High-Performance kapiler Elektroforesis untuk Menentukan

HIV-1 Tat Protein di Neuron

Satish L. Deshmane 1, Ruma Mukerjee 2, Shongshan Fan 3, Bassel E. Sawaya 2 *
1 Departemen Neuroscience dan Pusat Neurovirology, Temple University School of Medicine, Philadelphia, Pennsylvania, Amerika Serikat, 2 Laboratorium Studi Molekuler Penyakit neurodegenerative, Departemen Neurologi, Temple

University School of Medicine, Philadelphia, Pennsylvania, Amerika Serikat,

3 Departemen Patologi dan Laboratorium Kedokteran, Temple University School of Medicine, Philadelphia, Pennsylvania, Amerika Serikat

Abstrak

HIV-1 protein, Tat telah terlibat dalam patogenesis AIDS Namun, jumlah yang beredar Tat diyakini sangat rendah dan kuantifikasi yang telah sulit. Kami melakukan
kuantifikasi Tat dilepaskan dari sel yang terinfeksi dan diambil oleh neuron menggunakan kinerja tinggi elektroforesis kapiler. Ini adalah laporan pertama yang
berhasil mengukur jumlah Tat dalam neuron dan menempatkan Tat sebagai pemain kunci yang terlibat dalam gangguan neurokognitif terkait HIV.

Kutipan: Deshmane SL, Mukerjee R, Fan S, Sawaya BE (2011) High-Performance kapiler Elektroforesis untuk Menentukan HIV-1 Tat Protein di Neuron. PLoS ONE 6 (1): e16148. doi: 10.1371 / journal.pone.0016148

Editor: Fatah Kashanchi, George Mason University, Amerika Serikat

diterima 18 Agustus 2010; diterima 9 Desember 2010; Diterbitkan 7 Januari 2011

Hak cipta: 2011 Deshmane et al. Ini adalah sebuah artikel akses terbuka didistribusikan di bawah persyaratan Lisensi Creative Commons Attribution, yang memungkinkan
penggunaan tak terbatas, distribusi, dan reproduksi dalam media apapun, asalkan penulis asli dan sumber dikreditkan.

pendanaan: NIH R01NS059327. Penyandang dana tidak memiliki peran dalam desain penelitian, pengumpulan data dan analisis, keputusan untuk mempublikasikan, atau penyusunan naskah.

Bersaing Minat: Para penulis telah menyatakan bahwa tidak ada kepentingan bersaing ada.

* E-mail: sawaya@temple.edu

pengantar
infeksi HIV adalah pandemi dengan lebih dari 30 juta orang terinfeksi di seluruh
dunia. Di Amerika Serikat menyusul terjadinya AIDS, pasien 10- 15% per tahun
mengembangkan HAND, sebuah neurokognitif dan motor kelainan selama tahap
lanjut infeksi [1]. Namun, dalam beberapa tahun terakhir, in vitro dan ex vivo studi
telah berusaha untuk mencirikan mekanisme yang mendasari hubungan antara
infeksi dan HAND HIV. Data yang tersedia menunjukkan bahwa mekanisme (s)
menyebabkan kerusakan pada otak pasien AIDS mungkin melibatkan efek gabungan
lebih dari satu faktor neurotoksik [2]. Secara khusus, bukti menunjukkan bahwa
protein virus (misalnya, Tat) disekresikan dari HIV-1 sel yang terinfeksi [3] adalah
antara faktor-faktor tersebut. Meskipun penggunaan ART mengurangi frekuensi
HAND, pengobatan ini mungkin kurang efisien dalam jaringan otak dan karena itu
dalam pengobatan HAND [4]. Bahkan, kualitas hidup dari beberapa pasien HIV terus
berkurang oleh residual, bentuk ringan dari gangguan neurokognitif. Tat adalah
transaktivator virus HIV-1 promotor [5,6]. Ia mengikat komponen cyclin T1 dari
transkripsi positif faktor elongasi b, merekrut cyclin-dependent kinase 9 untuk
memanjangkan transkrip HIV dan menginduksi fosforilasi domain Cterminal RNA
polimerase II oleh Cdk9 [7]. Tat terutama aktif dalam nukleus dan disekresikan
di-tingkat tinggi in vitro [ 8]. Disekresikan Tat dapat menyebabkan cedera langsung
atau tidak langsung untuk neuron, sehingga Tat dapat berkontribusi untuk gangguan
neurologis diamati pada pasien HIV rejimen ART yang sukses. Neurotoksisitas dari
Tat melibatkan peningkatan berkepanjangan kalsium intraseluler [9] diikuti dengan
peningkatan spesies oksigen reaktif dan aktivasi jalur apoptosis [10]. Tat juga
mempromosikan aktivasi monosit, makrofag dan astrosit memicu pelepasan faktor
inflamasi, yang dapat menyebabkan kerusakan saraf [11]. Semua upaya yang
mengarah untuk menghambat neurodegeneration Tat-dimediasi baik in vitro dan
[12]. Selain itu, Tat menginduksi apoptosis pada sel manusia neuroblastoma [13],
dalam neuron janin manusia [14] dan dalam embrio neuron tikus hippocampal [12].
Namun, jumlah yang tepat dari Tat dilepaskan dari terinfeksi HIV sel-sel atau diambil
oleh sel-sel non-terinfeksi tetap tidak jelas. Dengan diperkenalkannya proteomik dan
pengembangan teknik ini terutama tinggi elektroforesis kinerja kapiler (HPCE)
pengukuran ini sekarang mungkin.
Dalam studi ini, kami menggunakan HPCE untuk menentukan jumlah Tat diambil
oleh sel-sel saraf yang dapat menyebabkan degenerasi saraf. Informasi ini mungkin
berharga untuk pengembangan agen terapeutik yang melindungi neuron SSP dari
faktor virus beracun sehingga mengurangi keparahan HAND.
metode
elektroforesis kapiler kinerja tinggi (HPCE)
HPCE memungkinkan untuk pemisahan molekul berdasarkan ukuran mereka,
struktur, biaya dan potensi hidrofobik. Untuk derivatisasi fluoresensi, 10 m l protein
Tat rekombinan atau sampel biologis, 10 m l buffer fosfat dan 0,5 m l dari 60 mM
4-Fluoro7-nitro-2, 1,3-benzoxadiazole (NBD-F) yang digunakan. Campuran
dipanaskan pada 55 u C selama 15 menit dalam gelap. Beckman P / ACEMDQ
elektroforesis kapiler instrumen (Fullerton, CA) dilengkapi dengan detektor
fluoresensi laser-induced digunakan untuk analisis kuantitatif protein Tat dalam
sampel biologis. Deteksi LIF dilakukan dalam leburan silika CE kolom dilapisi dari 50 m
m diameter dalam dan 60 cm dengan 50 cm dari inlet ke jendela deteksi (Polymicro
Technologies, Phoenix, AZ). injeksi diaplikasikan hidro dinamis pada tekanan 0,4 psi
selama 8 detik. Tegangan pemisahan adalah 25 kV. Data dikumpulkan dan diolah
menggunakan Beckman P / ACE 32 Karat software versi 7.0.

in vivo telah gagal. Telah menunjukkan bahwa pada konsentrasi serendah 1 nanomolar dan 2 kultur sel dan tes transfeksi
sampai 20 femtomolar, HIV-1 Tat dapat secara signifikan menginduksi apoptosis dari PC12 atau mikroglia manusia dan neuroblastoma (SH-SY5Y) baris sel [15,16] dan neuron
tikus degenerasi neuronal, masing-masing primer manusia (HN) [dibeli dari

PLoS ONE | www.plosone.org 1 Januari 2011 | Volume 6 | Edisi 1 | e16148


ScienCell Research Laboratories (Carlsbad, CA)] dipertahankan dalam DMEM +
10% FBS. sel konfluen SH-SY5Y re-berlapis di 1-5 6 10 5 sel / ml dan diinduksi untuk
membedakan dengan pengobatan dengan 10 m M asam retinoat (Sigma, St Louis,
MO) selama 7 d dengan media berubah setiap dua hari. Untuk semua percobaan,
sel-sel serum kelaparan selama 6 jam di hadapan 10 mM RA sebelum pengobatan
dengan rTat atau transfeksi setelah media yang segar lengkap ditambahkan.
Sel transfected dengan 0,1 m g LTR-luc reporter plasmid atau diobati dengan
meningkatnya jumlah rekombinan Tat protein (rTat), co-transfected dengan 0,25 m g
Tat ekspresi cDNA atau ditransduksi dengan Ad-nol atau Ad-Tat [10]. Sel-sel juga
transfected dengan 1.0 m g CMV- b- galaktosidase plasmid menggunakan
Nucleofector kit V (Amaxa). Jumlah DNA yang digunakan adalah dinormalisasi
dengan pcDNA 3 vektor plasmid. ekstrak sel disiapkan 48 jam setelah transfeksi dan
luciferase dan b- gal ditentukan. Semua nilai-nilai yang dinormalisasi terhadap b- nilai-nilai
gal diukur seperti yang dijelaskan sebelumnya [16].
Infeksi HIV-1
Manusia U-937 garis sel monositik [17] dipertahankan di RPMI + 10% FBS, 100
unit / ml penicillin, 50 m g / ml streptomisin-G. Sel-sel di fase log terinfeksi dengan
strain JR-FL dari HIV1 sebagai berikut [18]. Lima puluh nanogram saham virus p24
yang mengandung ditambahkan ke setiap 1 6 10 6 sel. Sel diinkubasi dengan saham
virus dalam volume kecil dari media bebas serum selama 2 jam pada 37 u C. Sel-sel
kemudian dicuci dua kali dengan PBS dan media segar yang mengandung 2% dari
FBS ditambahkan (500.000 sel / ml).
ELISA P24 dilakukan untuk supernatan kultur jaringan seperti yang dijelaskan
oleh produsen (Coulter-Immunotech, Wesbrook, ME). Setiap sampel diuji selama
rentang 10.000 kali lipat dari pengenceran, untuk memastikan kuantisasi, didasarkan
pada nilai OD dalam kisaran linear dari standar. Sel-sel saraf diobati (terinfeksi)
dengan supernatan dibuat dari sel HIV-1 yang terinfeksi (konsentrasi = 10 MOI)
selama 24 jam dan diproses seperti yang dijelaskan di bagian Hasil.
Sel Ekstrak Persiapan
sel SH-SY5Y dikultur dalam kondisi yang berbeda ( 6
rTat, atau 6 supernatan disiapkan dari sel yang terinfeksi HIV atau kontrol) setelah
sel-sel segaris di buffer lisis [10]. lysates protein diencerkan ke / volume yang
diperlukan tepat dan digunakan untuk pengujian HPCE.
tes kematian sel
sel SH-SY5Y yang mock-diobati atau diobati dengan 1 pg / ml rTat selama 24 jam.
Sel-sel kemudian dikumpulkan dan diinkubasi dengan
0,4% tripan pewarna biru (Invitrogen Life Technologies) selama 4 menit, sebelum mencuci
dengan PBS dan menghitung. Dicemarkan (layak) dan bernoda (mati) sel dihitung secara
terpisah menggunakan Hemasitometer.
Secara paralel, sel SH-SY5Y tidak diobati atau Tat-diobati juga berlapis, tetap dan
bernoda dengan mouse anti-mikrotubulus terkait protein-2 (MAP-2) atau anti-Tubulin
mAb (Sel Signal) diikuti oleh rabbit- Cy3-terkonjugasi anti-tikus sekunder Ab (Abcam).
Scion software Gambar digunakan untuk mengukur MAP-2 reaktivitas setelah
pengobatan Tat.
Neurites hasil Analysi
sel SH-SY5Y (mock-diobati atau diobati dengan 1 pg / ml rTat) ditanam pada
slide ruang selama 24 jam, tetap di 4%
paraformaldehyde, dicuci dan kemudian diwarnai selama 3 menit dalam tripan biru
metanol / asam asetat / larutan air 4%. Anti-tubulin antibodi juga digunakan. Sel-sel
yang diamati di berbagai
PLoS ONE | www.plosone.org
Pengukuran HIV-1 Tat Protein di Neuron
perbesaran melalui mikroskop fase kontras (konvolusi). Gambar yang diperoleh
pada sampel yang berbeda dianalisis untuk mengukur 3 parameter yang berbeda:
daerah sampel ditutupi oleh sel-sel, perpanjangan neurite ke sel rasio daerah, dan
berarti panjang neurite tunggal. analisis neurite tunggal dan jumlah dilakukan pada
bidang
0,30 mm 2 untuk mendapatkan ukuran yang lebih akurat dari panjang neurite.
Percobaan dilakukan dalam rangkap tiga.
Analisis statistik dinilai oleh 1-way ANOVA dalam kelompok (waktu yang sama
dari kultur sel, medium kultur yang sama), diikuti oleh posttest Tukey menggunakan
GraphPad Prism versi 4.00 untuk Windows, GraphPad Software (San Diego CA,
USA) untuk mengevaluasi panjang neurite. Dua arah ANOVA digunakan untuk
perbandingan antara kelompok, diikuti oleh Bonferroni post-test. Perbedaan
dianggap signifikan secara statistik untuk p, 0.05.
2DE berbasis Differential Proteomika Teknologi
U-937 sel terinfeksi dengan HIV-1 dan supernatan ditambahkan ke sel-sel saraf.
Protein dari puncak Tat-terdeteksi dikumpulkan dan dipisahkan oleh 2DE gel melalui
dua strip IPG (pH Tat adalah 6.12) diikuti oleh Sypro-Ruby pewarnaan fluoresensi.
bintik-bintik berikutnya, Ingel Trypsin Pencernaan-diferensial dinyatakan telah
dipotong dan destaining dari potongan-potongan gel yang dieksisi dilakukan.
bintik-bintik yang terdeteksi dianalisis dengan MALDI-TOF. Pencocokan nilai massa
dikalibrasi peptida dalam database protein NCBInr diidentifikasi Tat protein.
Hasil dan Diskusi
Beberapa laporan menunjukkan adanya protein HIV-1 Tat dalam neuron manusia in
vitro dan in vivo [ 18] Namun, jumlah yang tepat dari Tat dilepaskan dari sel yang
terinfeksi HIV dan tunduk pada serapan neuronal masih belum jelas. Kita sekarang
telah membahas pertanyaan ini dengan menggunakan elektroforesis kapiler kinerja
tinggi (HPCE). Pertama, kami mengukur jumlah Tat dilepaskan dari garis manusia
monocytic sel, U937, terinfeksi JR-FL strain HIV-1 dan diambil oleh garis sel saraf,
SH-SY5Y. Secara singkat, HIV-1 ditambahkan ke 1 6 10 6 sel U937 selama 10 hari [19].
Pada hari 10 postinfection, supernatan dari sel U937 dikumpulkan dan ultracentrifuged
untuk menghapus virus, sementara meninggalkan Tat dan protein virus lainnya
disekresikan. Tiga ml (10 MOI) dari supernatan ini telah ditambahkan ke sel SH-SY5Y.
Setelah 24 jam, supernatan dan lysates sel yang dikumpulkan dari HIV-1 yang
terinfeksi U937 atau non-terinfeksi SH-SY5Y, masing-masing, diproses untuk
mendeteksi Tat oleh HPCE [20].
Untuk pertama membangun kurva standar untuk kalibrasi, solusi yang
mengandung protein Tat rekombinan (101aa) (rTat) ( yang sangat murni toxinfree Tat
dibeli dari Immuno Diagnostics, Inc .; Woburn, MA), disiapkan pada konsentrasi mulai
2 sampai 50 pg dan berkonsentrasi di 10 m l. Seperti ditunjukkan pada Gambar. 1A
(biru), sekitar 2 pg mewakili batas deteksi assay untuk Tat. Berikutnya, jumlah Tat
diukur dalam supernatan dari sel U937 yang terinfeksi (Gambar. 1B, red) dan
ditemukan sekitar 2 kali lipat lebih besar dari rTat pada 2 pg di kurva standar (biru).
Untuk menentukan konsentrasi perkiraan Tat dalam sel U937, 4 pg dari rTat
ditambahkan ke supernatan terinfeksi U937 (hijau). Tat juga terdeteksi dalam ekstrak
saraf dari neuron terkena supernatan dari terinfeksi HIV U937 sel (Gambar. 1B,
panel C, red). Untuk menghitung jumlah Tat di lysates, ekstrak non-terinfeksi
dibubuhi dengan 1 pg dari rTat (Gambar. 1C, hijau). Jumlah Tat terdeteksi di
SH-SY5Y sel saraf sekitar 2 pg / ml (Gambar. 1C, red) dibandingkan dengan lysates
berduri (Gambar. 1C, hijau). Sebagai kontrol negatif, protein dari sel SHSY5Y
non-terinfeksi digunakan (Gambar. 1C, hitam). Serapan Tat juga diukur
menggunakan sel SH-SY5Y terkena 2 pg dari rTat selama 24 jam (Gambar. 1C,
biru) setelah protein sel disiapkan. merenda
2 Januari 2011 | Volume 6 | Edisi 1 | e16148

Gambar 1. Kinerja tinggi analisis elektroforesis kapiler protein Tat. SEBUAH. Electropherograms menunjukkan konsentrasi yang berbeda dari rTat untuk menguji sensitivitas pengujian tersebut. B, C. electropherograms
perwakilan membandingkan jumlah Tat dalam supernatan dari sel yang terinfeksi atau dari lysates dari sel-sel saraf SH-SY5Y tidak terinfeksi yang supernatan ditambahkan. doi: 10.1371 /
journal.pone.0016148.g001
dilepaskan dari sel yang terinfeksi harus sama dengan 3 sampai 4 pg berdasarkan
kesimpulan bahwa setidaknya 50% dari Tat dirilis diambil oleh sel-sel neuron [8].
Kesimpulan ini berkorelasi dengan hasil yang diperoleh dan ditampilkan dalam panel
B (merah). Perhatikan bahwa alasan untuk memilih sel SH-SY5Y adalah bahwa
mereka cermin jalur yang terlibat dalam proses neurodegenerative terkait dengan
Sarang lebah [21]. Perlu ditambahkan bahwa perbedaan waktu diamati pada
Gambar. 1 adalah karena sifat dari sampel yang dianalisis, di mana dalam sampel 1,
rTat adalah satu-satunya komponen yang akan dianalisis sementara di panel lainnya
Tat dikeluarkan baik dari supernatan dari sel yang terinfeksi atau dari ekstrak sel
setelah menambahkan terinfeksi / supernatan terisolasi. Dengan demikian,
kehadiran protein lain menunda rilis Tat dan adanya puncak tambahan (misalnya
Gambar. 1B).
Hasil yang sama diperoleh ketika menggunakan budaya manusia utama neuron.
Secara singkat, sel-sel yang tidak diobati (kontrol), rTat-diperlakukan (2 pg / ml) atau
diobati dengan supernatan dibuat dari sel yang terinfeksi HIV diolah dan jumlah Tat di
sel-sel ini diukur. Data yang ditunjukkan pada Gambar 2 dikonfirmasi hasil yang
disajikan pada Gambar 1 dan menunjukkan bahwa Tat terdeteksi pada sel
diperlakukan dan tidak di kontrol. Hasil yang sama diperoleh ketika menggunakan CSF
dari HIV-1 negatif, dan HIV-1 pasien positif (data tidak ditampilkan).
Dalam rangka untuk mengkonfirmasi kehadiran Tat dalam sel, neuron primer
manusia diobati dengan supernatan dari sel yang terinfeksi HIV, menggunakan
berbasis 2DE Differential Proteomika Teknologi. protein tat diidentifikasi dengan
mencocokkan nilai-nilai dikalibrasi peptida massa dalam database protein NCBInr dan
peptida urutan tat LEPWKHPGSQPK diidentifikasi oleh spektrum MS / MS,
mengkonfirmasikan kehadiran protein Tat dalam ekstrak disiapkan dari yang tidak
terinfeksi neuron primer manusia diperlakukan dengan supernatan dari sel yang
terinfeksi HIV. Untuk memvalidasi data kami, kami melakukan analisis Western blot
menggunakan anti-Tat antibodi, namun, kami tidak dapat mendeteksi Tat protein
karena jumlah yang kecil (data tidak ditunjukkan, ref. 10).
Karena kita telah mendeteksi Tat dalam ekstrak neuronal, kami selanjutnya
memeriksa fungsionalitas menggunakan transfeksi dari HIV-1 LTR reporter plasmid
oleh nucleofection. Teknologi Nucleofector memungkinkan ekspresi gen untuk memulai
segera, independen dari sel
PLoS ONE | www.plosone.org
Pengukuran HIV-1 Tat Protein di Neuron
divisi. Dengan demikian sel-sel nucleofected dapat dianalisis setelah waktu inkubasi
yang sangat singkat. mikroglia manusia dan sel-sel saraf yang transfected dengan 0,5
m g HIV-1 reporter plasmid LTR-luc. 1 m g CMV- b- gal juga disertakan. Setelah 24 jam,
rTat ditambahkan (1 m g, 1 ng, atau 1 pg / ml) diikuti oleh assay luciferase. rTat up
mengatur HIV-1 promotor di kedua baris sel (Gambar. 2B, membandingkan kolom
2-4 untuk 1 dan 6-8 untuk 5). Fungsi rTat juga ditentukan di garis sel saraf SH-SY5Y
stabil transfected dan mengekspresikan LTR-luc-Ires-GFP, yang berisi 2 gen
reporter, luciferase dan protein fluorescent hijau (GFP) yang dipisahkan oleh sebuah
situs entri ribosom internal yang (Ires ). sel SH-SY5Y transfected dengan 0,5 m g Tat
ekspresi plasmid (Gambar. 2C, jalur 2), atau terinfeksi dengan 1 MOI Ad-null (jalur 3)
atau Ad-Tat (jalur 4). Sel juga diobati dengan 1 pg / ml rTat (jalur 5) atau dengan
supernatan dari sel U937 yang terinfeksi dengan JR-FL strain HIV-1 (jalur 6).
Luciferase assay menunjukkan bahwa Tat mengaktifkan HIV-1 promotor dalam sel
saraf dibandingkan dengan mock (Gbr. 2C, jalur 1) atau Ad-null (jalur
3). Aktivasi LTR oleh Tat berkisar dari 2 kali lipat dengan rTat (jalur 5) sampai 13 kali
lipat dengan supernatan dari sel yang terinfeksi (jalur 6). Data ini menunjukkan
fungsi rTat, yaitu, 1 pg / ml protein rTat mengaktifkan HIV-1 promotor. hasil kami
berkorelasi dengan laporan sebelumnya aktivasi Tat HIV-1 LTR dalam sel neuron
[22].
Berikutnya, kami memeriksa apakah Tat mempengaruhi neurites retraksi, kami
diperlakukan sel SH-SY5Y dengan rTat (1 pg / ml) selama 24 jam dalam rangkap dua di
mana satu set digunakan untuk menentukan neurites pencabutan sementara set lain
digunakan untuk menentukan dampak Tat pada mikrotubulus. Menggunakan anti-tubulin
dan DAPI pewarnaan untuk mendeteksi neurites dan inti sel, masing-masing, kita
mengamati bahwa pengobatan neuron dengan Tat mengakibatkan neurites retraksi relatif
terhadap sel-sel yang tidak diobati (Gambar. 3A). Temuan ini setuju dengan laporan
sebelumnya di mana 2-20 femtomoles protein Tat yang terbukti neurotoksik [8,23]. Yang
penting, studi kami menunjukkan konsentrasi yang lebih tinggi dari Tat dalam neuron
berasal dari supernatan dari sel yang terinfeksi.
Untuk mempelajari efek dari Tat pada neurites SH-SY5Y, kami menggunakan
timelapse mikroskop. Dinamika respon dievaluasi dengan mengukur neurites retraksi
jarak. Hal ini dibandingkan dengan panjang awal dari neurite diperpanjang, yang
bervariasi antara 4 dan 25 m m. Gambar neurites ditarik menunjukkan bahwa sebagian
besar dari mereka
3 Januari 2011 | Volume 6 | Edisi 1 | e16148
 Pengukuran HIV-1 Tat Protein di Neuron

Gambar 2. Pengukuran Tat di neuron primer manusia (HN) dan kemampuan rTat untuk mengaktifkan HIV-1 ekspresi gen. SEBUAH. electropherograms perwakilan membandingkan jumlah Tat dalam
supernatan dari sel yang terinfeksi (merah) atau dari ekstrak dari yang tidak terinfeksi (hitam) sel HN yang supernatan ditambahkan. Sebagai kontrol, ekstrak juga dibuat dari sel rTat-diperlakukan
(biru). B. Manusia mikroglia dan SH-SY5Y sel transfected dengan 0,5 m g LTR-Luc sendiri dan diperlakukan dengan konsentrasi yang berbeda rTat. C. sel SH-SY5Y mengekspresikan LTR-luc-Ires-GFP
transfected dengan ekspresi Tat plasmid, terinfeksi Ad-nol atau Ad-Tat, atau diobati dengan rTat (1 pg / ml) atau supernatan dari sel yang terinfeksi. ekstrak sel disiapkan 24 h (mikroglia) atau 48 jam
(SH-SY5Y) setelah transfeksi dan luciferase dan b- gal ditentukan. Semua nilai-nilai yang dinormalisasi terhadap

b- gal dan mewakili berarti minimal 3 percobaan. doi: 10.1371 /

journal.pone.0016148.g002

ditandai dengan bola pencabutan dan trailing sisa tipis (panel A, panah). Untuk
menentukan perjalanan waktu neurites retraksi, kami mengukur panjang neurite
lebih dari 10 menit setelah aplikasi rTat. Antara 1 dan 2 menit setelah terpapar 1 pg /
ml rTat, neurites telah ditarik sebesar 10,3% dan 19,7%, masing-masing [berarti
(SD)], p, 0,01 dibandingkan dengan neurites tidak diobati yang menunjukkan hampir
tidak ada perubahan panjang. Neurites terus menarik
dari waktu ke waktu sehingga pada 10 menit pasca-Tat aplikasi neurites pencabutan
hampir 52,1%.
Atau, kami berusaha untuk lebih meneliti dampak pengobatan Tat pada mikrotubulus
menggunakan set kedua sel diperlakukan dengan 1 pg / ml protein rTat menyebabkan
pengurangan ditandai (75%) dalam mikrotubulus terkait protein 2 (MAP-2) reaktivitas
(Gambar. 3B), dibandingkan dengan sel yang tidak diobati (bandingkan jalur 1 dan 2).
Perhatikan bahwa

PLoS ONE | www.plosone.org 4 Januari 2011 | Volume 6 | Edisi 1 | e16148

 Pengukuran HIV-1 Tat Protein di Neuron

Gambar 3. rTat menyebabkan retraksi dendritik di SH-SY5Y. SEBUAH. Fase kontras mikroskop sel SH-SY5Y baik tidak diobati atau diobati dengan rTat seperti yang ditunjukkan. Sel-sel diwarnai
dengan DAPI (biru) dan anti-tubulin (merah) untuk menandai inti dan proses, masing-masing. B. Tat-diinduksi neurites pencabutan adalah tergantung waktu. kultur sel yang terkena 1 pg / ml rTat dan
dinilai lebih dari 10 menit. Nilai-nilai yang dinyatakan sebagai persentase neurites retraksi. P, 0.01 vs control (diobati) (ANOVA, dilanjutkan dengan uji Bonferroni). Nilai mewakili mean (SD), (n = 15). C. Kuantifikasi
MAP-2 immunoreactivity mengungkapkan ditandai pengurangan (75%) dalam sel SH-SY5Y rTat-diobati. D. Pengaruh rTat-pengobatan terhadap SH-SY5Y kematian neuronal yang dinilai dengan
pengecualian tripan biru.

doi: 10.1371 / journal.pone.0016148.g003

MAP-2 adalah protein yang dimiliki keluarga protein mikrotubulus terkait dan berfungsi
untuk menstabilkan mikrotubulus pertumbuhan (MT) [24]. Hasil ini melengkapi dan
mengkonfirmasi data yang diamati dalam panel A dengan anti-tubulin mengenai
perubahan mikrotubulus.
Akhirnya, kami menyelidiki apakah penambahan Tat menyebabkan kematian sel. Untuk
itu, sel-sel SH-SY5Y diobati dengan 1 pg / ml rTat selama 24 jam setelah sel-sel diwarnai
dengan tripan biru dan kematian sel dinilai. Secara singkat, lima wilayah sel yang digunakan
(masing-masing berisi
. 100 sel) untuk menghitung jumlah sel-sel mati. Menariknya, ada peningkatan sekitar 4 kali lipat
dalam kematian sel yang diukur dengan pengecualian tripan biru di neuron Tat-diperlakukan bila
dibandingkan dengan sel-sel yang tidak diobati (Gambar. 3C, membandingkan jalur 1 dan 2) [25].
Hasilnya cukup signifikan menggunakan analisis statistik seperti yang dijelaskan di bagian Metode.
Singkatnya, degenerasi neuron tetap menjadi masalah utama yang terkait
dengan HIV-1 infeksi SSP bahkan dengan sukses
ART. Dalam hal ini, beberapa faktor, termasuk protein virus Tat, yang terlibat dalam
pengembangan cedera neuronal, namun jumlah pasti yang beredar Tat protein masih
belum jelas. Despites beberapa upaya yang bertujuan untuk mengukur jumlah yang
beredar Tat dalam sel, di sera manusia serta dalam CSF [8,26,27], kadar beredar Tat
protein masih belum jelas. Berikut menggunakan elektroforesis kapiler, kami
memberikan bukti untuk menunjukkan untuk pertama kalinya keberadaan dan jumlah
protein virus Tat dalam neuron. Secara bersama-sama, data kami menunjukkan bahwa
dirilis protein Tat dapat diambil oleh sel-sel saraf dan menyebabkan deregulasi
neuronal melalui jalur yang masih harus diidentifikasi. Dalam hal ini, kami baru-baru ini
menunjukkan bahwa Tat menyebabkan deregulasi neuronal dengan meningkatkan
kadar kalsium disekresi, mitokondria deregulasi dan transportasi perubahan aksonal
(naskah dalam persiapan). Selanjutnya, data kami disajikan dalam Gambar 3
menunjukkan bahwa Tat mempengaruhi

PLoS ONE | www.plosone.org 5 Januari 2011 | Volume 6 | Edisi 1 | e16148


tingkat dan akhirnya fungsi MAP2, yang pada gilirannya dapat menyebabkan
perubahan transportasi aksonal dan komunikasi (Gambar. 3A dan B). Oleh karena itu,
metode baru yang dikembangkan dalam penelitian ini jelas menunjukkan keterbatasan
teknik sebelumnya digunakan untuk mengukur Tat dalam sel saraf. Ini juga akan
membantu dalam menentukan jumlah protein virus lain dalam sel yang terinfeksi.
identifikasi lebih lanjut dan pengukuran Tat dalam sel yang tidak terinfeksi juga dapat
membantu dalam memperkirakan jumlah antibodi yang harus digunakan untuk
menetralisir efek dari Tat, yang bisa mengarah pada pengembangan terapi yang lebih
efisien.
Referensi
1. Kaul M, Lipton SA (2006) Mekanisme neuroimmunity dan neurodegeneration terkait dengan infeksi HIV-1
dan AIDS. Neuroimmune Pharmacol 1: 138-151.
2. Kaul M (2008) pemogokan HIV ganda di otak: toksisitas neuronal dan dikompromikan neurogenesis. Depan
Biosci 13: 2484-2494.
3. Gendelman HE, Persidsky Y, Ghorpade A, Limoges J, Stins M, et al. (1997) The neuropathogenesis
kompleks demensia AIDS. AIDS 11: S35-45.
4. Skinner S, Adewale A, DeBlock L, Gill M, Tenaga C (2009) alat skrining neurokognitif di HIV / AIDS: kinerja
komparatif antara pasien terkena ART. HIV Med 10: 246-252.
5. Baba M (2004) Inhibitor HIV-1 ekspresi gen dan transkripsi. Curr Top Med Chem 4 (9): 871-82.
6. Bieniasz PD, Grdina TA, Bogerd HP, Cullen BR (1998) Rekrutmen dari kompleks protein yang mengandung
Tat dan cyclin T1 untuk TAR mengatur kekhususan spesies HIV-1 Tat. EMBO J 17: 7056-7065.
7. Amini S, Mameli G, Del Valle L, Skowronska A, Reiss K, et al. (2005) p73 Berinteraksi dengan manusia tipe
immunodeficiency virus 1 Tat dalam sel astrocytic dan mencegah asetilasi pada lisin 28. Mol Sel Biol 25:
8126-8138.
8. Ma M, Nath A (1997) faktor-faktor penentu Molekuler untuk ambilan Tat protein dari human
immunodeficiency virus tipe 1 di sel-sel otak. J Virol 71: 2495-2499.
9. Brailoiu E, Brailoiu GC, Mameli G, Dolei A, Sawaya BE, et al. (2006) paparan akut untuk etanol
mempotensiasi human immunodeficiency virus tipe 1 Tatinduced Ca 2+ kelebihan dan kematian neuronal di
berbudaya tikus neuron kortikal. J Neurovirol 12: 17-24.
10. Mukerjee R, Deshmane SL, Fan S, Del Valle L, White MK, et al. (2008) Keterlibatan p53 dan p73 transkripsi
faktor di neuroAIDS. Siklus Sel 7: 2682-2690.
11. Eugenin EA, Dyer G, Calderon TM, Berman JW (2005) HIV-1 protein tat menginduksi fenotipe bermigrasi di
mikroglia janin manusia oleh CCL2 (MCP-1) tergantung mekanisme: Peran mungkin dalam neuroAIDS.
Glia 49: 501-510.
12. Ramirez SH, Sanchez JF, Dimitri CA, Gelbard HA, Dewhurst S, et al. (2001) Neurotrophins mencegah HIV
Tat-induced apoptosis neuron melalui mekanisme faktor-kappaB tergantung nuklir. J Neurochem 78:
874-889.
13. New DR, Ma M, Epstein LG, Nath A, Gelbard HA (1997) Manusia immunodeficiency virus tipe 1 Tat protein
menginduksi kematian oleh apoptosis dalam budaya neuron primer manusia. J Neurovirol 3: 168-173.
14. Kruman II, Nath A, Mattson MP (1998) HIV-1 protein Tat menginduksi apoptosis neuron hippocampus
dengan mekanisme yang melibatkan aktivasi caspase, kalsium yang berlebihan, dan stres oksidatif. Exp
Neurol 154: 276-288.
PLoS ONE | www.plosone.org
Pengukuran HIV-1 Tat Protein di Neuron
Ucapan Terima Kasih
Para penulis ingin mengucapkan terima kasih Tim Fasilitas Proteomika untuk layanan yang disediakan
dan bantuan dalam analisis data. Kami juga ingin mengucapkan terima kasih Dr Kamel Khalili, ketua
Neuroscience Departemen untuk menyediakan lingkungan kerja yang sangat baik.
penulis Kontribusi
Disusun dan dirancang percobaan: BES. Melakukan percobaan: SLD RM SF. Menganalisis data:
BES. Kontribusi reagen / bahan / alat analisis: SLD RM SF. Menulis kertas: BES.
15. Deshmane SL, Mukerjee R, Fan S, Del Valle L, Michiels C, et al. (2009) Aktivasi jalur stres oksidatif oleh
HIV-1 Vpr menyebabkan induksi ekspresi faktor 1 alpha hipoksia-diinduksi. J Biol Chem 284:
11.364-11.373.
16. Edlund T, Walker MD, Barr PJ, Rutter WJ (1985) ekspresi Sel khusus dari gen insulin tikus: bukti peran dua
yang berbeda 5 9 elemen mengapit. Ilmu 230: 912-916.
17. Rom I, Deshmane SL, Mukerjee R, Khalili K, Amini S, et al. (2009) HIV-1 Vpr deregulates sekresi kalsium
dalam sel saraf. Otak Res 1275: 81-86.
18. Aprea S, Del Valle L, Mameli G, Sawaya BE, Khalili K, et al. (2006) Tubulinmediated pengikatan human
immunodeficiency virus-1 Tat ke sitoskeleton menyebabkan degradasi proteasomal tergantung dari
mikrotubulus terkait protein 2 dan kerusakan saraf. J Neurosci 26: 4054-4062.
19. Sawaya BE, Khalili K, Gordon J, Taube R, Amini S (2000) interaksi Koperasi antara HIV-1 protein regulasi
Tat dan Vpr memodulasi transkripsi genom virus. J Biol Chem 275: 35.209-35.214.
20. Shivji M, Burger S, Moncada CA, Clarkson AB, Jr., Merali S (2005) Pengaruh nikotin pada paru
S-adenosylmethionine dan pengembangan pneumonia Pneumocystis. J Biol Chem 280: 15.219-15.228.
21. Everall IP, Bell C, Mallory M, Langford D, Adame A, et al. (2002) Lithium ameliorates neurotoksisitas
HIV-gp120-dimediasi. Mol Sel Neurosci 21: 493-501.
22. Kolson DL, Collman R, Hrin R, Balliet JW, Laughlin M, et al. (1994) Manusia immunodeficiency virus tipe 1
kegiatan Tat dalam sel saraf manusia: penyerapan dan trans-aktivasi. J Gen Virol 75: 1927-1934.
23. Cheng J, Nath A, Knudsen B, Hochman S, Geiger JD, et al. (1998) sifat rangsang neuron dari human
immunodeficiency virus tipe 1 Tat protein. Neuroscience 82: 97-106.
24. Lim RW, Halpain S (2000) Diatur asosiasi mikrotubulus terkait protein 2 (MAP2) dengan Src dan Grb2: bukti
MAP2 sebagai protein perancah. J Biol Chem 275: 20.578-20.587.
25. Noorbakhsh F, Vergnolle N, McArthur JC, Silva C, Vodjgani M, et al. (2005) Proteinase-activated receptor-2
induksi dengan peradangan saraf mencegah kematian neuronal selama infeksi HIV. J Immunol 174:
7320-7329.
26. Westendorp MO, Frank R, Ochsenbauer C, Stricker K, Dhein J, et al. (1995) Sensitisasi sel T untuk
apoptosis CD95-dimediasi oleh HIV-1 Tat dan gp120. Nature 375: 497-500.
27. Xiao H, Neuveut C, Tiffany HL, Benkirane M, Kaya EA, et al. (2000) Selektif CXCR4 antagonisme oleh Tat:
implikasi untuk ekspansi in vivo penggunaan coreceptor HIV-1. Proc Natl Acad Sci USA 97:
11.466-11.471.
6 Januari 2011 | Volume 6 | Edisi 1 | e16148