong dalam bakteri fakultatif anaerobik yang dapat hidup dengan oksigen

atau tanpa oksigen, sehingga dapat meminimalisasikan tingkat aerasi dalam

erlenmeyer yang merupakan fungsi dari kecepatan shaker.

Proses fermentasi eksopolisakarida dilakukan dengan menambahkan

inokulum Lactobacillus plantarum sebanyak 10 % ke dalam tetes tebu yang telah

disterilisasi, kemudian dishaker dengan kecepatan 120 rpm selama waktu inkubasi

(18 dan 24 jam) dan suhu (25, 30 dan 35oC). Penggunaan erlenmeyer dalam

fermentasi ini dapat memberikan aerasi yang cukup untuk proses fermentasi.

Tonjolan-tonjolan pipih pada erlenmeyer mempunyai fungsi seperti baffle pada

fermentor skala industri. Selama proses fermentasi berlangsung, erlenmeyer

 55

diletakkan di atas shaker yang kecepatannya dapat diatur. Pengendalian suhu

dilakukan melalui shaker yang dilengkapi dengan penangas air (waterbath).

Gerakan berputar pada shaker ditambah dengan adanya tonjolan-tonjolan pipih di

bagian dasar erlenmeyer menyebabkan medium bergerak sehingga terjadi aerasi.

Tetes tebu mengandung sumber nutrien yang dibutuhkan oleh Lactobacillus

plantarumuntuk mensintesis protoplasma terutama sumber karbon. Sumber

karbon utama yang terkandung dalam tetes tebu adalah sukrosa. Sukrosa tidak

dapat dimanfaatkan secara langsung oleh Lactobacillus plantarum, akan tetapi

disakarida ini melalui proses fermentasi. Proses fermentasi yang berlangsung

merupakan proses katabolisme yang disebabkan oleh aktivitas Lactobacillus

plantarum dimana senyawa substrat sukrosa (disakarida) diubah menjadi senyawa

yang lebih sederhana atau tingkat energinya lebih rendah yaitu ke bentuk glukosa

dan fruktosa (monosakarida). Lactobacillus plantarum memanfaatkan substrat

sukrosa untuk menghasilkan enzim invertase.Enzim invertase adalah enzim yang

berperan dalam pemecahan sukrosa menjadi glukosa dan fruktosa.Reaksi

hidrolisis sukrosa dapat dilihat pada Gambar 4.5.1.

E.Invertase
+ H 2O +

Gambar 4.5.1 Reaksi hidrolisis sukrosa (Iswanto, 2014)

Glukosa dan fruktosa dimanfaatkan oleh Lactobacillus plantarum untuk

pertumbuhan, metabolisme dan konversi EPS.Eksopolisakarida yang disekresikan

ke luar sel bakteri dapat berupa homo EPS atau hetero EPS. Menurut Zhennai

(2000), beberapa spesies BAL dapat menggunakan substrat spesifik berupa

 56

sukrosa untuk memproduksi dextran. Genus bakteri asam laktat seperti

Lactobacillus, Leunostoc dan Streptococcus dikenal sebagai pembentuk EPS jenis

dextran, meskipun masing-masing strain bakteri memproduksi sebuah glukan

yang khas.

Hasil dari produksi eksopolisakarida selanjutnya dimasukkan ke tabung

sentrifuge sebanyak 25 mL, kemudian disentrifugasi pada 5000 rpm selama 20

menit untuk membuang atau memisahkan senyawa dengan sel bakteri. Supernatan

yang mengandung EPS dari sel bakteri selanjutnya diendapkan dengan etanol

dingin (96%) (2 kali dari volume) selama semalam untuk mengendapkan EPS dari

supernatan. Volume pelarut 2 kali volume supernatan adalah untuk mempermudah

laju difusi, karena semakin banyak pelarut maka distribusi partikel akan semakin

besar sehingga dapat memperluas permukaan kontak. Jika rasio luas permukaan

membran dengan volume pelarut besar, maka laju difusi akan berlangsung dengan

cepat. Prosedur demikian merupakan metode pengendapan-dialisis. Dialisis

adalah proses perpindahan molekul terlarut dari suatu campuran larutan yang

terjadi akibat difusi pada membran semipermiabel (pemurnian). Berikutnya

disentrifugasipada 5000 rpm selama 25 menit untuk menghilangkan protein. Pellet

yang diperoleh dikeringkan pada suhu 105oC selama 5 menit lalu ditimbang berat

kering EPS dan ditentukan kadarnya.

Gambar 4.5.2 Hasil produksi eksopolisakarida

 57

Metode demikian dikenal dengan metode gravimetri. Analisis

menggunakan metode gravimetri merupakan metode analisis kuantitatif

berdasarkan berat konstannya, dalam analisis ini, senyawa analit dipisahkan dari

senyawa-senyawa lain yang dianalisis.

Kadar eksopolisakarida tertinggi (740 mg/L) dihasilkan dari perlakuan

S2L1 yaitu suhu 30oC dan lama fermentasi 18 jam, sedangkan kadar

eksopolisakarida terendah (274,7 mg/L) dihasilkan dari perlakuan S1L2 yaitu suhu

25oC dan lama fermentasi 24 jam. Hasil penelitian Haroun, dkk., (2013)

mengungkapkan bahwa yiels EPS meningkat seiring dengan meningkatnya suhu

dan mencapai nilai maksimum sebesar 650 mg/L pada suhu 30oC dan lama

fermentasi 24 jam. Produksi EPS oleh Lactobacillus plantarum menunjukkan

bahwa EPS terakumulasi dalam media tetes tebu selama fase logaritmik yaitu jam

ke-18 dari kurva pertumbuhan Lactobacillus plantarum, dan terkonversi ke

biopolimer aktif selama fase asimilasi. Menurut Richard dan Maria (2003),

sebagian besar produksi EPS terjadi pada waktu 12–24 jam lama fermentasi ketika

asam laktat mulai mengakumulasi sebagian besar kuantitas medium.

Berdasarkan hasil analisis data menggunakan Two Way ANOVA

menunjukkan bahwa suhu, lama fermentasi dan interaksi antara suhu dan lama

fermentasi berpengaruh nyata (sig< 0,05) terhadap kadar eksopolisakarida,oleh

karena itu dilakukan uji lanjut dengan menggunakanuji Beda Nyata Jujur (BNJ).

Hasil analisis uji lanjut dapat dilihat pada Tabel 4.5.1.

 58

Tabel 4.5.1 Uji lanjut Beda Nyata Jujur (BNJ) interaksi suhu dengan lama
fermentasi terhadap kadar eksopolisakarida

Perlakuan Kadar Eksopolisakarida

(mg/L)
S1L1 601,33cd
S1L2 274,67a
S2L1 740d
S2L2 660d
S3L1 489,33bc
S3L2 422,67b
Keterangan : notasi yang sama menunjukkan bahwa perlakuan tidak beda nyata

Tabel 4.5.1 menunjukkan bahwa berdasarkan uji BNJ interaksi antara suhu

dan lama fermentasi dapat ditentukan perbedaan nyata antar perlakuan.S1L1

berbeda nyata terhadap perlakuan S1L2, S2L1, S2L2, S3L1, dan S3L2.Perlakuan S3L1

tidak berbeda nyata dengan perlakuan S3L2, perlakuan S1L1 tidak berbeda nyata

dengan perlakuan S3L1, perlakuan S2L1 tidak berbeda nyata dengan perlakuan

S2L2. Kadar eksopolisakarida tertinggi adalah 740 mg/L pada perlakuan S 2L1,

sedangkan kadar eksopolisakarida terendah 274,67 mg/L pada perlakuan

S1L2.Selain sumber N dan P dalam pertumbuhan dan perkembangan sel bakteri,

sumber karbon merupakan sumber energi utama. Menurut Tallon, dkk., (2006)

dalam Zubaidah, dkk., (2008), menyebutkan bahwa jenis gula sangat berpengaruh

terhadap produksi eksopolisakarida.

4.6 Pengukuran Kadar Total Gula EPS

Kadar total gula penting diukur untuk mengetahui kadar total gula sampel

sebelum fermentasi dan kadar total gula setelah fermentasi, sehingga dapat

diketahui kadar gula yang terpakai pada proses fermentasidengan metode fenol

H2SO4. Metode ini dipilih untuk mengetahui kadar tota gula dalam tetes tebu

maupun eksopolisakarida karena umum digunakan untuk menentukan kandungan

 59

total karbohidrat dari polisakarida bakteri maupun tanaman sebagaimana dalam

penelitian Ortega-Morales, dkk. (2007) dan Xu, dkk., (2010).

Fungsi dari penambahan fenol dalam metode ini adalah sebagai pereaksi

yang akan membentuk senyawa berwarna jika direaksikan dengan furfural atau

derivatnya. Larutan fenol dalam suasana asam dan berkondensasi dengan

monomer gula yang dihasilkan dari proses degradasi akan membentuk senyawa

kompleks berwarna jingga. Intensitas warna larutan berbanding lurus dengan

kandungan karbohidrat dalam sel. Sedangkan penambahan Asam sulfat pekat

berfungsi untuk menghancurkan sel dan mendegradasi polisakarida.

Reaksi ini dapat dijadikan reaksi pengenal untuk karbohidrat. Menurut

Poedjiadi dan Supriyanti (2012) monosakarida umumnya stabil meskipun

ditambahkan asam sulfat encer dan dipanaskan, akan tetapi jika dipanaskan

dengan asam sulfat pekat maka monosakarida tersebut menghasilkan furfural atau

derivatnya melalui reaksi dehidrasi atau pelepasan molekul air. Derivat furfural

yang terbentuk tergantung pada jenis monosakarida yang berhasil didehidrasi

melalui penambahan asam sulfat pekat dan dipanaskan.

Gambar 4.6.1 Reaksi dehidrasi karbohidrat (Iswanto, 2014)

 60

Eksopolisakarida ditimbang sebanyak 10 mg, kemudian dilarutkan ke

dalam 10 mL larutan NaOH 0,5 N. Eksopolisakarida sukar larut dalam air,

sehingga harus dilarutkan ke dalam pelarut asam maupun basa. Menurut Dian

(2000) polisakarida yang dilarutkan dalam basa encer akan menghasilkan

campuran monosakarida yang terdiri dari fruktosa, glukosa dan mannosa. Setelah

melakukan analisis kadar total gula menggunakan metode fenol asam sulfat

terhadap EPS, diperoleh data kadar total gula EPS sebagaimana ditunjukkan oleh

tabel 4.6.1.

Tabel 4.6.1 Rata-rata kadar total gula EPS

Perlakuan Kadar total gula (%)

S1L1 4,24
S1L2 3,97
S2L1 5,97
S2L2 5,93
S3L1 3,07
S3L2 2,99
Keterangan simbol S1= 25 oC, S2= 30 oC, S3=35 oC, L1= 18 jam, dan L2= 24 jam

Hasil analisis Two Way ANOVA menunjukkan bahwa suhu berpengaruh

nyata terhadap kadar total gula EPS, sedangkan lama fermentasi tidak

berpengaruh nyata terhadap kadar total gula EPS. Hal ini dikarenakan tinggi

rendahnya kadar total gula EPS sangat ditentukan oleh tinggi rendahnya kadar

total gula dalam media fermentasi dan inversi selama proses fermentasi. Menurut

Desroisier (1997), besarnya kadar total gula dipengaruhi oleh adanya dekomposisi

sukrosa oleh mikroorganisme menjadi glukosa dan fruktosa, sehingga semakin

tinggi suhu penguapan, laju inversi juga semakin tinggi. Nilai kadar total gula

EPS tertinggi adalah 5,97% pada variasi perlakuan suhu 30oC dengan lama

fermentasi 18 jam, sedangkan nilai kadar total gula EPS terendah adalah 2,99 %

pada perlakuan suhu 35 oC dengan lama fermentasi 24 jam.

 61

4.7 Pengukuran Kadar Gula Terpakai Selama Fermentasi

Setelah melakukan analisis kadar total gula menggunakan metode fenol

asam sulfat terhadap tetes tebu baik sebelum dan sesudah fermentasi, diperoleh

data kadar gula terpakai. Kadar gula terpakai merupakan kadar gula yang

digunakan oleh bakteri asam laktat dalam proses fermentasi.Nilai kadar gula kadar

gula terpakai paling tinggi adalah 14,67 % pada suhu 30oC dengan lama

fermentasi 18 jam, sedangkan kadar gula terpakai paling rendah adalah 12,29 %

pada perlakuan suhu 35 oC selama 24 jam. Berdasarkan hasil analisis data

menggunakan Two Way ANOVA menunjukkan bahwa suhu, lama fermentasi dan

interaksi antara suhu dan lama fermentasi berpengaruh nyata (sig< 0,05) terhadap

kadar gula terpakai selama fermentasi, oleh karena itu dilakukan uji lanjut dengan

menggunakan uji Beda Nyata Jujur (BNJ). Hasil analisis uji lanjut dapat dilihat

pada Tabel 4.7.1.

Tabel 4.7.1 Uji lanjut Beda Nyata Jujur (BNJ) interaksi suhu dengan lama
fermentasi terhadap kadar gula terpakai

Perlakuan Kadar Gula Terpakai (%)

S1L1 14,36b
S1L2 14,28b
S2L1 14,67b
S2L2 12,71a
S3L1 12,42a
S3L2 12,29a
Keterangan : notasi yang sama seperti menunjukkan perlakuan tidak beda nyata

Berdasarkan Tabel 4.7.1, perlakuan S2L2 tidak berbeda nyata dengan

perlakuan S3L1 dan S3L2, sedangkan perlakuan S1L1 tidak berbeda nyata dengan

perlakuan S1L2 dan S2L1. Kadar gula terpakai tertinggi 14,67 % pada perlakuan

S1L1, sedangkan kadar gula terpakai terendah 12,29 % pada perlakuan S3L2.

Kadar gula terpakai tertinggi berkorelasi negatif terhadap kadar eksopolisakarida

tertinggi, hal ini dikarenakan kadar gula yang terpakai pada proses fermentasi
 62

tidak seluruhnya digunakan untuk memproduksi EPS akan tetapi juga digunakan

oleh Lactobacillus plantarum untuk melakukan metabolisme. Selain itu menurut

Zubaidah, dkk., (2008) menyebutkan bahwa medium dengan sumber gula sukrosa

akan dipecah menjadi glukosa dan fruktosa, namun dengan adanya fruktosa akan

menghambat aktivitas enzim pembentuk EPS.

4.8 Hasil Analisis Menggunakan FTIR

Hasil analisis eksopolisakarida dengan kadar gula tertinggi, yaitu pada

perlakuan S2L1 ditunjukkan pada Gambar 4.8.1. Gugus fungsi yang utama EPS

yang diproduksi oleh Lactobacillus plantarum dalam penelitian ini ditentukan

menggunakan FTIR pada bilangan gelombang 400-4000 cm-1, yang

mengindikasikan pola absorpsi yang khas dari suatu polisakarida.

Gambar 4.8.1 Spektra FTIR perlakuan suhu 30 oC selama 18 jam

Menurut Wang, dkk., (2015), Pita serapan yang lemah pada 2920 cm-1

adalah vibrasi stretching asimetris C-H dari gugus CH2 alifatik, dimana

mengindikasikan adanya senyawa organik seperti protein, gula, dsb. Absorpsi

 63

pada panjang gelombang 1637 cm-1serupa dengan vibrasi stretching dari mannosa

atau galaktosa (Kavita, dkk., 2014). Menurut Kang, dkk., (2016), pita serapan

pada daerah 1430 cm-1 menunjukkan vibrasi stretching dari gugus C-O. Vibrasi

stretching simetris pada daerah 1380 cm-1 menunjukkan gugus -COO- (Kavita,

dkk.,2013). Pita serapan sekitar daerah 1200–1000 cm−1didominasi oleh vibrasi

cincin yang tumpang tindih antara vibrasi stretching dari C-OH dan vibrasi dari

ikatan glikosidik C-O-C dari karbohidrat (Zhang, dkk., 2013).

Tabel 4.8.1 Gugus fungsi dari spektra FTIR perlakuan S2L1

Spektra hasil Spektra dari Gugus fungsi dari

Sumber
analisis (cm-1) literatur (cm-1) literatur
3325 3600-3200 -OH stretching alkohol Kanmani, dkk., (2011)
2920 2932 -C-H stretching Wang, dkk., (2015)
Vibrasi stretching
2870 2870 Yusbarina, (2013)
asimetris C-H
Vibrasi stretching C=C
1638 1647 dari cincin mannosa Kavita, dkk., (2013)
atau galaktosa
1438 1440–1398 -C-O stretching Kang, dkk., (2016)
-COO- stretching
1390 1384 Kavita, dkk., (2013)
simetrik
Vibrasi stretching
1195 1193 Zhang, dkk., (2013)
gugus C-O

1141 1150 Vibrasi C-O eter Yusbarina, (2013)

Vibrasi stretching O-H

1097 1080–1150 Yusbarina, (2013)
alkohol sekunder
Vibrasi O-H (ROH)
754 750–650 deformasi keluar Yusbarina, (2013)
bidang
Vibrasi stretching
658 680–610 Yusbarina, (2013)
simetrik C-H deformasi

4.9 Pemanfaatan Tetes Tebu untuk Memproduksi Eksopolisakarida dalam

Perspektif Islam

Kebutuhan primer manusia yang meliputi sandang, pangan dan papan,

menuntut manusia untuk selalu berusaha memenuhi kebutuhan-kebutuhannya.

 64

Kebutuhan mendasar yang harus selalu terpenuhi setiap hari diantara tiga

kebutuhan dasar (Basic needs) bagi manusia adalah makanan, dengan

mengonsumsi makanan, manusia akan memperoleh energi untuk melakukan

aktivitas seperti bernafas, berjalan, menggerakkan anggota badan maupun

berpikir. Untuk memenuhi kebutuhan pangan tersebut, manusia mengembangkan

sistem teknologi pertanian dan mendirikan industri makanan. Kegiatan ini pastilah

akan menghasilkan limbah yang dapat mencemari lingkungan jika manusia tidak

pandai untuk memanfaatkannya.

Fenomena kerusakan alam yang disebabkan oleh limbah dari sisa industri

tampaknya masih menjadi persoalan yang belum terpecahkan. Limbah yang

notabene merupakan bahan kimia berbahaya dan tidak ramah lingkungan tentunya

harus diolah sedemikian rupa agar tidak menimbulkan pencemaran baik di darat

maupun di laut.

Berkaitan dengan hal tersebut, Allah SWT.telah berfirman dalam al

Qur‟an surat ar Ruum ayat 41:



Artinya: “Telah nampak kerusakan di darat dan di laut disebabkan karena

perbuatan tangan manusia, supaya Allah merasakan kepada mereka
sebahagian dari (akibat) perbuatan mereka, agar mereka kembali (ke
jalan yang benar)” (QS. ar Ruum: 41).
Al Qur‟an sebagai pedoman hidup dan sumber hukum yang utama

diturunkan oleh Allah di dunia agar manusia dapat mempelajari dan mengamalkan

setiap kandungan ayatnya. Ayat tersebut secara jelas menggambarkan kerusakan

di muka bumi yang tak lain karena ulah manusia sendiri. Kekayaan alam yang

melimpah tanpa disertai kebijaksanaan dalam pengeksplorasiannya cenderung

 65

menimbulkan dampak yang buruk bagi lingkungan. Keserakahan manusia dalam

usahanya untuk memenuhi kebutuhan tidak diimbangi dengan upaya untuk

melestarikan alam, sehingga tak heran jika keanekaragaman hayati semakin

berkurang. Oleh karena itu sebagai upaya menjaga keanekaragaman hayati dan

menjaga lingkungan agar kehidupan selalu berjalan dinamis, hendaknya manusia

selalu melakukan perbaikan. Mulai dari pemanfaatan limbah menjadi suatu

produk yang bermanfaat terutama dalam bidang pangan dan farmasi.Salah satu

limbah industri makanan yang banyak dijumpai di seluruh Indonesia adalah

limbah pabrik gula berupa tetes tebu.

Tetes tebu merupakan limbah pabrik gula yang berupa cairan kental

berwarna hitam kecoklatan dan tidak dapat membentuk kristal lagi pada saat

proses kristalisasi. Menurut Baikow (1982) senyawa-senyawa penyusun tetes tebu

antara lain bahan organik, bahan anorganik dan air. Total gula dalam tetes tebu

sekitar 52 %, meliputi sukrosa, dekstrosa, glukosa dan fruktosa. Garam anorganik

atau abu sekitar 10 %, sedangkan 10–20% adalah air, dan selebihnya adalah bahan

organik non gula. Melihat begitu banyak kandungan gula dalam tetes tebu, maka

jenis limbah ini dapat dimanfaatkan sebagai media fermentasi untuk memproduksi

eksopolisakarida.

Eksopolisakarida adalah polisakarida yang dihasilkan oleh sel

mikroorganisme berupa cairan yang disekresikan secara terus menerus keluar sel

dan terlarut dalam media kultur. Senyawa ini termasuk ke dalam metabolit

sekunder. Metabolit sekunder adalah senyawa kimia yang dibutuhkan oleh

mikroorganisme untuk interaksi antar individu dengan ekosistem.Peran utama

EPS adalah untuk melindungi sel dari kondisi lingkungannya terutama dari
 66

kondisi yang merugikan menjadi kering, kekurangan nutrisi, komponen racun,

kondisi stres dan antagonis.Eksopolisakarida merupakan salah satu bukti

kebesaran Allah yang harus selalu kita renungkan, kita pikirkan sehingga dapat

memperkaya khazanah keilmuan dan menambah keimanan kita kepada Allah

SWT.sebagaimana firman Allah SWT. dalam surat adz Dzariyat ayat 20–21:



Artinya: “Dan di bumi itu terdapat tanda-tanda (kekuasaan Allah) bagi orang-
orang yang yakin (20). Dan (juga) pada dirimu sendiri.Maka Apakah
kamu tidak memperhatikan?”(21) (QS. adz Dzariyat: 20–21).

Maha suci Allah yang telah menciptakan makhluk hidup disertai

kekurangan dan kelebihannya. Allah SWT. dengan segala ke Maha kuasaan-Nya

telah menciptakan mikroorganisme dengan ukuran mikron, untuk melihatnya saja

kita harus menggunakan alat bantu berupa mikroskop. Dapat dibayangkan betapa

kecilnya makhluk hidup tersebut.Akan tetapi Allah telah menganugrahkan

kemampuan kepada mikroorganisme agar dapat mempertahankan hidupnya

sendiri. Salah satunya adalah dengan memproduksi metabolit sekunder. Metabolit

sekunder yang dikeluarkan disaat mikroorganisme merasa terancam hidupnya

ternyata sungguh mengandung berbagai manfaat yang dapat kita rasakan secara

langsung diantaranya sebagai antibakteri, antioksidan, meningkatkan viskositas

yoghurt, dan sebagai sumber serat dan karbohidrat.

Hendaknya kita dapat mengambil pelajaran atas segala yang Allah

ciptakan untuk kemaslahatan umat manusia. Allah menciptakan bakteri

Lactobacillus plantarum yang dalam penelitian ini dapat menghasilkan senyawa

 67

eksopolisakarida melalui fermentasi menggunakan media tetes tebu.firman Allah

SWT. dalam surat an Nahl ayat 13:


Artinya: “Dan Dia (menundukkan pula) apa yang Dia ciptakan untuk kamu di
bumi ini dengan berlain-lainan macamnya. Sesungguhnya pada yang
demikian itu benar-benar terdapat tanda (kekuasaan Allah) bagi kaum
yang mengambil pelajaran” (QS. an Nahl:13).

Tafsir ayat tersebut dalam tafsir al Qurthubi (2009) bahwa Allah

mengendalikan apa-apa yang telah Dia ciptakan di muka bumi untuk manusia.

Allah menciptakan berlainan bentuk dan penampilannya baik berupa binatang-

binatang, pepohonan dan lain sebagainya agar manusia dapat mengambil nasihat

dan mengetahui bahwa dalam pengendalian semua alam ciptaan ini terdapat tanda

yang menunjukkan kepada ke Esa-an Allah SWT, dan tidak ada satupun selain

Dia yang mampu melakukan demikian itu.

Kondisi berbeda baik dari faktor suhu maupun lama fermentasi dalam suatu

fermentasi dapat memberikan hasil yang berbeda pula, karena setiap reaksi

memiliki ketetapan masing-masing, seperti halnya kadar eksopoliskarida yang

dihasilkan dalam penelitian ini, dipengaruhi oleh suhu dan lama fermentasi.

sebagaimana firman Allah SWT dalam surat al Qomar ayat 49:


Artinya:”Sesungguhnya kami menciptakan segala sesuatu menurut ukuran (QS.
Qomar : 49)”.

Menurut Shihab (2003) kata qadar dalam segi bahasa berarti kadar tertentu

yang tidak bertambah atau berkurang. Kata qadar juga dapat diartikan sebagai

ketentuan dan sistem yang ditetapkan terhadap segala sesuatu. Ayat tersebut

didukung oleh firman Allah Swt dalam surat al Furqaan ayat 2 :

 68





Artinya:“Dan Dia menciptakan segala sesuatu dan Dia menetapkan ukuran-

ukurannya dengan serapi-rapinya (QS. al-Furqaan : 2)”

Kedua ayat tersebut menjelaskan bahwa Allah menetapkan suatu ukuran dan

memberikan petunjuk terhadap semua makhluk kepada ketetapan tersebut (Katsir,

2007).
 BAB V

PENUTUP

5.1 Kesimpulan

5.1.1 Suhu dan lama fermentasi berpengaruh nyata terhadap kadar EPS dan kadar

gula terpakai selama fermentasi, sedangkan pada kadar total gula EPS, lama

fermentasi tidak berpengaruh nyata. Kadar EPS tertinggi 740 mg/L pada

perlakuan S2L1, sedangkan kadar EPS terendah 274,67 mg/L pada perlakuan

S1L2. Kadar total gula EPS tertinggi 5,97 % pada perlakuan S2L1, sedangkan

kadar total gula EPS terendah 2,99 % pada perlakuan S3L2. Kadar gula

terpakai selama fermentasi tertinggi 14,67 % pada perlakuan S2L1,

sedangkan kadar gula terpakai selama fermentasi terendah 12,29 % pada

perlakuan S3L2.

5.1.2 Hasil analisis FTIR menunjukkan adanya pita serapan vibrasi stretching

gugus hidroksil (O-H), vibrasi stetching dari gugus C=C, vibrasi stretching

dari cincin mannosa atau galaktosa, vibrasi stretching gugus fungsi COO-,

gugus fungsi C-O eter, dan vibrasi stretching dari gugus O-H alkohol

sekunder.

5.2 Saran

Penelitian ini hanya menggunakan dua variasi lama fermentasi sehingga

belum dapat menentukan grafik kinetika produksi eksopolisakarida berdasarkan

beberapa variasi lama fermentasi, selain itu hasil FTIR hanya memberikan

informasi gugus fungsi sehingga belum diketahui senyawa monosakarida

penyusun dalam eksopolisakarida. Penelitian selanjutnya diharapkan dapat

menambah variasi lama fermentasi dan identifikasi komposisi gula penyusun EPS

menggunakan HPLC.

69
 DAFTAR PUSTAKA

Al Qur‟anul karim dan terjemahannya.

Albalasmeh, A. A., Asmeret, A. B., Teamrat, A., Ghezzehei. 2013. A New

Method for Rapid Determination of Carbohydrate and Total Carbon
Concentrations Using UV Spectrophotometry. United State:
Carbohydrate Polymer 97 : 253-261.

Amalia, R. D. 2012. Eksplorasi Isolat Bakteri Asam Laktat Penghasil

Eksopolisakarida Dari Sawi Asin (Brassica juncea). Skripsi. Universitas
Brawijaya : Malang.
Arasu, V. M., Al-Dhabi, N. A., Ilavenil, S., Choi, Ki C., dan Srigopalram, S.
2015. In-Vitro Importance of Probiotic Lactobacillus plantarum Related to
Medical Field. Saudi Journal of Biological Science. 2015. 09. 022.
Asker, M. M. S., EL Sayed, O. H., Mahmoud, M. G., dan Ramadan, M. F. 2014.
Chemical structure and antioxidant activity of a new exopolysaccharide
produced from Micrococcus luteus. Journal of Genetic Engineering and
Biotechnology (2014) 12, 121–126.
Badel, S., Bernardi, T., dan Michaud, P. 2011. New Perspectives for Lactobacilli
Exopolysaccharide. Biotechnology Advances 29 (2011) 54-56.
Brummer, Y., dan Cui, W., S. 2013. Food Carbohydrates: Chemistry, Physical
Properties, and Application. France: Taylor and Francies Group, LLC.
Carocho, M., Ferreira, I. C. 2013. Food and Chemical Toxicology 51
(2013) 15–25.
Cerning, J., Bouilanne, C., dan Landon, M. 1992. Isolation and Characterization
of Exopolysaccharide From Slime-Forming Mesophilic Lactic Acid
Bacteria. Journal Dairy Science 1992;75:692-9.
Cerning, J., Bouillanne, C., Landon, M., dan Desmazeaud, M. 1994. Production
of exopolysaccharides by lactic acid bacteria and dairy propionibacteria.
Station de recherches laitières, INRA,CRJ,Domaine de Vilvert, 78352
Jouy-en-Josas cedex, France. Lait (1995) 75, 463-472
De Vuyst, L., dan Degeest, B. 2001. Heteropolysaccharides from lactic acid
bacteria. FEMS Microbiol. Rev. 23:153–177.
Dilna, S. V., Surya, H., Aswathy, R. G., Varsha, K. K., Sakthikumar, D.N.,
Pandey, A., dan Nampoothiri, K.M. 2015. Characterization of an
Exopolysaccharide with Potential Benefit Properties from a Probiotic
Lactobacillus plantarum RJF4. LWT - Food Science and Technology 64
(2015) 1179-1186.
Djide, M. N. 2005. Uraian Umum tentang Bakteri Asam Laktat. Makalah. Kursus
Singkat Pemanfaatan BAL dalam bidang Pangan dan Kesehatan. Univ.
Hasanuddin, Makassar 14-24 November 2005.

70
 71

Dubois, Michel, dkk. 1956. Colorimetric Method for Determination of Sugar and
Related Substance. University of Minnesota vol 28(3): 350-356.

Fardiaz, S. 1989. Analisa Mikrobiologi Pangan. Jakarta : Raja Grafindo Persada.

Fifendy, M., Eldini dan Irdawati. 2013. Pengaruh Pemanfaatan Molase Terhadap
Jumlah Mikroba Dan Ketebalan Nata Pada Teh Kombucha. Prosiding
Seminar Bidang Biologi ISBN-978-602-98559-2-0.
Gandjar, I. G., dan Rohman, Abdul. 2007. Kimia Farmasi Analisis. Yogyakarta:
Pustaka Pelajar.
Halim, C. N., dan Zubaidah, E. 2013. Studi Kemampuan Probiotik Isolat Bakteri
Asam Laktat Penghasil Eksopolisakarida Tinggi Asal Sawi Asin
(Brassica juncea). Jurnal Pangan dan Agroindustri Vol. 1 No.1 p.129-
137, Oktober 2013.
Harahap, H. 2003. Karya Ilmiah Produksi Alkohol. Medan: USU digital library.

Haroun, B. M., El-Menoufy, H. A., Amin, H. A. dan El-Waseif, A. A. 2013.

Biosynthesis and Morphology of an Exopolysaccharide from a Probiotic
Lactobacillus plantarum Under Different Growth Condition. Journal of
Applied Sciences Research, 9(2): 1256-1265, 2013.
Hartina, F., Jannah, A., Maunatin, A. 2014. Fermentasi Tetes Tebu dari Pabrik
Gula Pagotan Madiun Menggunakan Saccharomyces cerevisiae untuk
Menghasilkan Bioetanol dengan Variasi pH dan Lama Fermentasi.
Alchemy, Vol. 3 No. 1 Maret 2014.
Hidayat, N., Padaga, M. C., dan Suhartini, S. 2006. Mikrobiologi industri.
Yogyakarta: Andi Offset.
Huang, R., Tao, X., Wan, C., Li, S., Xu, H., Xu, F., Shah, N. P. dan Wei, H. 2015.
In Vitro Probiotic Characteristics of Lactobacillus plantarum ZDY 2013
and its Modulatory Effect on Gut Microbiota of Mice. Journal of Dairy
Science Vol. 98 No. 9, 2015.
Jenie, B. S. L. 1996. Peranan bakteri Asam Laktat sebagai Pengawet Hayati
Makanan. Jurnal Ilmu dan Teknologi Pangan I (2) : 60 – 73.
Jiang, M., Zhang, F., Wan, C., Xiong, Y., P. Shah, N., Wei, H. dan Tao, X. 2016.
Evaluation of probiotic properties of Lactobacillus plantarum WLPL04
isolated from human breast milk. Journal of Dairy Science Vol. 99 No. 3
2016.
Jin, M., Wang, Y., Xu, C., Lu, Z., Huang, M., dan Wang, Y. 2010. Preparation
and Biological Activities of an Exopolysaccharide Produced by
Enterobacter cloacae Z0206. Carbohydrate Polymers, 81, 607-611.
 72

Juwita, Ratna. 2012. Studi Produksi Alkohol dari Tetes Tebu (Saccharum
officinarum) selama Proses Fermentasi. Skripsi. Jurusan Teknologi
Pertanian Fakultas Pertanian: Universitas Hasanuddin Makassar.
Kanmani, P., Kumar, R. S., Yuvaraj, N., Paari, K. A., Pattukumar, V., Arul, V.,
Bioresour. 2011. Technology. 102 4827-4833.
Kavita, K., Singh, V. K., Mishra, A., Jha, B. 2014. Carbohydrate Polymers. 101
29-35.
Kimmel, S. A., Roberts, R. F., dan Ziegler, G. R. 1998. Optimation of
Exopolysaccharide production by Lactobacillus delbrueckii subsp.
Bulgaricus RR grown in a semidefined medium. Applied and
Enviromental Microbiology, 64, 659-664.
Kosaric, N. 1992. Biosurfactant in Industry. Pure and Application Chemistry. 64:
1731-1737.
Kultsum, U. 2009. Pengaruh Variasi Nira Tebu (Saccharum Officinarum) dari
Beberapa Varietas Tebu Dengan Penambahan Sumber Nitrogen (N) dari
Tepung Kedelai Hitam (Glycine Soja) sebagai Substrat Terhadap
Efisiensi Fermentasi Etanol. Skripsi Tidak Diterbitkan. Malang: jurusan
Kimia Fakultas Sains dan Teknologi Universitas Islam Negeri Malang.

Kumar, A. S.; Mody, K.; Jha, B., 2007. Bacterial exopolysaccharides a

perception. Journal of Basic Microbiology 47, 103-117.
Kusmiati, F., Rachmawati, S., Siregar, S. Nuswantara, A., Malik. 2007. J. Makara
(Seri Sains) 10 (2006) 24-29.
Kuswurj. R. 2008. Sugar cane Research and Technology.
http://www.risvank.com/tag/pol. diakses tanggal 5 februari 2016.

Lehninger, A. L. 1997. Dasar-dasar Biokimia Jilid I. Jakarta: Erlangga.

Li, S., Huang, R., Shah, N. P., Tao, X., Xiong, Y., dan Wei, H. 2014. Antioxidant
and antibacterial activities of exopolysaccharides from Bifidobacterium
bifidum WBIN03 and Lactobacillus plantarum R315. Journal of Dairy
Science Vol. 97 No. 12, 2014.

Li, Y., Meng, S., Wang, L., Wang, Y., Zu, X., Yang, Y. dan Zhang, Z. 2014.
Antioxidative Activity of Exopolysaccharide Extract from Fermented
Wheat Distillers‟dried Grains Using UV-Irradiation Degradation
Pretreatment by Preussia aemulans. Advance Journal of Food Science and
Technology 6(9): 1067-1075, 2014.
Lin, T.Y. M. F., Chien, C. 2007. Exopolysaccharide Production as Affected by
Lactic Acid Bacteria and Fermentation Time. Food Chemistry 100 (2007)
1419-1423.
 73

Liu, C., Chu, F., Chou, C., dan Yu, R. 2011. Genetical Toxicology. Environment
Mutagenicity. 721 (2011) 157-162.
Llamas, C., Mullany, L., dan Stockwell, P. 2007. The Routledge Companion to
Exopolysaccharide. New York: Rouledge.
Looijesteijn P. J, Trapet L, De vries E, Abee, T., Hugenholtz, J. 2001.
Physiological function of exopolysaccharides produced by Lactococcus
lactis. Int J Food Microbiol 64:71–80.
Malik, Amalia, Donna M. Ariesranti, Anandayu Nurfachtiyanti, dan Arry Yanuar.
2008. Skrining Gen Glukonsiltransferase (GTF) Dari Bakteri Asam Laktat
Penghasil Eksopolisakarida. 2003. Makara Sains, Volume 12, No. 1, April
2008:1-6.
Melanti, Rizka. 2013. Preparasi Porous Carbon dari Molase dan Aplikasinya
dalam Penurunan Efek Browning Sari Buah Apel. Skripsi. Fakultas
Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Universitas Negeri Semarang.
Mozzi, F., Vaningelgem, F., Hebert, E. M., Van der Meulen, R., Foulquie-
Moreno, M. R., Font de Valdez, S. G., dan De Vuyst, L. 2006. Diversity of
Heteropolysaccharide Producing Lactic Acid Bacterium Strains and Their
Biopolymers. Applied and Environmenttal Microbiology, 72, 4431-4435.
Nofemele, Z., Shukla, P., Trussler, A., Permaul, K., dan Singh, S. 2012.
Improvement of Ethanol Production from Sugarcane Molasses Through
Enhanced Nutrient Supplementation Using Saccharomyces cerevisiae.
Journal of Brewing and Distilling Vol. 3(2), pp. 29-35.
Nudyanto, A., Zubaidah, E. 2015. Isolasi Bakteri Asam Laktat Penghasil
Eksopolisakarida dari Kimchi. Jurusan teknologi hasil pertanian, FTP
Universitas Brawijaya Malang.Vol.3 No 2 p.743-748.
Ozkaya, F. D., Aslim, B., Ozkaya, M. T. 2007. Effect of Exopolysaccharides
(EPSs) Produced by Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus Strains to
Bacteriophage and Nisin Sensitivity of the Bacteria. LWT 40 (2007) 564–
568.
Patel, S., Majumder, Avishek., dan Goyal, A. 2012. Potentials of
Exopolysaccharides from Lactic Acid Bacteria. Indian Journal
Microbiology (Jan–Mar 2012) 52(1):3–12.
Paturau, J, M. 1982. By Product of Cane Sugar Industry. Amsterdam: Elsevier
Scientific Publ, Co.

Pelczar, M. J. 2008. Dasar-dasar Mikrobiologi Sistem Fermentasi Cair. Jurnal

Teknologi Kimia dan Industri, Vol 1, No 1, Halm 139-149.

Pertiwi, A. A. P., 2009. Pengaruh Temperatur Dan Waktu Karbonisasi Pada

Sintesis Porous Carbon Berbahan Dasar Molase. Skripsi. Semarang :
Jurusan Kimia, FMIPA, Universitas Diponegoro.
 74

Prescott, S. C. dan Dunn, G. C. 1990. Industrial Microbiology Third Edition. New

York: Mc. Graw Hill Book Company. Inc.
Pusat Data dan Sistem Informasi Pertanian Sekretariat Jenderal Kementrian
Pertanian. 2014. Outlook Komoditi Tebu. ISSN 1907-1507.
Rahmadi, A. B. S. L., Jenie dan Andjaya, N. 2002. Pemanfaatan bakteri asam
laktat untuk meningkatkan keamanan dan umur simpan apel malang olah
minimal. Prosiding Seminar Nasional PATPI. Malang.
Ramos, A., Boels, I. C., De Vos, W. M. Dan Santos, H. 2001. Relationship
between Glycolysis and Exopolysaccharide Biosynthesis in Lactococcus
lactis. Applied and Environmental Microbiology, Vol. 67, No. 1.
Ratningsih, Nining. 2008. Uji toksisitas Molase Terhadap respirasi Ikan Mas.
Journal Biotika, Vol.6, No.1, 22-33.
Rehm, B. H. A. 2009. Microbial Production of Biopolymers and Polymer
Precusors: Applications and Perspectives. Caister Academic Press.
Ruas Madiedo, P., and de los Reyes-Gavilán, C. G. 2005. Invited Review:
Methods for the Screening, Isolation, and Characterization of
Exopolysaccharides Produced by Lactic Acid Bacteria. 88:843-856.
Ruas Madiedo, P., Salazar, N., dan De los Reyes-Gavilian, C. G. 2009.
Biosynthesis and Chemical Composition of Exopolysaccharides Produced
by Lactic Acid Bacteria. In Bacterial Polysaccharide. In M. Ullrich (Ed.),
Current Innovations and Future Trends (pp. 279-310).

Salazar, N., Prieto, A., Leal, J. A., Mayo, B., Bada-Gancedo, J. C., de los Reyes-
Gavilian, C. G., dkk. 2009. Production of Exopolysaccharides by
Lactobacillus and Bifidobacterium Strains of Human Origin, and
Metabolic Activity of the Producing Bacteria in Milk. Journal of Dairy
Science, 92, 4158-4168.
Simanjuntak, R., 2009. Studi Pembuatan Etanol Dari Limbah Gula (Molase).
Skripsi, Departemen Teknologi Pertanian, Fakultas Pertanian: Universitas
Sumatera Utara.
Sirajunnisa, A., Vijayagopal, V., dan Viruthagiri, T. 2012. Effect of Synthetic
Carbon Substrates and Cane Molasses, an Agro Waste, on
Exopolysaccharide Production by P. fluorescens. International Journal of
Science and Engineering Applications (IJSEA) Volume 1 Issue 1.
Sunjaya, I. N., Aryantini, N. P. D., Nursini, N. W., Cakrawati, C. I. D., Juliasari,
N. L. M. E., Dwipayantil, N. M. U., Ramona, Yan. 2012. Eksopolisakarida
dari Lactobacillus sp. Isolat Susu Kuda Sumbawa dan Potensinya sebagai
Prebiotik. Jurnal Veteriner Juni 2012 Vol. 13 No. 2: 136-144.
Sutherland, I. W. 1999. Polysaccharides for Microbial Exopolysaccharides.
Carbohydrate Polymer, 38, 319-328.
 75

Sutherland, I. W. 1998. Bacterial Exopolysaccharid. http://www.blackwell-

synergy . Diakses tanggal 3 Maret 2016.
Sutherland, I.W., 2001. Microbial polysaccharides from Gram-negative bacteria.
International Dairy Journal 11, 663-674.
Tallon, R., P. Bressollier and M.C. Urdaci. 2006. Isolation and Characterization of
Two Exopolysaccharides Produced by Lactobacillus plantarum EP56.
Toharisman, A., dan santosa, H. 1999. Mutu Bahan Baku dan Preparasi Medium
Fermentasi Pelatihan Teknologi Alkohol. Pasuruan: Pusat Penelitian
Perkebunan Indonesia 95-96.
Trabelsi, I., Ben Slima, S., Chaabane, H., Salah Riadh, B. 2015. Purification and
Characterization of a Novel Exopolysaccharides Produced by
Lactobacillus sp. Ca6. International Journal of Biological
Macromolecules 74 (2015) 541–546.
Trenggono dan Sutardi. 1990. Biokimia dan Teknologi Pasca Panen. Yogyakarta:
UGM Press.

Vanhooren, P.; Vandamme, E.J., 1998. Biosynthesis, physiological role, use and
fermentation process characteristics of bacterial exopolysaccharides.
Recent Res. Devel. Fermen. Bioeng. 1, 253–299.

Volk, W. A. dan Wheeler, M. F. 1988. Mikrobiologi Dasar Edisi kelima. Jakarta:

Erlangga.
Wang, J., Zhao, X., Yang, Y., Zhao, A., Yang, Z. 2015. Characterization and
Bioactivities of an Exopolysaccharide Produced by Lactobacillus
plantarum YW32. International Journal of Biological Macromolecul 74
(2015) 119-126.
Wang, K., Li,W., Rui, X., Xiaohong, Jiang, M., Dong, M. 2014. Characterization
of a Novel Exopolysaccharide with Antitumor Activity from Lactobacillus
plantarum 70810. International Journal of Biological Macromolecules 63
(2014) 133– 139.
Wang, Y., Li, C., Liu, P., Ahmed, Z., Xiao, P., Bai, X. 2010. Physical
Characterization of Exopolysaccharide Produced by Lactobacillus
plantarum KF5 Isolated from Tibet Kefir. Carbohydrate Polymers 82
(2010) 895–903.
Xu, R. H., Shen, Q., Ding X. L., Gao, W. G., dan LI, P. L. 2010. Chemical
Characterization and Antioxidant Activity of an Exopolysaccharide
Fraction Isolated from Bifidobacterium animalis RH. European Food
Research and Technology, 232, 231-241.
Ye, S., Zhang, M., Yang, H., Wang, H., Xiao, S., Liu, Y., dan Wang, J. 2014.
Biosorption of Cu2+, Pb2+ dan Cr6+ by a Novel Exopolysaccharide from
Arthrobacter PS-5. Carbohydrate Polymers, 101, 50-56.
 76

Yilmaz , M. T., Dertli, E., Toker, O. S., Tatlisu, N. B., Sagdic, O., dan Arici, M.
2015. Effect of in situ exopolysaccharide production on physicochemical,
rheological, sensory, and microstructural properties of the yogurt drink
ayran: An optimization study based on fermentation kinetics. Journal of
Dairy Science Vol. 98 No. 3, 2015.
Yuliana, Neti. 2008. Kinetika Pertumbuhan Bakteri Asam Laktat Isolat T5 yang
Berasal dari Tempoyak. Jurnal Teknologi Industri dan Hasil Pertanian,
Volume 13, No. 2, September 2008.
Zhang, L., Liub, C., Lia, D., Zhaoa, Y., Zhanga, X., Zenga, X., Yanga, Z., Lia, S.
2013. Antioxidant activity of an exopolysaccharide isolated from
Lactobacillus plantarum C88. International Journal of Biological
Macromolecules 54 (2013) 270– 275.

Zhou, S.K., K.T. Shanmugan, L.P. Yomano, T.B. Grabar and L.O. Ingram. 2006.
Fermentation of 12% glucose to 1,2M Lactate by Escherichia coli Strain
SZ194 Using Minerals Salts Medium. Biotechnol. Left., 28:663-670.

Zhou, K., Zeng, Y, Yang, M., Chen, S., He, LI., Ao X., Zou, L., dan Liu, S. 2016.
Production, Purification and Structural Study of an Exopolysaccharide
from Lactobacillus plantarum BC-25. Carbohydrate Polymers (16)
30132-1.

Zisu, B., dan Shah, N. P. 2003. Effects of pH, Temperature, Supplementation with
Whey Protein Concentrate, and Adjunct Cultures on the Production of
Exopolysaccharides by Streptococcus thermophilus 1275. Journal of
Dairy Science Vol. 86, No. 11, 2003.
Zubaidah, E., Liasari, Y., Saparianti, E. 2008. Produksi Eksopolisakarida oleh
Lactobacillus plantarum B2 pada Produk Probiotik Berbasis Buah Murbei.
Jurnal Teknologi Pertanian Vol. 9 No.1 (April 2008) 59 – 68.
 LAMPIRAN

Lampiran 1. Diagram Alir

Sampel tetes tebu dari Pabrik Gula Krebet Malang

Pengukuran brix dengan hand brix refractometer

Diencerkan hingga konsentrasi 18% (v/v)

Pengukuran kadar total gula menggunakan metode fenol
H2SO4

Uji pengaruh suhu dan lama fermentasi terhadap produksi

eksopolisakarida

Menggunakan variasi suhu (25, 30 dan

35 oC) dan lama fermentasi (18, dan 24
jam)
Isolasi eksopolisakarida

Identifikasi menggunakan FTIR

Analisis data

77
 78

Lampiran 2. Skema Kerja

 Sterilisasi Alat
Alat gelas
- dicuci
- dikeringkan dengan oven
- dibungkus dengan aluminium foil
- disterilisasi dalam autoklaf pada suhu 121oC dengan tekanan 15
psi selama 15 menit.
Hasil

 Pengukuran Brix (Kultsum, 2009)

Tetes tebu
- diambil sebanyak 3 mL
- dimasukkan ke dalam alat hand brix refractometer
- diamati garis antara gelap dengan terang tepat pada titik potong
sumbunya.
Hasil

 Preparasi Tetes Tebu (Wahyudi, 1997)

Tetes tebu
-diencerkan dengan akuades hingga konsentrasi 18% (v/v)
-ditambahkan urea sebanyak 0,3%
-disterilisasi dengan autoklaf pada suhu 121oC
dengan tekanan 15 psi selama 15 menit.

Hasil
 79

 Pembuatan Media MRSA

MRS Agar
-ditimbang sebanyak 6,2 gram
-dilarutkan ke dalam 100 mL akuades
-dihomogenkan dengan hot plate dan magnetic stirrer sampai
homogen
-dituangkan sebanyak masing-masing 5 mL ke dalam tabung reaksi
-ditutup dengan cotton plug (sumbat kapas) dan plastik wrap
-disterilisasi dengan autoklaf 121oC tekanan 2 atm selama 15 menit
-disimpan pada cetakan miring selama 1 malam sampai memadat

Hasil
 Pembuatan Media MRSB
MRS Broth
-ditimbang sebanyak 5,515 gram
-dilarutkan ke dalam 100 mL akuades
-dihomogenkan dengan hot plate dan magnetic stirrer sampai
homogen
-dituangkan masing-masing sebanyak 15 mL ke dalam Erlenmeyer
100 mL
-ditutup dengan cotton plug (sumbat kapas) dan plastik wrap
-disterilisasi dengan autoklaf 121oC tekanan 2 atm selama 15 menit

Hasil

 Peremajaan Lactobacillus plantarum (Nudyanto dan Zubaidah, 2015)

Isolat Lactobacillus
plantarum

- ditumbuhkan pada 5 mL media MRSA padat pada posisi miring

-diinkubasi pada suhu ruang
- diremajakan setiap dua minggu sekali

Hasil
 80

 Pembuatan Stok Inokulum (Kultsum Termodifikasi, 2009)

Kultur Lactobacillus
plantarum
-diambil sebanyak 2 ose
-dimasukkan dalam 100 mL MRSB
-ditutup dengan cotton plug (sumbat kapas) dan plastik wrap
-dishaker dengan kecepatan 100 rpm pada suhu 30oC selama 24
jam

Hasil

 Pembuatan Kurva Standar Glukosa dengan Metode Fenol H2SO4

(Dubois dkk., 1956)
Glukosa
-dibuat sebanyak 2 mL larutan glukosa standar yang mengandung
10, 20, 30, 40, 50, dan 60 ppm
-dimasukkan ke dalam tabung reaksi
-ditambahakan 1 mL larutan fenol 5%
-dikocok
-ditambahkan 5 mL asam sulfat pekat dengan cepat
-dibiarkan selama 10 menit
-dikocok
-ditempatkan dalam penangas air selama 15 menit
-dimasukkan ke kuvet
-diukur absorbansinya pada panjang gelombang 485 nm
-ditentukan persamaan regresi linier
Hasil
 81

 Perhitungan Kadar Total Gula Sampel Tetes Tebu Sebelum dan

Sesudah Fermentasi dengan Metode Fenol H2SO4 (Dubois dkk., 1956)

Molase
-dipipet sebanyak 2 mL
-dimasukkan ke dalam tabung reaksi
-ditambahkan 1 mL larutan fenol 5%
-dikocok
-ditambahkan 5 mL asam sulfat pekat dengan cepat
- dibiarkan selama 10 menit
-dikocok
-ditempatkan dalam penangas air selama 15 menit
-dimasukkan ke kuvet
-diukur absorbansinya pada panjang gelombang 485 nm
Hasil

 Uji Pengaruh Suhu dan Lama Fermentasi Terhadap Produksi

Eksopolisakarida dari Tetes Tebu (Trabelsi, dkk. Termodifikasi,
2014)
Molase steril
-ditambahkan inokulum L. plantarum sebanyak 10 mL
-ditutup dengan cotton plug (sumbat kapas) dan plastik wrap
-dishaker dengan kecepatan 100 rpm selama waktu inkubasi (18
dan 24 jam) dan variasi suhu (25, 30 dan 35oC)

Hasil
 82

 Isolasi Eksopolisakarida (Nudyanto dan Zubaidah, 2015)

Eksopolisakarida

-diambil sebanyak 25 mL
-dimasukkan ke dalam tabung sentrifuge
-disentrifugasi pada 5000 rpm selama 20 menit

Pellet Supernatan

-ditambahakan etanol dingin 96% (dua kali volume)

selama semalam
-disentrifugasi pada 5000 rpm selama 25 menit

Supernatan Pellet

-dikeringkan pada suhu 105oC selama 5

menit
-ditimbang berat eksopolisakarida kering
-dihitung randemen eksopolisakarida kasar
Hasil

 Pembakuan NaOH 0,5 N

Larutan NaOH 0,5 N

-dipipet sebanyak 5 mL
-ditambahkan indikator PP 1-3 tetes
-dititrasi dengan larutan H2C2O4 0,5 N

Hasil
 83

 Perhitungan Kadar Total Gula Eksopolisakarida dengan Metode

Fenol H2SO4 (Dubois dkk., 1956)
EPS
-ditimbang sebanyak 10 mg
-dilarutkan ke dalam 10 mL larutan NaOH 0,5 N
-dipipet sebanyak 1 mL
-diencerkan hingga volume 100 mL
-dipipet sebanyak 2 mL
-ditambahkan 1 mL larutan fenol 5 %
-dikocok
-ditambahkan 5 mL asam sulfat pekat dengan cepat
-dikocok
- ditempatkan dalam penangas air selama 15 menit
-dimasukkan ke kuvet
-dianalisis menggunakan UV-Vis dengan panjang gelombang 485
nm

Hasil

 Identifikasi Gugus Fungsi Eksopolisakarida Menggunakan FTIR

Eksopolisakarida

-ditimbang sebanyak 1 mg
-digerus dengan bubuk KBr dan kemudian
-di tekan vakumkan hingga menjadi pellet
-dianalisis menggunakan FTIR pada rentang frekuensi 4000
cm-1 sampai 400 cm-1.

Hasil
 84

Lampiran 3. Perhitungan

1. Pembuatan Tetes Tebu 18% (b/v)

Tetes tebu 18% (b/v) =

Sebanyak 18 gram tetes tebu ditimbang menggunakan neraca analitik,

kemudian ditambahkan akuades sebanyak 100 mL, diaduk hingga homogen dan

dipindahkan ke dalam erlenmeyer 250 mL.

2. Pembuatan Larutan Fenol 5% (b/v)

Fenol 5% (b/v) =

Sebanyak 5 gram fenol ditimbang menggunakan neraca analitik, kemudian

dimasukkan ke dalam gelas beker 100 mL, ditambahkan akuades dan diaduk

hingga larut. Selanjutnya dimasukkan ke dalam labu ukur 100 mL, ditambahkan

akuades sampai tanda batas dan dihomogenkan.

3. Pembuatan Larutan NaOH 0,5 N

Menghitung Normalitas NaOH

Normalitas = Mxv

Molaritas =

N = xV
Keterangan: M = Molaritas
V = valensi
M = massa (gram)
Mr = Massa molekul relatif (g/mol)
V = Volume pelarut (Liter)
 85

Normalitas NaOH = x valensi NaOH

0,5 N = x1

0,5 N x 40 g/mol = 4.m

m = = 5 gram

NaOH dengan konsentrasi 0,5 N dibuat dengan cara ditimbang padatan NaOH

sebanyak 5 gram kemudian dilarutkan dengan akuades sampai larut sempurna,

selanjutnya dimasukkan ke dalam labu ukur 250 mL, ditambahkan akuades

sampai tanda batas dan dihomogenkan.

4. Pembuatan Larutan H2C2O4 0,5 N

Menghitung Normalitas H2C2O4

Normalitas = Mxv

Molaritas =

= xV
Keterangan: M= Molaritas
v= valensi
m= massa (gram)
Mr= Massa molekul relatif (g/mol)
V= Volume pelarut (Liter)

Normalitas H2C2O4 = x valensi H2C2O4

0,5 N =

0,5 N x 90 g/mol =8xm

m = = 5,625 gram
 86

H2C2O4 dengan konsentrasi 0,5 N dibuat dengan cara ditimbang padatan

H2C2O4 sebanyak 5,625 gram kemudian dilarutkan dengan akuades sampai larut

sempurna, selanjutnya dimasukkan ke dalam labu ukur 250 mL, ditambahkan

akuades sampai tanda batas dan dihomogenkan.

5. Pembuatan Larutan NaCl 0,85%

Larutan NaCl 0,85% dibuat dengan cara ditimbang padatan NaCl

sebanyak 0,85 gram dan dilarutkan dilarutkan dengan akuades sampai larut

sempurna, selanjutnya dimasukkan ke dalam labu ukur 100 mL, ditambahkan

akuades sampai tanda batas dan dihomogenkan.

6. Pembuatan Konsentrasi Glukosa Standar 10, 20, 30, 40, 50, dan 60 ppm

Stok glukosa baku = = 1000 ppm

Pembuatan larutan glukosa 10, 20, 30, 40, 50, dan 60 ppm dapat dilakukan

dengan pengenceran larutan stok glukosa baku melalui perhitungan sebagai

berikut:

a. Konsentrasi 10 ppm:
M1 x V1 = M2 x V2
1000 ppm x V1= 10 ppm x 100 mL
V1= 1 mL
b. Konsentrasi 20 ppm:
M1 x V1 = M2 x V2
1000 ppm x V1 = 20 ppm x 100 mL
V1 = 2 mL
c. Konsentrasi 30 ppm:
M1 x V1 = M2 x V2
1000 ppm x V1 = 30 ppm x 100 mL
V1 = 3 Ml
 87

d. Konsentrasi 40 ppm:
M1 x V1 = M2 x V2
1000 ppm x V1 = 40 ppm x 100 mL
V1 = 4 mL
e. Konsentrasi 50 ppm:
M1 x V1 = M2 x V2
1000 ppm x V1 = 50 ppm x 100 mL
V1 = 5 mL
f. Konsentrasi 60 ppm:
M1 x V1 = M2 x V2
1000 ppm x V1 = 60 ppm x 100 mL
V1 = 6 mL
Pembuatan larutan glukosa adalah dengan dipipet larutan glukosa baku

sesuai volume yang telah ditentukan, kemudian masing-masing dimasukkan ke

dalam labu ukur 100 mL, ditambahkan akuades hingga tanda batas dan

dihomogenkan.

7. Kurva Standar Glukosa

Tabel 7. Data Absorbansi Glukosa Standar

Konsentrasi Absorbansi
10 ppm 0,1349
20 ppm 0,2950
30 ppm 0,3606
40 ppm 0,5673
50 ppm 0,6741
60 ppm 0,8104
 88

0.8 y = 0.0135x
R² = 0.9896

Absorbansi
0.6
Absorbansi
0.4

0.2

0
0 20 40 60 80
Konsentrasi

Gambar 7. Grafik Kurva Standar Glukosa

8. Analisis Kadar Total Gula Metode Fenol-H2SO4

8.1 Analisis Kadar Total Gula Bahan Baku

Analisis kadar total gula bahan baku dengan metode Fenol-H2SO4 yang

diukur absorbansinya menggunakan spektrofotometer UV-Vis Cary 20 pada

panjang gelombang 485 nm. Data absorbansi bahan baku dapat dilihat pada tabel

berikut:

Tabel 8.1.1. Absorbansi Bahan Baku

Nama Absorbansi
Ulangan I Ulangan II Ulangan III

Bahan baku 0,6370 0,6316 0,6354

Data absorbansi bahan baku tersebut diplotkan ke dalam persamaan regresi

linear dari kurva standar glukosa yaitu y = 0,0135x + 0,0016 dengan y adalah

absorbansi bahan baku dan x merupakan variabel yang dicari yaitu konsentrasi

gula yang terkandung dalam bahan baku sebelum fermentasi memakai faktor

pengenceran (fp) sebesar 10000 misalnya pada ulangan I :

y = 0,0135x + 0,0016
0,6370 = 0,0135x + 0,0016
 89

0,6370– 0,0016 = 0,0135x

x = (0,6370 – 0,0016)/ 0,0135 = 47,07 ppm (konsentrasi berdasarkan kurva)
konsentrasi analisa = 1 gram/100 mL
= 1000 mg/0,1 L
= 10000 ppm

Kadar gula (%) =

Kadar gula (%) =

kadar gula (%) = 47,07%

Kadar total gula bahan baku dapat dilihat pada Tabel 8.1.2.

Tabel 8.1.2. Kadar Total Gula Bahan Baku

Nama Kadar Total Gula (%) Rata – rata (%)

Ulangan I Ulangan II Ulangan III
Bahan baku 47,07 46,67 46,95 46,90

8.2 Analisis Kadar Total Gula Sampel Sebelum Fermentasi

Analisis kadar total gula sebelum fermentasi dilakukan setelah tetes tebu

dibuat dengan konsentrasi 18 % (b/v). Data absorbansi sampel sebelum fermentasi

dapat dilihat pada Tabel 8.2.1.

Tabel 8.2.1. Absorbansi Sampel Sebelum Fermentasi

Nama Absorbansi

Suhu 25oC Suhu 30oC Suhu 35oC

Tetes tebu 18% 0,2127 0,2045 0,2139

Data absorbansi sampel sebelum fermentasi tersebut diplotkan ke dalam

persamaan regresi linear dari kurva standar glukosa yaitu y = 0,0135x + 0,0016

dengan y adalah absorbansi bahan baku dan x merupakan variabel yang dicari

yaitu konsentrasi gula yang terkandung dalam bahan baku sebelum fermentasi.
 90

Analisis sampel molase 18% menggunakan Faktor Pengenceran (FP) sebesar

10000 misalnya perhitungan dari ulangan I:

y = 0,0135x + 0,0016
0,2127 = 0,0135x + 0,0016
0,2127– 0,0016 = 0,0135x
x = (0,2127 – 0,0016)/ 0,0135 = 15,637 ppm (konsentrasi berdasarkan kurva)
konsentrasi analisa = 0,01gram/100 mL
= 10 mg/0,1 L
= 100 ppm

Kadar gula (%) =

Kadar gula (%) =

kadar gula (%) = 15,64 %

Kadar total gula sampel sebelum fermentasi dapat dilihat pada Tabel 8.2.2

Tabel 8.2.2. Kadar Total Gula Sampel Sebelum Fermentasi

Nama Kadar Total Gula (%) Rata – rata

Suhu 25 C o
Suhu 30 C o
Suhu 35 C o (%)

Tetes tebu 18% 15,64 15,03 15,73 15,47

8.3 Analisis Kadar Total Gula Sisa Fermentasi

Analisis kadar total gula sisa fermentasi dilakukan setelah fermentasi. Data

absorbansi total gula sisa fermentasi dapat dilihat pada Tabel 8.3.1

Tabel 8.3.1. Absorbansi Sampel Setelah Fermentasi

Perlakuan Absorbansi
Ulangan I Ulangan II Ulangan III
S1L1 0,1395 0,1536 0,1623
S1L2 0,2112 0,1402 0,1356
S2L1 0,1297 0,1053 0,1075
S2L2 0,3891 0,3735 0,3597
S3L1 0,4649 0,4662 0,3079
S3L2 0,4528 0,4451 0,3955
 91

Data absorbansi sampel setelah fermentasi tersebut diplotkan ke dalam

persamaan regresi linear dari kurva standar glukosa yaitu y = 0,0135x + 0,0016

dengan y adalah absorbansi bahan baku dan x merupakan variabel yang dicari

yaitu konsentrasi gula yang terkandung dalam bahan baku sebelum fermentasi

menggunakan Faktor Pengenceran (FP) 1000. Misalnya pada perlakuan S1L1

ulangan I :

y = 0,0135x + 0,0016
0,1395 = 0,0135x + 0,0016
0,1395– 0,0016 = 0,0135x
x = (0,1395 – 0,0016)/ 0,0135 = 10,2148 ppm
kadar gula (%) = 10,2148 x 1000 = 10214,8 ppm = 1,02148 %
Kadar total gula sampel sisa fermentasi dapat dilihat pada Tabel 8.3.2.

Tabel 8.3.2. Kadar Total Gula Sisa Fermentasi

Perlakuan Kadar Total Gula (%) Rata – rata

Ulangan I Ulangan II Ulangan III (%)

S1L1 1,02 1,13 1,19 1,11

S1L2 1,55 1,03 0,99 1,19
S2L1 0,95 0,77 0,78 0,83
S2L2 2,87 2,75 2,65 2,76
S3L1 3,43 3,44 2,27 3,05
S3L2 3,34 3,29 2,92 3,18

8.4 Analisis Kadar Gula Terpakai pada Proses Fermentasi

Kadar gula terpakai pada proses fermentasi dapat diketahui melalui

pengurangan antara kadar gula sebelum fermentasi dengan kadar gula sisa

fermentasi. Perolehan kadar gula terpakai pada proses fermentasi ditunjukkan

pada tabel berikut ini:

 92

Tabel 8.4.1. Kadar gula terpakai pada fermentasi ulangan I

Perlakuan Kadar gula sebelum Kadar gula sisa Kadar gula terpakai
fermentasi (%) fermentasi (%) (%)
S1L1 15,47 1,02 14,45

S1L2 15,47 1,55 13,92

S2L1 15,47 0,95 14,52

S2L2 15,47 2,87 12,6

S3L1 15,47 3,43 12,04

S3L2 15,47 3,34 12,13

Tabel 8.4.2. Kadar gula terpakai fermentasi ulangan II

Perlakuan Kadar gula sebelum Kadar gula sisa Kadar gula terpakai
fermentasi (%) fermentasi (%) (%)
S1L1 15,47 1,13 14,34

S1L2 15,47 1,03 14,44

S2L1 15,47 0,77 14,7

S2L2 15,47 2,75 12,72

S3L1 15,47 3,44 12,03

S3L2 15,47 3,29 12,18

 93

Tabel 8.4.3. Kadar gula terpakai pada fermentasi ulangan III

Perlakuan Kadar gula sebelum Kadar gula sisa Kadar gula terpakai
fermentasi (%) fermentasi (%) (%)
S1L1 15,47 1,19 14,28

S1L2 15,47 0,99 14,48

S2L1 15,47 0,78 14,69

S2L2 15,47 2,65 12,82

S3L1 15,47 2,27 13,2

S3L2 15,47 2,92 12,55

Tabel 8.4.4. Rata-rata kadar gula terpakai

Perlakuan Kadar gula terpakai (%) Rata – rata

(%)
Ulangan I Ulangan II Ulangan III
S1L1 14,45 14,34 14,28 14,36
S1L2 13,92 14,44 14,48 14,28
S2L1 14,52 14,7 14,69 14,67
S2L2 12,6 12,72 12,82 12,71
S3L1 12,04 12,03 13,2 12,42
S3L2 12,13 12,18 12,55 12,29

8.5 Analisis Kadar Total Gula Eksopolisakarida

Analisis kadar total gula EPS menggunakan metode yang sama, akan

tetapi sebelum dilakukan perlakuan sebagaiman metode fenol H2SO4, sebanyak 10

mg EPS dilarutkan ke dalam 10 mL NaOH, kemudian diambil sebanyak 1 mL,

dimasukkan ke dalam labu ukur 100 mL, ditambahkan larutan NaOH 0,5 N

hingga tanda batas dan dihomogenkan. Data absorbansi total gula

eksopolisakarida dapat dilihat pada Tabel 8.5.1.

 94

Tabel 8.5.1. Absorbansi Eksopolisakarida

Perlakuan Absorbansi
Ulangan I Ulangan II Ulangan III
S1L1 0,5945 0,5431 0,5830
S1L2 0,4733 0,5392 0,5990
S2L1 0,8063 0,8002 0,8084
S2L2 0,8021 0,8026 0,8086
S3L1 0,4179 0,4188 0,4251
S3L2 0,4029 0,4115 0,4013

Data absorbansi sampel setelah fermentasi tersebut diplotkan ke dalam

persamaan regresi linear dari kurva standar glukosa yaitu y = 0,0135x + 0,0016

dengan y adalah absorbansi bahan baku dan x merupakan variabel yang dicari

yaitu konsentrasi gula yang terkandung dalam bahan baku sebelum fermentasi

misalnya pada perlakuan S1L1 ulangan I :

y = 0,0135x + 0,0016
0,5945 = 0,0135x + 0,0016
0,5945– 0,0016 = 0,0135x
x = (0,5945 – 0,0016)/ 0,0135 = 43,9185 ppm (konsentrasi berdasarkan kurva)
konsentrasi analisa = 0,01 gram/10 mL
= 10 mg/0,01 L
= 1000 ppm

Kadar gula (%) =

Kadar gula (%) =

kadar gula (%) = 4,39 %

Kadar total gula sampel sisa fermentasi dapat dilihat pada Tabel 8.5.2
 95

Tabel 8.5.2. Rata-rata kadar total gula eksopolisakarida

Perlakuan Kadar Total Gula (%) Rata – rata

Ulangan I Ulangan II Ulangan III (%)

S1L1 4,39 4,01 4,31 4,24

S1L2 3,49 3,98 4,43 3,97
S2L1 5,96 5,98 5,98 5,97
S2L2 5,93 5,93 5,92 5,93
S3L1 3,08 2,98 3,14 3,07
S3L2 2,97 3,04 2,96 2,99

9. Analisis Kadar Eksopolisakarida Hasil Fermentasi

Hasil produksi eksopolisakarida dari fermentasi menggunakan media tetes tebu

ditunjukkan pada Tabel 9.1.

Tabel 9.1. Data hasil produksi rata-rata eksopolisakarida

Perlakuan Berat EPS kering (mg) Rata – rata

(mg)
Ulangan I Ulangan II Ulangan III
S1L1 16,1 13,5 15,5 15,03
S1L2 7 7,1 6,5 6,87
S2L1 19,4 18,5 17,6 18,5
S2L2 17,2 16,5 15,8 16,5
S3L1 14,7 10,5 11,5 12,23
S3L2 11,8 11,1 8,8 10,57

Data pada Tabel 9.1 digunakan untuk menentukan kadar eksopolisakarida

berdasarkan rumus:

Kadar eksopolisakarida (mg/L) =

Misalnya pada perlakuan S1L1 ulangan I:

Kadar eksopolisakarida (mg/L) = = 644 mg/L

Kadar eksopolisakarida ditunjukkan pada Tabel 9.2

 96

Tabel 9.2. Kadar rata-rata eksopolisakarida

Perlakuan Kadar Eksopolisakarida (mg/L) Rata – rata

(mg/L)
Ulangan I Ulangan II Ulangan III

S1L1 644 540 620 601,33

S1L2 280 284 260 274,67

S2L1 776 740 704 740

S2L2 688 660 632 660

S3L1 588 420 460 489,33

S3L2 472 444 352 422,67

10. Perhitungan Jumlah Bakteri Menggunakan Metode TPC

10.1 Ulangan I
Pengenceran Jumlah Koloni

10-3 Sprider

10-4 Sprider

10-5 Sprider

10-6 Sprider

10-7 217

10-8 81

10-9 34

10-10 7

Perhitungan jumlah bakteri = jumlah koloni x

= 217 x
= 217 x 107
=2,17 x 109 cfu
 97

10.2 Ulangan II
Pengenceran Jumlah Koloni

10-3 Sprider

10-4 Sprider

10-5 Sprider

10-6 Sprider

10-7 276

10-8 111

10-9 61

10-10 9

Perhitungan jumlah bakteri = jumlah koloni x

= 276 x
= 276 x 107
= 2,76 x 109 cfu
10.3 Ulangan III
Pengenceran Jumlah Koloni

10-3 Sprider
10-4 Sprider
10-5 Sprider
10-6 >300
10-7 205
10-8 102
10-9 25
10-10 4

Perhitungan jumlah bakteri = jumlah koloni x

= 205 x
= 205 x 107
= 2,05 x 109 cfu
 98

Lampiran 4
DOKUMENTASI

Pembuatan Media dan Pembuatan inokulum

Media padat (MRSA) untuk peremajaan Media cair (MRSB) untuk pembuatan
bakteri kultur bakteri

Pembuatan MRSB Pembuatan inokulum bakteri selama 18

jam aerasi, media tampak keruh

Analisis kadar total gula

Analisis kadar total gula setelah Analisis kadar total gula setelah
fermentasi suhu 25oC fermentasi suhu 30oC
 99

Analisis kadar total gula setelah Analisis kadar total gula EPS
fermentasi suhu 35oC

Fermentasi

Preparasi molase Perhitungan Total Plate Count (TPC)

Persiapan sterilisasi menggunakan Fermentasi pada suhu 30oC selama 18 jam

autoklaf dan 24 jam menggunakan shaker
 100

Lampiran 5. Data Panjang Gelombang Maksimum

Lamdha Maks
Tanggal Analisa : 14 Juni 2016

Scan Analysis Report

Report Time : Tue 14 Jun 11:54:14 AM 2016

Method:

Batch: D:\Aida Fitria\Lamdha Maks (14-06-2016).DSW

Software version: 3.00(339)

Operator: Rika

Sample Name: Glukosa 10 ppm

Collection Time 6/14/2016 11:45:01 AM

Peak Table

Peak Style Peaks

Peak Threshold 0.0100

Range 800.0nm to 200.0nm

Wavelength (nm) Abs

485.0 0.427
 101

Lampiran 6. Kurva Standar Glukosa

Kurva Standar Glukosa

Tanggal Analisa : 23 Juni 2016

Concentration Analysis Report

Report time 6/23/2016 09:54:55 AM

Method

Batch name D:\Aida Fitria\Kurva Standar Glukosa

(23-06-2016).BCN

Application Concentration 3.00(339)

Operator Rika

Instrument Settings
Instrument Cary 50

Instrument version no. 3.00

Wavelength (nm) 485.0

Ordinate Mode Abs

Ave Time (sec) 0.1000

Replicates 3

Standard/Sample averaging OFF

Weight and volume corrections OFF

Fit type Linear

Min R² 0.95000

Concentration units mg/L

Comments:

Zero Report
Read Abs nm
 102

________________________________________________

Zero (0.5345) 485.0

Calibration
Collection time 6/23/2016 10:55:34 AM

Standard Concentration F Mean SD %RSD Readings

mg/L

______________________________________________________________________

Std 1 0.1254

0.1257

10.0 0.1349 0.0001 0.12 0.1255

Std 2 0.2639

0.2636

20.0 0.2950 0.0001 0.04 0.2637

Std 3 0.4524

0.4510

30.0 0.3606 0.0012 0.27 0.4500

Std 4 0.5894

0.5884

40.0 0.5673 0.0009 0.15 0.5877

Std 5 0.6593

0.6587

50.0 0.6741 0.0003 0.04 0.6589

Std 6 0.7845

0.7844

60.0 0.8104 0.0004 0.05 0.7838

Calibration eqn Abs = 0.0135*Conc +0.0016

Correlation Coefficient 0.98341

Calibration time 6/23/2016 10:57:56 AM

Results Flags Legend

U = Uncalibrated O = Overrange

N = Not used in calibration R = Repeat reading

 103

Lampiran 7. Hasil Uji Statistik

7.1 Analisis Pengaruh Suhu dan Lama Fermentasi Terhadap Kadar Gula
Terpakai

Univariate Analysis of Variance

Warnings
Post hoc tests are not performed for Lama_Fermentasi because there are fewer than three groups.

Between-Subjects Factors

N
Lama_Fermentasi 1 9
2 9
Suhu 1 6
2 6
3 6

Descriptive Statistics
Dependent Variable:Kadar_Gula_Terpakai
Lama_F
ermenta
si Suhu Mean Std. Deviation N
1 1 14.53 .086 3
2 14.20 .101 3
3 12.68 .673 3
Total 13.80 .918 9
2 1 14.45 .312 3
2 12.27 .110 3
3 12.55 .229 3
Total 13.09 1.046 9
Total 1 14.49 .209 6
2 13.24 1.058 6
3 12.61 .456 6
Total 13.45 1.023 18
 104

a
Levene's Test of Equality of Error Variances
Dependent Variable:Kadar_Gula_Terpakai
F df1 df2 Sig.
7.377 5 12 .002
Tests the null hypothesis that the error variance of the
dependent variable is equal across groups.
a. Design: Intercept + Lama_Fermentasi + Suhu +
Lama_Fermentasi * Suhu

Tests of Between-Subjects Effects

Dependent Variable:Kadar_Gula_Terpakai
Type III Sum of
Source Squares df Mean Square F Sig.
a
Corrected Model 16.515 5 3.303 31.334 .000
Intercept 3254.362 1 3254.362 3.087E4 .000
Lama_Fermentasi 2.283 1 2.283 21.655 .001
Suhu 10.929 2 5.465 51.841 .000
Lama_Fermentasi * Suhu 3.303 2 1.651 15.667 .000
Error 1.265 12 .105
Total 3272.142 18
Corrected Total 17.780 17
a. R Squared = .929 (Adjusted R Squared = .899)

Profile Plots
 105

Post Hoc Tests

Suhu

Multiple Comparisons
Kadar_Gula_Terpakai
Tukey HSD
95% Confidence Interval
Mean Difference
(I) Suhu (J) Suhu (I-J) Std. Error Sig. Lower Bound Upper Bound
*
1 2 1.25 .187 .000 .75 1.75
*
3 1.87 .187 .000 1.37 2.37
*
2 1 -1.25 .187 .000 -1.75 -.75
*
3 .62 .187 .016 .12 1.12
*
3 1 -1.87 .187 .000 -2.37 -1.37
*
2 -.62 .187 .016 -1.12 -.12
Based on observed means.
The error term is Mean Square(Error) = .105.
*. The mean difference is significant at the .05 level.

Homogeneous Subsets

Kadar_Gula_Terpakai
Tukey HSD
Subset
Suhu N 1 2 3
3 6 12.61
2 6 13.24
1 6 14.49
Sig. 1.000 1.000 1.000
Means for groups in homogeneous subsets are displayed.
Based on observed means.
The error term is Mean Square(Error) = .105.

Estimated Marginal Means

1. Lama_Fermentasi
Dependent Variable:Kadar_Gula_Terpakai
Lama_F 95% Confidence Interval
ermenta
si Mean Std. Error Lower Bound Upper Bound
1 13.802 .108 13.566 14.038
2 13.090 .108 12.854 13.326
 106

2. Suhu
Dependent Variable:Kadar_Gula_Terpakai
95% Confidence Interval
Suhu Mean Std. Error Lower Bound Upper Bound
1 14.488 .133 14.200 14.777
2 13.235 .133 12.946 13.524
3 12.615 .133 12.326 12.904

3. Lama_Fermentasi * Suhu
Dependent Variable:Kadar_Gula_Terpakai
Lama_F 95% Confidence Interval
ermenta
si Suhu Mean Std. Error Lower Bound Upper Bound
1 1 14.527 .187 14.118 14.935
2 14.197 .187 13.788 14.605
3 12.683 .187 12.275 13.092
2 1 14.450 .187 14.042 14.858
2 12.273 .187 11.865 12.682
3 12.547 .187 12.138 12.955

7.2 Analisis Pengaruh Suhu dan Lama Fermentasi Terhadap Kadar

Eksopolisakarida

Univariate Analysis of Variance

Warnings
Post hoc tests are not performed for Lama_Fermentasi because there are fewer than three groups.

Between-Subjects Factors

Value Label N
Lama_Fermentasi 1 18 Jam 9
2 24 Jam 9
Suhu 1 25 C 6
2 30 C 6
3 35 C 6
 107

Descriptive Statistics
Dependent Variable:Kadar_Eksopolisakarida
Lama_Fer
mentasi Suhu Mean Std. Deviation N
18 Jam 25 C 601.33 54.455 3
30 C 740.00 36.000 3
35 C 489.33 87.757 3
Total 610.22 121.723 9
24 Jam 25 C 274.67 12.858 3
30 C 660.00 28.000 3
35 C 422.67 62.780 3
Total 452.44 171.935 9
Total 25 C 438.00 182.389 6
30 C 700.00 52.460 6
35 C 456.00 77.398 6
Total 531.33 165.751 18

a
Levene's Test of Equality of Error Variances
Dependent Variable:Kadar_Eksopolisakarida
F df1 df2 Sig.
2.584 5 12 .083
Tests the null hypothesis that the error variance of the
dependent variable is equal across groups.
a. Design: Intercept + Lama_Fermentasi + Suhu +
Lama_Fermentasi * Suhu

Tests of Between-Subjects Effects

Dependent Variable:Kadar_Eksopolisakarida
Type III Sum of
Source Squares df Mean Square F Sig.
a
Corrected Model 433341.333 5 86668.267 30.855 .000
Intercept 5081672.000 1 5081672.000 1.809E3 .000
Lama_Fermentasi 112022.222 1 112022.222 39.881 .000
Suhu 257008.000 2 128504.000 45.749 .000
Lama_Fermentasi * Suhu 64311.111 2 32155.556 11.448 .002
Error 33706.667 12 2808.889
Total 5548720.000 18
Corrected Total 467048.000 17
a. R Squared = .928 (Adjusted R Squared = .898)
 108

Profile Plots

Post Hoc Tests

Suhu

Multiple Comparisons
Kadar_Eksopolisakarida
Tukey HSD
95% Confidence Interval
Mean Difference
(I) Suhu (J) Suhu (I-J) Std. Error Sig. Lower Bound Upper Bound
*
25 C 30 C -262.00 30.599 .000 -343.63 -180.37
35 C -18.00 30.599 .829 -99.63 63.63
*
30 C 25 C 262.00 30.599 .000 180.37 343.63
*
35 C 244.00 30.599 .000 162.37 325.63
35 C 25 C 18.00 30.599 .829 -63.63 99.63
*
30 C -244.00 30.599 .000 -325.63 -162.37
Based on observed means.
The error term is Mean Square(Error) = 2808.889.
*. The mean difference is significant at the .05 level.
 109

Homogeneous Subsets

Kadar_Eksopolisakarida
Tukey HSD
Subset
Suhu N 1 2
25 C 6 438.00
35 C 6 456.00
30 C 6 700.00
Sig. .829 1.000
Means for groups in homogeneous subsets are
displayed.
Based on observed means.
The error term is Mean Square(Error) = 2808.889.

Estimated Marginal Means

1. Lama_Fermentasi
Dependent Variable:Kadar_Eksopolisakarida
95% Confidence Interval
Lama_Fer
mentasi Mean Std. Error Lower Bound Upper Bound
18 Jam 610.222 17.666 571.731 648.714
24 Jam 452.444 17.666 413.953 490.936

2. Suhu
Dependent Variable:Kadar_Eksopolisakarida
95% Confidence Interval
Suhu Mean Std. Error Lower Bound Upper Bound
25 C 438.000 21.637 390.858 485.142
30 C 700.000 21.637 652.858 747.142
35 C 456.000 21.637 408.858 503.142

3. Lama_Fermentasi * Suhu
Dependent Variable:Kadar_Eksopolisakarida
95% Confidence Interval
Lama_Fer
mentasi Suhu Mean Std. Error Lower Bound Upper Bound
18 Jam 25 C 601.333 30.599 534.664 668.003
30 C 740.000 30.599 673.331 806.669
35 C 489.333 30.599 422.664 556.003
24 Jam 25 C 274.667 30.599 207.997 341.336
30 C 660.000 30.599 593.331 726.669
35 C 422.667 30.599 355.997 489.336
 110

7.3 Analisis Pengaruh Suhu dan Lama Fermentasi Terhadap Kadar Total
Gula EPS

Univariate Analysis of Variance

Warnings
Post hoc tests are not performed for Lama_Fermentasi because there are fewer than
three groups.

Between-Subjects Factors

N
Suhu 25 C 6
30 C 6
35 C 6
Lama_Fermentasi 18 jam 9
24 jam 9

Descriptive Statistics
Dependent Variable:Kadar_Total_Gula_EPS
Lama_Fe
Suhu rmentasi Mean Std. Deviation N
25 C 18 jam 4.2367 .20033 3
24 jam 3.9667 .47014 3
Total 4.1017 .35544 6
30 C 18 jam 5.9733 .01155 3
24 jam 5.9267 .00577 3
Total 5.9500 .02683 6
35 C 18 jam 3.0667 .08083 3
24 jam 2.9900 .04359 3
Total 3.0283 .07167 6
Total 18 jam 4.4256 1.27118 9
24 jam 4.2944 1.31650 9
Total 4.3600 1.25721 18
 111

Tests of Between-Subjects Effects

Dependent Variable:Kadar_Total_Gula_EPS
Type III Sum of
Source Squares df Mean Square F Sig.
a
Corrected Model 26.330 5 5.266 117.126 .000
Intercept 342.173 1 342.173 7610.417 .000
Suhu 26.209 2 13.105 291.463 .000
Lama_Fermentasi .077 1 .077 1.720 .214
Suhu * Lama_Fermentasi .044 2 .022 .490 .624
Error .540 12 .045
Total 369.043 18
Corrected Total 26.870 17
a. R Squared = ,980 (Adjusted R Squared = ,972)

Estimated Marginal Means

1. Grand Mean
Dependent Variable:Kadar_Total_Gula_EPS
95% Confidence Interval
Mean Std. Error Lower Bound Upper Bound
4.360 .050 4.251 4.469

2. Suhu
Dependent Variable:Kadar_Total_Gula_EPS
95% Confidence Interval
Suhu Mean Std. Error Lower Bound Upper Bound
25 C 4.102 .087 3.913 4.290
30 C 5.950 .087 5.761 6.139
35 C 3.028 .087 2.840 3.217

3. Lama_Fermentasi
Dependent Variable:Kadar_Total_Gula_EPS
95% Confidence Interval
Lama_Fe
rmentasi Mean Std. Error Lower Bound Upper Bound
18 jam 4.426 .071 4.272 4.580
24 jam 4.294 .071 4.140 4.448
 112

Post Hoc Tests

Suhu
Multiple Comparisons
Dependent Variable:Kadar_Total_Gula_EPS

95% Confidence Interval

(J) Mean Difference
(I) Suhu Suhu (I-J) Std. Error Sig. Lower Bound Upper Bound
*
Tukey HSD 25 C 30 C -1.8483 .12242 .000 -2.1749 -1.5217
*
35 C 1.0733 .12242 .000 .7467 1.3999
*
30 C 25 C 1.8483 .12242 .000 1.5217 2.1749
*
35 C 2.9217 .12242 .000 2.5951 3.2483
*
35 C 25 C -1.0733 .12242 .000 -1.3999 -.7467
*
30 C -2.9217 .12242 .000 -3.2483 -2.5951
*
LSD 25 C 30 C -1.8483 .12242 .000 -2.1151 -1.5816
*
35 C 1.0733 .12242 .000 .8066 1.3401
*
30 C 25 C 1.8483 .12242 .000 1.5816 2.1151
*
35 C 2.9217 .12242 .000 2.6549 3.1884
*
35 C 25 C -1.0733 .12242 .000 -1.3401 -.8066
*
30 C -2.9217 .12242 .000 -3.1884 -2.6549
Based on observed means.
The error term is Mean Square(Error) = ,045.
*. The mean difference is significant at the ,05 level.

Homogeneous Subsets
Kadar_Total_Gula_EPS

Subset

Suhu N 1 2 3
a,,b
Tukey HSD 35 C 6 3.0283

25 C 6 4.1017

30 C 6 5.9500

Sig. 1.000 1.000 1.000

Means for groups in homogeneous subsets are displayed.
Based on observed means.
The error term is Mean Square(Error) = ,045.
a. Uses Harmonic Mean Sample Size = 6,000.
b. Alpha = ,05.
 113

Profile Plots
 114

7.4 Analisis Interaksi Suhu dan Lama Fermentasi Terhadap Kadar

Eksopolisakarida

Univariate Analysis of Variance

Warnings

Post hoc tests are not performed for lama_fermentasi because there are fewer than three
groups.

Between-Subjects Factors

suhu 25C 6
30C 6

35C 6
lama_fermentasi 18JAM 9
24JAM 9
interaksi 25C,18JAM 3

25C,24JAM 3

30C,18JAM 3

30C,24JAM 3

35C,18JAM 3

35C,24JAM 3
 115

Descriptive Statistics
Dependent Variable: kadar_EPS
suhu lama_fermentasi interaksi Mean Std. Deviation N
25C 18JAM 25C,18JAM 601,3333 54,45487 3
Total 601,3333 54,45487 3
24JAM 25C,24JAM 274,6667 12,85820 3
Total 274,6667 12,85820 3
Total 25C,18JAM 601,3333 54,45487 3
25C,24JAM 274,6667 12,85820 3
Total 438,0000 182,38860 6
30C 18JAM 30C,18JAM 740,0000 36,00000 3
Total 740,0000 36,00000 3
24JAM 30C,24JAM 660,0000 28,00000 3
Total 660,0000 28,00000 3
Total 30C,18JAM 740,0000 36,00000 3
30C,24JAM 660,0000 28,00000 3
Total 700,0000 52,45951 6
35C 18JAM 35C,18JAM 489,3333 87,75724 3
Total 489,3333 87,75724 3
24JAM 35C,24JAM 422,6667 62,78004 3
Total 422,6667 62,78004 3
Total 35C,18JAM 489,3333 87,75724 3
35C,24JAM 422,6667 62,78004 3
Total 456,0000 77,39767 6
Total 18JAM 25C,18JAM 601,3333 54,45487 3
30C,18JAM 740,0000 36,00000 3
35C,18JAM 489,3333 87,75724 3
Total 610,2222 121,72282 9
24JAM 25C,24JAM 274,6667 12,85820 3
30C,24JAM 660,0000 28,00000 3
35C,24JAM 422,6667 62,78004 3
Total 452,4444 171,93539 9
Total 25C,18JAM 601,3333 54,45487 3
25C,24JAM 274,6667 12,85820 3
30C,18JAM 740,0000 36,00000 3
30C,24JAM 660,0000 28,00000 3
35C,18JAM 489,3333 87,75724 3
35C,24JAM 422,6667 62,78004 3
Total 531,3333 165,75105 18

a
Levene's Test of Equality of Error Variances
Dependent Variable: kadar_EPS
F df1 df2 Sig.
2,584 5 12 ,083
Tests the null hypothesis that the error variance of
the dependent variable is equal across groups.
a. Design: Intercept + suhu + lama_fermentasi +
interaksi + suhu * lama_fermentasi + suhu *
interaksi + lama_fermentasi * interaksi + suhu *
lama_fermentasi * interaksi
 116

Tests of Between-Subjects Effects

Dependent Variable: kadar_EPS

Type III Sum of

Source Squares df Mean Square F Sig.
a
Corrected Model 433341,333 5 86668,267 30,855 ,000
Intercept 5081672,000 1 5081672,000 1809,140 ,000
suhu ,000 0 . . .
lama_fermentasi ,000 0 . . .
interaksi ,000 0 . . .
suhu * lama_fermentasi ,000 0 . . .
suhu * interaksi ,000 0 . . .
lama_fermentasi * interaksi ,000 0 . . .
suhu * lama_fermentasi *
,000 0 . . .
interaksi
Error 33706,667 12 2808,889
Total 5548720,000 18
Corrected Total 467048,000 17

a. R Squared = ,928 (Adjusted R Squared = ,898)

Grand Mean
Dependent Variable: kadar_EPS

95% Confidence Interval

Mean Std. Error Lower Bound Upper Bound

a
531,333 12,492 504,116 558,551

a. Based on modified population marginal mean.

 117

Post Hoc Tests

suhu
Multiple Comparisons
Dependent Variable: kadar_EPS

(I) (J) Mean Difference 95% Confidence Interval

suhu suhu (I-J) Std. Error Sig. Lower Bound Upper Bound
*
Tukey 25C 30C -262,0000 30,59896 ,000 -343,6339 -180,3661
HSD 35C -18,0000 30,59896 ,829 -99,6339 63,6339
*
30C 25C 262,0000 30,59896 ,000 180,3661 343,6339
*
35C 244,0000 30,59896 ,000 162,3661 325,6339

35C 25C 18,0000 30,59896 ,829 -63,6339 99,6339

*
30C -244,0000 30,59896 ,000 -325,6339 -162,3661
*
LSD 25C 30C -262,0000 30,59896 ,000 -328,6694 -195,3306

35C -18,0000 30,59896 ,567 -84,6694 48,6694

*
30C 25C 262,0000 30,59896 ,000 195,3306 328,6694
*
35C 244,0000 30,59896 ,000 177,3306 310,6694

35C 25C 18,0000 30,59896 ,567 -48,6694 84,6694

*
30C -244,0000 30,59896 ,000 -310,6694 -177,3306

Based on observed means.

The error term is Mean Square(Error) = 2808,889.
*. The mean difference is significant at the ,05 level.

kadar_EPS

Subset

suhu N 1 2
a,b
Tukey HSD 25C 6 438,0000

35C 6 456,0000

30C 6 700,0000

Sig. ,829 1,000

Means for groups in homogeneous subsets are displayed.

Based on observed means.
The error term is Mean Square(Error) = 2808,889.
a. Uses Harmonic Mean Sample Size = 6,000.
b. Alpha = ,05.
 118

Multiple Comparisons
Dependent Variable: kadar_EPS
Mean 95% Confidence Interval
(I) Difference
interaksi (J) interaksi (I-J) Std. Error Sig. Lower Bound Upper Bound
*
.Tukey 25C,18JAM 25C,24JAM 326,6667 43,27346 ,000 181,3145 472,0188
HSD 30C,18JAM -138,6667 43,27346 ,065 -284,0188 6,6855
30C,24JAM -58,6667 43,27346 ,751 -204,0188 86,6855
35C,18JAM 112,0000 43,27346 ,174 -33,3521 257,3521
*
35C,24JAM 178,6667 43,27346 ,014 33,3145 324,0188
*
25C,24JAM 25C,18JAM -326,6667 43,27346 ,000 -472,0188 -181,3145
*
30C,18JAM -465,3333 43,27346 ,000 -610,6855 -319,9812
*
30C,24JAM -385,3333 43,27346 ,000 -530,6855 -239,9812
*
35C,18JAM -214,6667 43,27346 ,003 -360,0188 -69,3145
*
35C,24JAM -148,0000 43,27346 ,045 -293,3521 -2,6479
30C,18JAM 25C,18JAM 138,6667 43,27346 ,065 -6,6855 284,0188
*
25C,24JAM 465,3333 43,27346 ,000 319,9812 610,6855
30C,24JAM 80,0000 43,27346 ,474 -65,3521 225,3521
*
35C,18JAM 250,6667 43,27346 ,001 105,3145 396,0188
*
35C,24JAM 317,3333 43,27346 ,000 171,9812 462,6855
30C,24JAM 25C,18JAM 58,6667 43,27346 ,751 -86,6855 204,0188
*
25C,24JAM 385,3333 43,27346 ,000 239,9812 530,6855
30C,18JAM -80,0000 43,27346 ,474 -225,3521 65,3521
*
35C,18JAM 170,6667 43,27346 ,019 25,3145 316,0188
*
35C,24JAM 237,3333 43,27346 ,001 91,9812 382,6855
35C,18JAM 25C,18JAM -112,0000 43,27346 ,174 -257,3521 33,3521
*
25C,24JAM 214,6667 43,27346 ,003 69,3145 360,0188
*
30C,18JAM -250,6667 43,27346 ,001 -396,0188 -105,3145
*
30C,24JAM -170,6667 43,27346 ,019 -316,0188 -25,3145
35C,24JAM 66,6667 43,27346 ,648 -78,6855 212,0188
*
35C,24JAM 25C,18JAM -178,6667 43,27346 ,014 -324,0188 -33,3145
*
25C,24JAM 148,0000 43,27346 ,045 2,6479 293,3521
*
30C,18JAM -317,3333 43,27346 ,000 -462,6855 -171,9812
*
30C,24JAM -237,3333 43,27346 ,001 -382,6855 -91,9812
35C,18JAM
-66,6667 43,27346 ,648 -212,0188 78,6855

*
LSD 25C,18JAM 25C,24JAM 326,6667 43,27346 ,000 232,3819 420,9514
*
30C,18JAM -138,6667 43,27346 ,008 -232,9514 -44,3819
30C,24JAM -58,6667 43,27346 ,200 -152,9514 35,6181
*
35C,18JAM 112,0000 43,27346 ,024 17,7152 206,2848
*
35C,24JAM 178,6667 43,27346 ,001 84,3819 272,9514
*
25C,24JAM 25C,18JAM -326,6667 43,27346 ,000 -420,9514 -232,3819
*
30C,18JAM -465,3333 43,27346 ,000 -559,6181 -371,0486
*
30C,24JAM -385,3333 43,27346 ,000 -479,6181 -291,0486
*
35C,18JAM -214,6667 43,27346 ,000 -308,9514 -120,3819
*
35C,24JAM -148,0000 43,27346 ,005 -242,2848 -53,7152
*
30C,18JAM 25C,18JAM 138,6667 43,27346 ,008 44,3819 232,9514
*
25C,24JAM 465,3333 43,27346 ,000 371,0486 559,6181
30C,24JAM 80,0000 43,27346 ,089 -14,2848 174,2848
*
35C,18JAM 250,6667 43,27346 ,000 156,3819 344,9514
*
35C,24JAM 317,3333 43,27346 ,000 223,0486 411,6181
 119

30C,24JAM 25C,18JAM 58,6667 43,27346 ,200 -35,6181 152,9514

*
25C,24JAM 385,3333 43,27346 ,000 291,0486 479,6181
30C,18JAM -80,0000 43,27346 ,089 -174,2848 14,2848
*
35C,18JAM 170,6667 43,27346 ,002 76,3819 264,9514
*
35C,24JAM 237,3333 43,27346 ,000 143,0486 331,6181
*
35C,18JAM 25C,18JAM -112,0000 43,27346 ,024 -206,2848 -17,7152
*
25C,24JAM 214,6667 43,27346 ,000 120,3819 308,9514
*
30C,18JAM -250,6667 43,27346 ,000 -344,9514 -156,3819
*
30C,24JAM -170,6667 43,27346 ,002 -264,9514 -76,3819
35C,24JAM 66,6667 43,27346 ,149 -27,6181 160,9514
*
35C,24JAM 25C,18JAM -178,6667 43,27346 ,001 -272,9514 -84,3819
*
25C,24JAM 148,0000 43,27346 ,005 53,7152 242,2848
*
30C,18JAM -317,3333 43,27346 ,000 -411,6181 -223,0486
*
30C,24JAM -237,3333 43,27346 ,000 -331,6181 -143,0486
35C,18JAM -66,6667 43,27346 ,149 -160,9514 27,6181
Based on observed means.
The error term is Mean Square(Error) = 2808,889.
*. The mean difference is significant at the ,05 level.
Homogeneous Subsets

kadar_EPS

Subset

interaksi N 1 2 3 4
a,b
Tukey HSD 25C,24JAM 3 274,6667

35C,24JAM 3 422,6667

35C,18JAM 3 489,3333 489,3333

25C,18JAM 3 601,3333 601,3333

30C,24JAM 3 660,0000

30C,18JAM 3 740,0000

Sig. 1,000 ,648 ,174 ,065

Means for groups in homogeneous subsets are displayed.

Based on observed means.
The error term is Mean Square(Error) = 2808,889.
a. Uses Harmonic Mean Sample Size = 3,000.
b. Alpha = ,05.
 120

Profile Plots
 121

7.5 Analisis Interaksi Suhu dan Lama Fermentasi terhadap Kadar Gula
Terpakai Selama Fermentasi

Univariate Analysis of Variance

Between-Subjects Factors

Suhu 25C 6

30C 6

35C 6
Lama_Fermentasi 18Jam 9
24Jam 9
Interaksi 25C,18Jam 3

25C,24Jam 3

30C,18Jam 3

30C,24Jam 3

35C,18Jam 3

35C,24Jam 3
 122

Descriptive Statistics
Dependent Variable: Kadar_Gula_Terpakai
Suhu Lama_Fermentasi Interaksi Mean Std. Deviation N
25C 18Jam 25C,18Jam 14,5267 ,08622 3
Tota
14,5267 ,08622 3
l
24Jam 25C,24Jam 14,4500 ,31241 3
Total 14,4500 ,31241 3
Total 25C,18Jam 14,5267 ,08622 3
25C,24Jam 14,4500 ,31241 3
Total 14,4883 ,20923 6
30C 18Jam 30C,18Jam 14,1967 ,10116 3
Total 14,1967 ,10116 3
24Jam 30C,24Jam 12,2733 ,11015 3
Total 12,2733 ,11015 3
Total 30C,18Jam 14,1967 ,10116 3
30C,24Jam 12,2733 ,11015 3
Total 13,2350 1,05769 6
35C 18Jam 35C,18Jam 12,6833 ,67263 3
Total 12,6833 ,67263 3
24Jam 35C,24Jam 12,5467 ,22942 3
Total 12,5467 ,22942 3
Total 35C,18Jam 12,6833 ,67263 3
35C,24Jam 12,5467 ,22942 3
Total 12,6150 ,45566 6
Total 18Jam 25C,18Jam 14,5267 ,08622 3
30C,18Jam 14,1967 ,10116 3
35C,18Jam 12,6833 ,67263 3
Total 13,8022 ,91768 9
24Jam 25C,24Jam 14,4500 ,31241 3
30C,24Jam 12,2733 ,11015 3
35C,24Jam 12,5467 ,22942 3
Total 13,0900 1,04642 9
Total 25C,18Jam 14,5267 ,08622 3
25C,24Jam 14,4500 ,31241 3
30C,18Jam 14,1967 ,10116 3
30C,24Jam 12,2733 ,11015 3
35C,18Jam 12,6833 ,67263 3
35C,24Jam 12,5467 ,22942 3
Total 13,4461 1,02268 18

a
Levene's Test of Equality of Error Variances
Dependent Variable: Kadar_Gula_Terpakai

F df1 df2 Sig.

7,377 5 12 ,002

Tests the null hypothesis that the error variance of

the dependent variable is equal across groups.
a. Design: Intercept + Suhu + Lama_Fermentasi +
Interaksi + Suhu * Lama_Fermentasi + Suhu *
Interaksi + Lama_Fermentasi * Interaksi + Suhu *
Lama_Fermentasi * Interaksi
 123

Tests of Between-Subjects Effects

Dependent Variable: Kadar_Gula_Terpakai

Type III Sum of

Source Squares df Mean Square F Sig.
a
Corrected Model 16,515 5 3,303 31,334 ,000
Intercept 3254,362 1 3254,362 30873,048 ,000
Suhu ,000 0 . . .
Lama_Fermentasi ,000 0 . . .
Interaksi ,000 0 . . .
Suhu * Lama_Fermentasi ,000 0 . . .
Suhu * Interaksi ,000 0 . . .
Lama_Fermentasi *
,000 0 . . .
Interaksi
Suhu * Lama_Fermentasi *
,000 0 . . .
Interaksi
Error 1,265 12 ,105
Total 3272,142 18
Corrected Total 17,780 17

a. R Squared = ,929 (Adjusted R Squared = ,899)

Estimated Marginal Means

Grand Mean
Dependent Variable: Kadar_Gula_Terpakai

95% Confidence Interval

Mean Std. Error Lower Bound Upper Bound
a
13,446 ,077 13,279 13,613

a. Based on modified population marginal mean.

 124

Post Hoc Tests

Suhu

Multiple Comparisons
Dependent Variable: Kadar_Gula_Terpakai

(I) (J) 95% Confidence Interval

Suhu Suhu Mean Difference (I-J) Std. Error Sig. Lower Bound Upper Bound
*
Tukey 25C 30C 1,2533 ,18745 ,000 ,7532 1,7534
HSD *
35C 1,8733 ,18745 ,000 1,3732 2,3734
*
30C 25C -1,2533 ,18745 ,000 -1,7534 -,7532
*
35C ,6200 ,18745 ,016 ,1199 1,1201
*
35C 25C -1,8733 ,18745 ,000 -2,3734 -1,3732
*
30C -,6200 ,18745 ,016 -1,1201 -,1199
*
LSD 25C 30C 1,2533 ,18745 ,000 ,8449 1,6617
*
35C 1,8733 ,18745 ,000 1,4649 2,2817
*
30C 25C -1,2533 ,18745 ,000 -1,6617 -,8449
*
35C ,6200 ,18745 ,006 ,2116 1,0284
*
35C 25C -1,8733 ,18745 ,000 -2,2817 -1,4649
*
30C -,6200 ,18745 ,006 -1,0284 -,2116

Based on observed means.

The error term is Mean Square(Error) = ,105.
*. The mean difference is significant at the ,05 level.

Homogeneous Subsets
Kadar_Gula_Terpakai
Subset
Interaksi N 1 2
a,b 30C,24Jam 3 12,2733
Tukey HSD
35C,24Jam 3 12,5467
35C,18Jam 3 12,6833
30C,18Jam 3 14,1967
25C,24Jam 3 14,4500
25C,18Jam 3 14,5267
Sig. ,644 ,808

Means for groups in homogeneous subsets are displayed.

Based on observed means.
The error term is Mean Square(Error) = ,105.
a. Uses Harmonic Mean Sample Size = 3,000.
b. Alpha = ,05.
 125

Profile Plots
126