PROSEDUR PURIFIKASI LTA dari BAKTERI L.

Acidophilus

1. Bacterial strains and growth conditions.

L. Acidophilus ditumbuhkan dalam kondisi anaerob pada Man-Rogosa-Sharpe (MRS)
broth (Difco, Detroit, Mich) selama semalam dengan suhu 37 derajat celcius. Setelah
itu disentrifuge selama 10 menit pada 4,000 x g pada suhu 4 derajat celcius and dicuci
dengan phosphate-buffered saline (PBS). Kemudian bakteri direndam ulang
(resuspended) pada DMEM atau RPMI 1640 medium
2. Isolasi LTA L. Acidophilus menggunakan metode Fischer. Bakteri yang telah dikultur
semalam pada MRS broth, ditanam dan direndam pada 0.1 M sodium acetate (Ph 4.5)
pada 800 mg (wet weight) per ml dari buffer.
3. Untuk ekstraksi LTA, sel bakteri di campur dengan 2 volumes methanol dan 1 volume
chloroform selama semalam pada suhu kamar.
4. Kemudian sel bakteri di filtrasi, dicuci dengan 2 volume methanol, dan direndam ulang
pada 0,1 M sodium acetate (Ph 4.7) pada konsentrasi 500 mg dari sel bakteri per ml
dari buffer.
5. Suspensi (endapan) di campur dengan volume yang sama dari 80% (wt/vol) aqueous
phenol panas dan diaduk secara konstan selama 45 menit pada water bath dengan suhu
65 derajat celcius.
6. Pada saat pendinginan, hasilnya akan berbentuk emulsi, yang dapat dipecah menjadi 2
fase melalui centrifuge pada suhu 4 derajat celcius dengan 5,000xg selama 30 menit.
 Layer phenol bagian bawah terdiri dari lipid dan residu insoluble yang
mengandung peptidoglycan dinding sel.
 Aqueous layer bagian atas yang terdiri dari LTA, nucleic acid, polysaccharides,
tiechoic acids, proteins di dialisis secara ekstensif pada 0,1 M sodium accetate
(ph 4.) dan disesuaikan pada 15% 1-propanol.
7. Kemudian larutan diterapkan pada octyl-Sepharose CL-4B column (Pharmacia)
diequilibrasi pada 0.1 M sodium acetate (Ph 4.7) yang mengandung 15% 1-propanol,
dengan flow rate 0.1 ml/min. Kemudian dicuci secara ekstensif dengan buffer hingga
asorption pada 260 dan 280 nm yang dekat dengan baseline level dan carbohydrate
tidak lagi terdeteksi oleh phenol-sulfuric acid method.
8. Elusi dari LTA dilakukan dengan gradien 15-80% 1-propanol pada buffer yang sama
dengan flow rate 0.5 ml/min. Monitoring dari konsentrasi 1-propanol dilakukan dengan
mengukur refraction index. Setiap fraksi dianalisis kandungannya dengan carbohydrate
dan phosphorus.
9. Kontaminasi asam nukleat dilakukan dengan absorpsi ada 260 dan 80 nm. Protein
diukur dengan absorpsi pada 280 nm dan bicinchoninic acid test.
10. Fraksi dikonsentrasi menggunakan rotavaporator untuk menyingkirkan propanol
kemudian di dialisis secara ekstensif terhadap air. Setelah fraksi terkonsentrasi, 0,1 M
sodium acetate (ph 4.7) ditambhkan dan aliquots dibekukan pada -20 derajat celcius.
Aktivitas antigenic dari LTA diverifikasi dengan ELISA
11. Deacilasi LTAs. 1 mg LTA di inkubasi selama 16 jam pada 15% ammonium
hydroxide. Setelah evaporasi, sampel direndam ulang di 1 volume distilled water dan
19 volume chloroform-methanol (2:1). Setelah vigorous vortexing, 0.2 volume distilled
water ditambahkan, kemudian terdpat 2 fase.
 Untuk mengkonfirmasi deacilasi, fase pertama berbentuk asam lemak diasses
oleh gas chromatography (GC)-mass spectometry (MS).
 Yang kedua, decilasi dengan bentuk fase aqueous di dialisis terhadap air,
dikonsentrasikan menggunakan rotavaporator, yang disesuaikan dengan
konsentrasi karbohidrat yang sama sebagai LTA yang tidak terdeacilasi.