PRINSIP KERJA KROMATOGRAFI GAS

Kromatografi gas atau yang biasa disebut carrier gas digunakan untuk membawa sample
melewati lapisan (bed) material. Karena gas yang bergerak, maka disebut mobile phase (fasa
bergerak), sebaliknya lapisan material yang diam disebut stationary phase (fasa diam).

Cara kerja dari kromatografi gas adalah gas pembawa lewat melalui satu sisi detektor kemudian
memasuki kolom. Di dekat kolom ada suatu alat di mana sampel – sampel bisa dimasukkan ke
dalam gas pembawa ( tempat injeksi). Sampel – sampel tersebut dapat berupa gas atau cairan
yang volatil (mudah menguap). Lubang injeksi dipanaskan agar sampel teruapkan dengan cepat.

Aliran gas selanjutnya menemui kolom,kolom berisi suatu padatan halus dengan luas permukaan
yang besar dan relatif inert. Sebelum diisi ke dalam kolom, padatan tersebut diimpregnasi
dengan cairan yang diinginkan yang berperan sebagai fasa diam atau stasioner sesungguhnya,
cairan ini harus stabil dan nonvolatil pada temperatur kolom dan harus sesuai dengan pemisahan
tertentu. Setelah muncul dari kolom itu, aliran gas lewat melalui sisi lain detektor. Maka elusi
zat terlarut dari kolom mengatur ketidakseimbangan antara dua sisi detektor yang direkam secara
elektrik.

DETEKTOR KROMATOGRAFI GAS

1. Detector Hantar Panas

Detektor hantar panas (TCD) merupakan detektor yang banyak digunakan untuk
Gas Liquid Chromatography. Detektor hantar panas bekerja berdasarkan perbedaan daya
hantar panas (heat transfer) antara gas pembawa dalam keadaan murni terhadap daya
hantar panas gas pembawa yang mengandung cuplikan. Gas pembawa yang dapat
digunakan adalah hidrogen dan helium. Helium merupakan gas pembawa yang cocok
untuk detektor konduktivitas termal karena konduktivitas termalnya jauh lebih besar
daripada kebanyakan senyawa organik dan tidak memiliki suatu bahaya ledakan.
Kepekaan detektor konduktivitas termal dapat ditingkatkan dengan menjalankan
elemen – elemen pada temperatur yang lebih tinggi dengan memberikan suatu arus
jembatan yang besar, tetapi melibatkan harapan hidup elemen tersebut kecil. Detektor ini
secara umum tidak bersifat menghancurkan. Detektor ini relatif sederhana, tidak mahal,
 memiliki kepekaan yang cukup bagi banyak kegunaan.
TCD terdiri dari filamen yang dipanaskan dengan listrik ataupun suatu thermistor.
Termistor adalah bantalan kecil yang dispakan dengan menggabungkan campuran logam
oksida umumnya dari mangan, kobal, nikel, dan runut logam lainnya. Detector jenis ini
memiliki dua buah filamen (Pt, Au atau W) yang terpisah tetapi berada pada satu blok
masif yang dipanaskan pada suhu tertentu. Kedua filamen ini berukuran standard an akan
mempunyai tahanan, R, yang sama jika dipanaskan pada suhu yang sama. Masing-
masing filamen berhubungan satu dengan lainnya menurut jembatan wheatstone. Ketika
sebuah elutes analit dan konduktivitas termal dari kolom limbah berkurang, filamen
memanas dan perlawanan perubahan. Perubahan resistansi sering dirasakan oleh
jembatan Wheatstone rangkaian yang menghasilkan perubahan tegangan terukur

Skema dari desain detektor konduktivitas termal klasik memanfaatkan jembatan

Wheatstone sirkuit. Aliran referensi resistor 4 dari rangkaian mengkompensasi hanyut karena
fluktuasi aliran atau suhu. Perubahan konduktivitas termal dari aliran limbah kolom di resistor 3
akan mengakibatkan perubahan suhu resistor dan karena itu perubahan resistansi yang dapat
diukur sebagai sinyal.
Masing-masing filamen dapat juga dihubungkan dengan kolom kromatografi, namun
harus sangat identik (jenis, bahan, panjang, diameter kolom dan fasa diam). Sebelum alat
dinyalakan, gas pembawa harus sudah dialirkan ke dalam kedua kolom pada kecepatan alir yang
sesuai untuk menghindari oksidasi filamen oleh O2dari udara. Detektor ini dapat mendeteksi
perubahan konduktivitas termal dari kolom limbah dan membandingkannya dengan referensi
aliran gas pembawa.
2. Detektor Ionisasi Nyala (FID)
Detektor Ionisasi Nyala (FID) merupakan jenis detektor gas yang digunakan dalam
kromatografi gas. Pendeteksian senyawa organik yang paling efektif dilakukan dengan ionisasi
nyala. Prinsip dasar detektor pengionan nyala adalah energi kalor dalam nyala hidrogen cukup
untuk menyebabkan banyak molekul untuk mengionisasi. Gas efluen dari kolom dicampur
dengan hidrogen dan dibakar pada ujung jet logam dalam udara brlebih. Suatu potensial
diberikan antara jet dan elektroda kedua yang bertempat di atas atau sekitar nyala itu. Ketika ion
– ion itu dibentuk dalam nyala, ruang gas antara kedua elektroda menjadi lebih konduktif dan
arus meningkat mengalir dalam sirkuit. Arus ini melewati resistor, tegangan terbentuk yang
dikuatan untuk menghasilkan suatu isyrat yang diterima perekam.
Dengan detektor pengionan nyala, konsentrasi ion – ion dalam ruang antara elektroda dan
besarnya arus tersebut sangat bergantung pada laju dimana molekul – molekul zat terlarut
dikirim ke nyala. Berat zat terlarut yang mencapai nyala dalam satuan waktu akan mnghasilkan
respon detektor yang sama berapapun tingkat pengenceran oleh gas pembawa. Ini dasar untuk
pernyataan bahwa detektor ini memberi respon bukan pada konsentrasi zat terlarut tetapi pada
laju alir massa zat terlarut tersebut. Juga perlu diperhatikan bahwa Detektor pengionan nyala
dapat menghancurkan komponen – komponen sampel
Sebagai contoh, sebuah FID sangat baik untuk mendeteksi metana dalam nitrogen, karena
akan merespon metana tetapi tidak untuk nitrogen. Jumlah besar yang terbaik untuk mendeteksi
hidrokarbon dan komponen lain yang mudah terbakar dengan mudah. Mereka sangat sensitif
terhadap komponen-komponen ini, dan respon cenderung menjadi linier di berbagai konsentrasi.
Namun, FID menghancurkan sebagian besar dari komponen itu. Sebaliknya, dengan TCD
komponen dapat melanjutkan ke detektor lain setelah melewati TCD, sehingga dianggap sebagai
detector non-destruktif (ini dapat berguna untuk menganalisa campuran yang kompleks dimana
detektor yang berbeda diperlukan karena selektivitas detektor yang berbeda). Namun,dengan FID
sebuah, komponen sebagian besar hancur dan tidak ada deteksi lebih lanjut.Seperti namanya,
analisis melibatkan deteksi ion . Sumber ion ini adalah api hidrogen- udara kecil. Kadang-kadang
hidrogen-oksigen api digunakan karena kemampuan untuk meningkatkan sensitivitas deteksi,
namun untuk analisis kebanyakan, penggunaan kompresi udara bernapas cukup. Nyala api yang
dihasilkan seperti terbakar pada suhu untuk pyrolyze kebanyakan senyawa organik,
menghasilkan ion positif diisi dan elektron. Respon detektor ditentukan oleh jumlah atom karbon
(ion) yang memukul detektor per satuan waktu. Hal ini membuat detektor sensitif terhadap massa
daripada konsentrasi, karena respon detektor tidak sangat dipengaruhi oleh perubahan dalam
tingkat aliran gas pembawa

3. DETEKTOR FOTOMETRI NYALA

Detektor fotometri nyala yang diciptakan oleh Grant di akhir 1950-an untuk mengukur
kadar hidrokarbon aromatik benzole. Dalam pembuatan gas batubara (baik sebagai produk utama
dari sebuah karya kota-gas, atau sebagai produk sampingan dari oven coke) gas telah digosok
dengan minyak dan benzole yang pulih dari minyak distilasi. Benzole adalah campuran
kompleks dari hidrokarbon, sebagian besar aromatik, yang sebagian besar adalah benzena. Grant
menggunakan hidrogen sebagai gas pembawa dan membakar hidrogen dari kromatografi kolom
di jet kecil mirip dengan detektor nyala termokopel atau detektor ionisasi nyala. Setiap aromatik
terbakar dalam nyala yang diberikan sangat bercahaya dan dengan demikian, senyawa aromatik
dapat selektif diidentifikasi. Respon detektor sebagian besar kualitatif tetapi oleh kalibrasi yang
sesuai dapat dibuat kuantitatif
 Penentuan senyawa yang mengandung belerang atau fosfor adalah tugas dari detektor
fotometri nyala (FPD). Perangkat ini menggunakan reaksi chemiluminescent senyawa ini dalam
hidrogen / nyala udara sebagai sumber informasi analitis yang relative spesifik untuk zat yang
mengandung dua jenis atom. Kekurangan di sini adalah bahwa filter harus dipertukarkan antara
berjalan kromatografi jika keluarga lain dari senyawa yang akan terdeteksi. Detector ini banyak
digunakan untuk menetapkan residu pestisida belerang organic (mengandung gugus merkaptan)
dan fosfor organic dari golongan phosphamidon seperti racun hama, diazinon atau baygon.

PRINSIP KERJA HPLC

Kerja HPLC pada prinsipnya adalah pemisahan analit-analit berdasarkan kepolarannya,
alatnya terdiri dari kolom (sebagai fasa diam) dan larutan tertentu sebagai fasa geraknya. Yang
paling membedakan HPLC dengan kromatografi lainnya adalah pada HPLC digunakan tekanan
tinggi untuk mendorong fasa gerak. Campuran analit akan terpisah berdasarkan kepolarannya,
dan kecepatannya untuk sampai ke detektor (waktu retensinya) akan berbeda, hal ini akan
teramati pada spektrum yang puncak-puncaknya terpisah.
 Urutan skala polaritas : golongan fluorocarbon < golongan hidrokarbon < senyawa
terhalogenasi < golongan eter < golongan ester < golongan keton < golongan alkohol < golongan
asam.
HPLC dapat menganalisa secara kualitatif dan kuantitatif. Pada proses kualitatif cara
yang paling umum untuk mengidentifikasi adalah dengan melihat Retention time
(RT). Peak yang mempunyai RT yang sama dengan standard umumnya adalah sebagai peak
milik analat. Selain melihat RT hal lain yang perlu dilihat adalah spektrum 3D dari signal
kromatogram. Zat yang sama akan mempunyai spektrum 3D yang juga sama. Sehingga jika
spektrum 3D antara dua zat berbeda, maka kedua zat tersebut juga dipastikan adalah zat yang
berlainan, meskipun memiliki RT yang sama.
Kemudian melalui analisa kuantitatif dapat diketahui kadar komponen yang dianalisis di
dalam sampel. Yang berperan dalam proses separasi pada system HPLC adalah kolom. Ada
kolom yang digunakan untuk beberapa jenis analisa, misalnya kolom C18 yang dapat digunakan
untuk analisa carotenoid, protein, lovastatin, dan sebagainya. Namun ada juga kolom yang
khusus dibuat untuk tujuan analisa tertentu, seperti kolom Zorbax carbohydrat (Agilent) yang
khusus digunakan untuk analisa karbohidrat (mono-, di-, polysakarida). Keberhasilan proses
separasi sangat dipengaruhi oleh pemilihan jenis kolom dan juga fasa mobil.
Setelah komponen dalam sample berhasil dipisahkan, tahap selanjutnya adalah proses
identifikasi. Hasil analisa HPLC diperoleh dalam bentuk signal kromatogram. Dalam
kromatogram akan terdapat peak-peak yang menggambarkan banyaknya jenis komponen dalam
sample.
Sample yang mengandung banyak komponen didalamnya akan mempunyai kromatogram
dengan banyakpeak. Bahkan tak jarang antar peak saling bertumpuk (overlap). Hal ini akan
menyulitkan dalam identifikasi dan perhitungan konsentrasi. Oleh karena itu biasanya untuk
sample jenis ini dilakukan tahapan preparasi sample yang lebih rumit agar sample yang siap
diinjeksikan ke HPLC sudah cukup bersih dari impuritis. Sample farmasi biasanya jauh lebih
mudah karena sedikit mengandung komponen selain zat aktif. Sample ini umumnya hanya
melalui proses pelarutan saja.

DETEKTOR KROMATOGRAFI HPLC

1. Detektor spektrofotometrik
 Detektor spektrofotometri , biasanya dalam daerah ultraviolet, digunakan secara luas.
Idealnya, spektrofotometri yang nyata dengan pemilihan panjang gelombang yang sempurna
akan memberikan fleksibilitas yang maksimal untuk mendeteksi berbagai macam zat terlarut
dengan sensitivitas yang sangat baik, sel sample yang biasa akan digantikan dengan suatu alir
untuk melewatkan larutan eluen kolom guna menembus berkas sample dari peralatan tersebut.
Spektrofotometer ultraviolet yang modern merupakan salah satu detector yang sangat mahal,
sehingga dibutuhkan suatu kompromi. Dibandingkan dengan ribuan dollar yang harus
dikeluarkan untuk spektrofotometer yang hanya bahkan tergolong kelas dua saja, maka $2500
atau sekitar itu akan mendapatkan sebuah detector untuk memonitor larutan eluen kolom pada
254 atau 280 nm (harga-harga tahun 1989). Biaya yang lebih rendah mencerminkan penggunaan
spektrum garis lampu uap merkuri dan bukan suatu sumber kontinyu dan monokromator,
penyaring-penyaring yang sederhana mengisolasi garis yang diinginkan di dalam spektrum
merkuri.

Pemilihan panjang gelombang yang terbatas itu tampaknya membatasi, tetapi detektor-
detektor sederhana ini bekerja dengan baik pada banyak kasus. Contohnya, protein yang
menyerap semua pada 280 nm akibat adanya rantai samping asam amino aromatik, dan hampir
semua senyawa aromatik termasuk yang banyak diminati di bidang biologi (yakni: purin,
pirimidin, nukleosida, nukleotida, dan asam nukleat) dapat dideteksi pada 254 nm.

Sensitivitas bervariasi berdasarkan kecocokan antara lain pita absorpsi zat terlarut dan
panjang gelombang detektor yang tersedia dan intensitas pita dan panjang jalan yang melewati
sel detektor, tetapi sebagai pedoman kasar, detektor ultraviolet akan dapat “melihat” kuantitas
nanogram, bisa kita katakan bahwa susunannya 1000 kali lebih sensitiv daripada detektor indeks
bias. Sebagai tambahan, detektor ini relatif tidak sensitif terhadap temperatur.

2. Detektor Fluorometrik
Detektor-detektor yang didasarkan pada fluroresens sudah semakin biasa. Jenis yang paling
serbaguna mampu menghasilkan eksitasi variable yang terus menerus di sepanjang suatu
jangkauan panjang gelombang yang lebar dengan memanfaatkan sebuah sumber kontinyu dan
monokromator, biasanya penyaring-penyaring yang sederhana digunakan untuk mentransmisikan
emisi pendaran pada foto detektor sambil menahan radiasi eksitasinya. Versi yang lebih murah
menggunakan penyaring pada sisi eksitasi maupun sisi emisi dan memanfatkan sumber dengan
panjang gelombang eksitasi yang lebih terbatas. Banyak senyawa dapat dideteksi dengan
fluoresens, termasuk diantaranya banyak pencemar lingkungan, seperti hidrokarbon aromatik
polisiklik, dan yang diminati dalam bidang biologi, seperti vitamin, obat-obatan dan
neurotransmitter. Kadang-kadang fasa bergerak melewati suatu reaktor pasca kolom dimana
komponen-komponen sample nonfluoresensnya dikonversikan menjadi turunan berpendar. Suatu
contoh yang paling terkenal adalah pendeteksian asam-asam amino pada tingkat subnanogram
setelah reaksi dengan reagen fluoresamin (fluorescamin).

3. Detektor Elektrokimia
Detektor elektrokimia biasanya didasarkan pada daya hantar listrik (konduktometri) dan
polarografi. Detektor jenis konduktometri biasanya digunakan untuk mendeteksi solute-solut
yang dapat mengalami reaksi redoks baik senyawa organic maupun anorganik.
Pada detektor ini, larutan eluen dari kolom memasuki sebuah sel di mana larutan tersebut
mengalir di atas permukaan sebuah elektroda yang diberi potensial pada suatu harga, dimana
komponen-komponen smpel mengalami reaksi transfer electron. Pendeteksian jenis ini telah
digunakan, misalnya untuk neurotransmitter dan metabolisme mereka di dalam ekstra selular dari
jaringan otak hewan percobaan, senyawa-senyawa seperti dopamin, norepinefrin, serotonin dan
asam homovanilik menghasilkan arus oksidasi pada elektroda karbon mirip yang diberi potensial
+0,60 V vs. Sebuah elektroda referensi perak-perak klorida. Elektroda referensi pada umumnya
melewati semacam jembatan garam.