V.

9 Pengujian Aktivitas Antimikroba

V.9.1 Sterilisasi Alat
Sterilisasi dilakukan dengan cara yang sesuai terhadap masing-masing alat. Alat-alat yang
akan disterilkan harus dalam keadaan bersih dan kering. Tabung reaksi, gelas ukur, vial,
Erlenmeyer (ditutup dengan alumunium voil) dan cawan petri disterilkan dalam autoklaf pada
suhu 121oC selama 15 menit. Pinset, jarum ose disterilkan dengan cara dipijarkan pada nyala
api bunsen.

V.9.2 Sterilisasi Bahan

Untuk pengujian aktivitas antimikroba diperoleh sterilisasi bahan yaitu mensterilkan nutrient
agar, mueller hilton broth dan Potatos Dextrose Agar dalam autoklaf dengan suhu 121oC
selama 15 menit.

V.9.3 Penyiapan Media Pembenihan

Media penyiapan pembenihan yang digunakan adalah nutrient agar dan mueller hilton broth.
a. Nutrient Agar
Sebanyak 28 gram nutrient agar dilarutkan dalam 1 liter air suling, didihkan dan aduk hingga
terbentuk larutan berwarna kekuningan dan jernih. Kemudian disterilkan dalam autoklaf pada
suhu 121oC selama 15 menit.

b. Mueller Hilton Broth

Sebanyak 21 gram mueller hilton broth dilarutkan dalam 1 liter air suling, didihkan dan aduk
hingga terbentuk larutan berwarna kekuningan dan jernih. Kemudian disterilkan dalam
autoklaf pada suhu 121oC selama 15 menit.

c. Potatos Dextrose Agar

Sebanyak 28 gram Potatos Dextrose Agar dilarutkan dalam 1 liter air suling, didihkan dan
aduk hingga terbentuk larutan berwarna kekuningan dan jernih. Kemudian disterilkan dalam
autoklaf pada suhu 121oC selama 15 menit.

V.9.5 Penyediaan Mikroba

Mikroba ditanamkan diatas agar miring nutrient agar dalam tabung reaksi steril kemudian
diinkubasi selama 18-24 jam dengan suhu 37oC untuk bakteri, sedangkan jamur ditanamkan
diatas agar miring Potatos Dextrose Agar dalam tabung reaksi steril kemudian diinkubasi
selama 24-48 jam dengan suhu ruangan 25 oC.

V.9.6 Pembuatan Suspensi Mikroba Uji

Mikroba uji yang telah diremajakan pada nutrient agar miring dan Potatos Dextrose Agar
miring diambil 1 ose dan dimasukkan kedalam tabung yang berisi 5 ml mueller hilton broth.
Kemudian divortex dan diinkubasi selama 18 jam untuk bakteri dan 24 jam untuk jamur.
Diencerkan hingga diperoleh suspensi 108 CFU/ml. Ini dibandingkan dengan pembanding
larutan standar Mc. Farland yang setara dengan 108 CFU/ml. Suspensi ini yang akan
digunakan dalam pengujian.
V.9.7 Pengujian Antimikroba Metode Cakram Kertas
Cakram kertas dicelupkan ke dalam larutan sampel sampai merata diseluruh permukaan
cakram dengan berbagai macam konsentrasi yang telah disiapkan. Penuangan media nutrient
agar (NA) yang telah disterilkan ke dalam cawan petri. Media nutrient agar (NA) yang telah
dingin dan memadat selanjutnya ditanami mikroba uji. Mikroba yang ditanam diratakan
hingga seluruh permukaan nutrient agar (NA) dengan menggunakan spreader. Kemudian
cakram tersebut diletakkan dalam media nutrient agar (NA). Langkah selanjutnya dilakukan
dengan menginkubasi mikroba uji. Untuk bakteri pada suhu 37oC selama 18-24 jam dan
jamur pada suhu 25oC selama 24-48 jam. Aktivitas antimikroba terbesar ditunjukkan oleh
luas diameter daerah bening terbesar yang terbentuk dari konsentrasi tersebut. Nilai diameter
daerah hambat (DDH) dari sampel tersebut diukur dengan penggaris atau jangka sorong
(Mulyadi, 2013 dalam Ginting, 2014).