BIOSINTESIS LISIN DI STREPTOMYCES LIPMANII:

IMPLIKASI DI BIOSINTESIS ANTIBIOTIK

Streptomyces lipmanii menghasilkan dua, antibiotik laktam, penisilin N dan 7-
(5-amino-5-carboxyvaleramido) -7-methoxycephalosporanic acid. Kedua antibiotik
mengandung rantai samping asam a-aminoadipic. Dalam antibiotik serupa yang
diproduksi oleh jamur tertentu, bagian a-aminoadipoyl berasal dari perantara di
biosintesis lisin. Antibodi yang mengandung laktam-ring adalah kelas antibiotik yang
sangat penting secara komersial.
Biosintesis lisin dapat terjadi setidaknya oleh dua jalur yang sepenuhnya
berbeda. Dalam jamur yang lebih tinggi, termasuk Penicillium dan Cephalosporium,
lisin disintesis melalui jalur homocitrate di mana aAAA adalah perantara. Ini
menyediakan sumber prekursor antibiotik (11, 16). Jalur kedua berlanjut asam
diaminopimelic (DAP) dan berhubungan dengan sintesis asam amino rantai cabang.
Jalur dari asam aspartat ke DAP telah dipelajari secara ekstensif di Escherichia coli
oleh Gilvarg dan rekan-rekannya (8, 15, 19, 29). Jalur ini biasanya terjadi pada bakteri,
beberapa kelompok jamur rendah, dan tumbuhan tinggi (23). Posisi filogenetik dari
Streptomyces dan laporan DAP dalam sel streptomikete dinding (4, 14) menunjukkan
bahwa jalur DAP akan beroperasi dalam genus ini.
Jelas bahwa lisin memang disintesis melalui jalur DAP di S. Iipmanii. Temuan
ini menunjukkan mekanisme yang unik untuk derivasi aAAA diperlukan untuk sintesis
antibiotik dalam organisme ini. S. Iipmanii (LlOO) dan auxotroph lisin berasal dari (LA
423). Komposisi media per liter air deionisasi suling adalah sebagai berikut ini: (ii)
vegetatif medium-tryptone (5 g), glukosa (5 g), ekstrak ragi (5 g), dekstrin (10 g),
MgSO4 7H, O (2 g), dan gliserol (1 ml); (ii) fermentasi menengah-NaCl (1 g), MgCl,
26H20 (1 g), K2HPO4 (1 g), CaCO, (4 g), jejak garam (10 ml),maltose (20 g), glukosa
(5 g), gliserol (1 ml), DL-metionin (1 g), L-triptofan (1 g), L-valin (1 g), dan L-lysine (1
g). Larutan stok garam yang terdiri dari: FeSO4 7H20 (0,01 g), MnCl2 4H20 (0,01 g),
ZnSO4. 7H2O (0,01 g), dan air deionisasi suling (100 ml). Garam, karbohidrat, dan
asam amino diautoklaf secara terpisah dan dirakit secara aseptik setelahnya
sterilisasi. Variasi konsentrasi lisin harus ditentukan.
Akumulasi. LA 423, mutan tidak menunjukkan respons pertumbuhan pada
senyawa apa pun selain lisin. Akumulasi DAP maksimal diamati ketika organisme itu
tumbuh di media fermentasi dengan konsentrasi lisin berkurang menjadi 10 ug / ml.
Tidak ada akumulasi yang signifikan dari produk ninhidrin-positif lain dari keluarga
asam aspartat. Pemindaian lengkap menunjukkan bahwa berbagai asam amino hadir
di kolam L100 dan LA 423 tumbuh dengan 1 mg lisin per ml. Namun, di bawah kondisi
tertekan di mutan, puncak DAP pada dasarnya satu-satunya yang ditemukan-
perubahan dramatis dalam metabolisme sel. Pemeriksaan kaldu mengungkapkan
bahwa lysin eksogen terkuras habis secara linear. Kolam lisin intraseluler meningkat
hingga 72 jam, dan DAP tidak ada. Ini merupakan derepresi yang jelas atau "berputar
pada "jalur. Pada 120 jam, sejumlah besar DAP hadir di kolam asam amino bebas,
meskipun tidak dibandingkan dengan tingkat yang diproduksi di bawah kondisi
kelaparan.
Ketika lisin terbatas (10 jg / ml), tidak ada strain akumulasi aAAA di kolam
intraseluler. Kedua strain, menghasilkan kolam ketika mereka diberi makan 1 mg lisin
per ml. Kolam juga muncul ketika 1 mg DAP per ml ditambahkan ke kaldu rendah lisin
dalam budaya L100. Antibiotik diproduksi oleh salah satu strain, tetapi hanya ketika
diberikan kadar lisin yang tinggi. Menambahkan DAP tidak memungkinkan produksi
antibiotik terdeteksi pada organisme baik.
 Enzim. Diaminopimelate decarboxyl-ase mengkatalisis konversi DAP menjadi
lisin dan CO2. Produk reaksi dalam S. Iipmanii diidentifikasi dalam uji isotop. CO2
radioaktif dikumpulkan dalam hidroksida hidroksida dan dihitung dengan
penghitungan gemilang. Lisin diidentifikasi dengan pemeriksaan campuran reaksi
dalam beberapa sistem kromatografi kertas. Di masing-masing, puncak baru
berhubungan dengan posisi lisin otentik. Tidak ada puncak tambahan yang terbentuk
bahkan pada inkubasi selama 24 jam.
Laju konversi s diaminopimelate menjadi lisin yang diukur dengan uji
kolorimetri. Untuk menormalkan data yang diperoleh 0 dengan teknik ini, hasilnya
dinyatakan sebagai produk L yang terbentuk per miligram protein, dengan asumsi
rasio equimolar substrat dan 2 produk. Aktivitas enzimatik menunjukkan pH optimum
7,3. Aktivitas agak lebih stabil dasar dari pada pH asam. Sekitar 50% aktivitas
dipertahankan pada pH 8,05, sedangkan itu tidak terdeteksi pada pH 6,0.
Aktivitas secara signifikan menurun dengan penghapusan salah satu dari
kofaktor, pyridoxal phosephate atau BAL. Penghilangan pyridoxal phosephate atau
BAL menyebabkan 50 atau 16% kerugian dalam aktivitas, masing-masing. D-
Penicillamine, menghasilkan penghambatan hanya sampel yang diobati.
Penghambatan aktivitas berkisar dari 7% pada 1 mM penicillamine hingga 35% pada
3 mM. Kelebihan dari pyridoxal phosphate (6 mM) ditambahkan pada saat yang sama
dengan inhibitor sepenuhnya mencegah inhibisi.
Pengaruh lisin pada aktivitas enzim. Untuk menentukan apakah sintesis enzim
lisis ditekan, aktivitas spesifik enzim dari L100 yang tumbuh pada 1 mg lisin per ml
dan pada 10 ug lisin per ml dibandingkan.
Aktivitas enzim di LA 423. Tidak ada aktivitas dekarboksilase DAP terdeteksi di
LA 423 dalam kondisi apa pun yang digunakan untuk L100. Namun, sensitivitas dari
tes yang dijelaskan adalah seperti kebocoran kecil tidak akan terdeteksi.
Penggabungan asam aspartat ke dalam DAP. Sel-sel LA 423 diderepresi untuk
biosintesis lisin dengan cepat mengambil asam aspartat dan mengakumulasi dalam
suatu senyawa yang secara kromatografi tidak dapat dibedakan dari DAP dalam
empat sistem pelarut. Tidak ada bukti konversi ke lisin. Dalam percobaan serupa yang
dilakukan dengan L100, baik DAP maupun lisin tidak terakumulasi.
Senyawa radioaktif pertama yang terdeteksi dalam ekstrak asam amino pool
gagal bermigrasi dengan asam aspartat di salah satu dari empat sistem kromatografi.
Pemeriksaan kaldu mengungkapkan bahwa asam amino tetap tidak berubah di luar
sel. Ini mungkin menunjukkan bahwa asam aspartat diaktifkan saat masuk ke sel-
mungkin ke fosfat ester. Namun, labilitas senyawa tersebut mencegah identifikasi
lebih lanjut. Penanganan tambahan menghasilkan senyawa yang sekali lagi
berperilaku seperti asam aspartat.
Penggabungan "IC-lisin (UL) ke dalam antibiotik. Penggabungan label dari lisin
ke dalam antibiotik mendukung hipotesis bahwa katabolisme lisin menghasilkan
komponen antibiotik. Waktu yang dipilih untuk penambahan label adalah fase log
produksi setiap faktor antibiotik- 24 jam untuk penisilin N dan 72 jam untuk
cephalosporin. Hasil di bawah kedua set kondisi adalah sama.
LA 423, mutan lisin yang dijelaskan sebelumnya, terbukti rusak pada
dekarboksilase diaminopimelata. Organisme gagal menunjukkan aktivitas yang dapat
diukur dalam kondisi apa pun yang digunakan untuk jenis liar. Ketidakmampuan
organisme untuk tumbuh tanpa lisin, akumulasi DAP di bawah kondisi tertekan, dan
kurangnya aktivitas dekarboksilase DAP menetapkan bahwa reaksi ini merupakan
langkah yang diperlukan untuk biosintesis lisin di S. lipmanii.
 Fakta bahwa DAP diakumulasi hanya ketika mutan kelaparan untuk lisin
menunjukkan bahwa lisin dapat mengerahkan kontrol atas langkah sebelumnya (s) di
jalur tersebut.
Karakterisasi yang sangat mendasar dari enzim dalam ekstrak dari jenis liar
dilakukan. Hasil menunjukkan bahwa enzim dari organisme ini mirip dengan yang
dijelaskan pada bakteri lain. Harus diakui, bahwa ketidakmampuan untuk
menunjukkan induksi jauh dari bukti konklusif bahwa itu tidak terjadi. Kesulitan dalam
kasus-kasus seperti ini berasal dari fakta bahwa itu tidak mungkin untuk benar-benar
menghilangkan sel inducer yang bersangkutan atau bahkan untuk mengatur level
yang ada. Bahkan dengan pertimbangan ini, bagaimanapun, seseorang mungkin
masuk akal mengharapkan beberapa perbedaan dalam aktivitas dari enzim yang
diinduksi dalam pandangan dari level kolam yang berubah dari DAP.
Penggabungan label dari "C-aspartic acid ke DAP menyimpulkan bukti untuk
pengoperasian jalur jalan diaminopimelate untuk biosintesis lisin di S. lipmanii.
Temuan ini unik untuk produsen antibiotik B-laktam dengan rantai samping aAAA.
Studi akumulasi mendukung hipotesis bahwa aAAA adalah produk katabolik
lisin dalam sistem ini. Produksi kolam aAAA atau antibiotik tergantung pada lisin yang
diberikan. Jika aAAA adalah perantara, efek sebaliknya akan diharapkan. Di
Penicillium chrysogenum, misalnya, lisin telah terbukti dapat menekan sintesis
antibiotik (11, 16). Represi dianggap sebagai hasil umpan balik penghambatan enzim
awal (s) dalam jalur lisin. Ini, pada gilirannya, akan mencegah sintesis aAAA,
perantara di jalur organisme itu. Tanpa sumber itu prekursor, antibiotik tidak disintesis.
Eksperimen sederhana yang menunjukkan penggabungan L - ["4C] lysine (UL)
ke dalam antibiotik sama sekali tidak dimaksudkan untuk membuktikan teori
katabolisme lisin yang benar. Ini hanya memberikan indikasi bahwa teori semacam itu
mungkin terbukti benar dan alasan untuk melanjutkan pendekatan ini terhadap
biosintesis antibiotik.