Deteksi Mutasi Gen Embb Pada MDR-TB

SKRIPSI
DETEKSI MUTASI GEN embB DARI ISOLAT KLINIS

MULTIDRUG RESISTANT TUBERCULOSIS (MDR-TB)
DI LABORATORIUM MIKROBIOLOGI FAKULTAS
KEDOKTERAN UNIVERSITAS UDAYANA
ALIF ROCHMAH IZZATUL AZKA
PROGRAM STUDI SARJANA KEDOKTERAN DAN PROFESI
DOKTER
FAKULTAS KEDOKTERAN
UNIVERSITAS UDAYANA
DENPASAR
2018
SKRIPSI

ALIF ROCHMAH IZZATUL AZKA
1502005057
PROGRAM STUDI SARJANA KEDOKTERAN DAN PROFESI
DOKTER
FAKULTAS KEDOKTERAN
UNIVERSITAS UDAYANA
DENPASAR
2018
i
Lembar Persetujuan Pembimbing
SKRIPSI INI TELAH DISETUJUI

PADA TANGGAL 29 NOVEMBER 2018
Pembimbing I Pembimbing II
Dr. dr. Komang Januartha dr. Made Agus

Putra Pinatih, M.Kes Hendrayana, M.Ked
NIP. 196701221996011001 NIP. 197807172006041004
Mengetahui,
Koordinator Program Studi Pendidikan Dokter
Fakultas Kedokteran Universitas Udayana,
Dr. dr. Komang Januartha Putra Pinatih, M.Kes

NIP. 196701221996011001
ii
Halaman Penetapan Panitia Penguji Skripsi
Skripsi ini telah diuji pada dan dinilai oleh panitia penguji pada
Program Studi Sarjana Kedokteran dan Profesi Dokter Fakultas Kedokteran
Universitas Udayana
Tanggal ……………………
Panitia Penguji Skripsi adalah:
Ketua dr. Ni Nengah Dwi Fatmawati, S.Ked, Sp.MK, Ph.D
Anggota:
1. Dr. dr. Komang Januartha Putra Pinatih, M.Kes
2. dr. Made Agus Hendrayana, M.Ked
iii
KATA PENGANTAR
Puji syukur penulis panjatkan kehadapan Tuhan Yang Maha Esa karena atas berkat
rahmat dan anugerah-Nya penulis dapat menyelesaikan skripsi di semester VII
Program Studi Sarjana Kedokteran dan Profesi Dokter Fakultas Kedokteran
Universitas Udayana ini yang berjudul “Deteksi Mutasi Gen embB Dari Isolat
Klinis Multidrug Resistant Tuberculosis (MDR-TB) di Laboratorium
Mikrobiologi Fakultas Kedokteran Universitas Udayana”.
Pada kesempatan ini, perkenankan penulis menyampaikan terima kasih kepada:
1. Dr. dr. Komang Januartha Putra Pinatih, M.Kes serta dr. Made Agus
Hendrayana, M.Ked selaku pembimbing I dan pembimbing II saya yang
telah memberikan dorongan, semangat, bimbingan, dan saran
menyelesaikan skripsi ini.
2. dr. Ni Nengah Dwi Fatmawati, S.Ked, Sp.MK, Ph.D selaku penguji yang
telah memberikan masukan, saran, sanggahan, dan koreksi sehingga skripsi
ini dapat terwujud seperti ini.
3. Keluarga dan teman-teman penulis yang selalu membantu dan mendukung
dalam setiap kekurangan skripsi ini.
4. Semua pihak yang ikut membantu kelancaran penyusunan skripsi ini.
Semoga Tuhan Yang Maha Esa selalu melimpahkan rahmat-Nya kepada semua
pihak yang telah membantu pelaksanaan dan penyelesaian skripsi ini, serta kepada
penulis sekeluarga.
Denpasar, November 2018
Penulis
iv
PERNYATAAN KEASLIAN KARYA TULIS SKRIPSI
Dengan ini saya menyatakan bahwa dalam skripsi ini tidak terdapat karya tulis yang
pernah diajukan untuk memperoleh gelar kesarjanaan di suatu perguruan tinggi, dan
sepanjang pengetahuan saya tidak terdapat karya atau pendapat yang pernah ditulis
atau diterbitkan oleh orang lain, kecuali yang secara tertulis diacu dalam naskah ini
dan disebutkan dalam daftar pustaka.
Apabila kemudian hari terbukti bahwa saya melakukan tindakan menyalin atau
meniru tulisan orang sebagai hasil pemikiran saya sendiri, maka gelar dan ijazah
yang telah diberikan oleh universitas batal saya terima.
Denpasar, 29 November 2018

Yang menyatakan
Alif Rochmah Izzatul Azka

NIM. 1502005057
v
ABSTRAK

MULTIDRUG RESISTANT TUBERCULOSIS (MDR-TB) DI
LABORATORIUM MIKROBIOLOGI FAKULTAS
Tuberkulosis (TB) merupakan penyakit menular yang hingga saat ini masih
menjadi perhatian dunia, khususnya seiring dengan meningkatnya angka MDR-
TB. MDR-TB dapat terjadi karena beberapa faktor, salah satunya yaitu karena
adanya suatu mutasi gen yang berperan dalam interaksi Obat Anti Tuberkulosis
(OAT) dengan targetnya pada M. Tuberculosis. Penelitian ini bertujuan untuk
mengetahui adanya mutasi pada gen embB dari isolat MDR-TB dengan
menggunakan M. tuberculosis strain H37Rv sebagai acuan. Metode yang
digunakan yaitu dengan menggunakan PCR, sekuensing, dan analisa data dengan
program Mega6 dan BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) dari NCBI
(National Centre of Biotechnology Information). Hasil penelitian menunjukkan
bahwa satu dari 5 sampel yang positif memiliki gen embB dilakukan sekuensing
dan didapatkan hasil adanya substitusi basa nukleotida dari A → G pada posisi
nukleotida 916 dan menyebabkan terjadinya perubahan asam amino Met306Val
setelah dibandingkan dengan sekuens embB dari M. tuberculosis strain H37Rv
yang didapat dari data genebank.
Kata kunci: Tuberkulosis, M. tuberculosis, ethambutol, embB, mutasi
vi
ABSTRACT
DETECTION OF embB GENE MUTATION FROM CLINICAL

ISOLATES OF MULTIDRUG RESISTANT TUBERCULOSIS
(MDR-TB) IN THE LABORATORY OF MICROBIOLOGY
FACULTY OF MEDICINE UDAYANA UNIVERSITY
Tuberculosis (TB) is an infectious disease that is still a concern of the world,

especially as the MDR-TB numbers increase. MDR-TB can occur due to several
factors, one of which is due to a gene mutation that plays a role in the interaction
of Anti-Tuberculosis drugs with the target in M. tuberculosis. This study aims to
determine the presence of mutations in the embB gene from MDR-TB isolates
using M. tuberculosis strain H37Rv as a reference. The method used is by using
PCR, sequencing, and data analysis with the Mega6 and BLAST (Basic Local
Alignment Search Tool) program from NCBI (National Center of Biotechnology
Information). The results showed that one of the 5 positive samples that had the
embB gene was sequenced and obtained the results of nucleotide base
substitution from A → G at 916 nucleotide position and caused a change in amino
acid Met306Val after being compared with the embB sequence of M. tuberculosis
strain H37Rv obtained from genebank data.
Keywords: Tuberculosis, M. tuberculosis, ethambutol, embB, mutation
vii
RINGKASAN

MULTIDRUG RESISTANT TUBERCULOSIS (MDR-TB) DI
LABORATORIUM MIKROBIOLOGI FAKULTAS
Tuberkulosis (TB) adalah penyakit menular yang disebabkan oleh

Mycobacterium tuberculosis tersebar dari manusia ke manusia lain melalui udara.
TB biasanya mempengaruhi organ tubuh paru-paru, tetapi juga dapat
mempengaruhi bagian tubuh yang lain, seperti otak, ginjal, atau tulang belakang.
Penyakit tuberkulosis hingga saat ini masih menjadi perhatian serius di dunia. Hal
tersebut dikarenakan angka kematian dan kesakitan akibat infeksi kuman
Mycobacterium tuberculosis masih tinggi. Pengobatan penyakit tuberkulosis dapat
dilakukan dengan cara memberikan Obat Anti-Tuberkulosis (OAT) sebagai
upaya pencegahan penyebaran lebih lanjut dari kuman Mycobacterium
tuberculosis. OAT dibagi menjadi dua golongan yaitu lini pertama dan lini kedua.
Pemberian OAT tersebut dapat menimbulkan beberapa efek samping. Salah satunya
yaitu Multidrug-Resistant Tuberculosis (MDR-TB).
MDR-TB didefinisikan sebagai resistensi terhadap isoniazid dan rifampicin,
dengan atau tanpa resisten terhadap obat anti-TB lainnya. MDR-TB dapat terjadi
karena beberapa faktor, salah satunya yaitu karena adanya suatu mutasi gen yang
berperan dalam interaksi OAT dengan targetnya pada M. tuberculosis. Selain
isoniazid dan rifampicin, OAT lini pertama lainnya yang mulai menunjukkan
terjadinya resistensi adalah ethambutol. Ethambutol berfungsi untuk menghambat
pembentukan komponen dinding sel kuman M. tuberculosis yaitu arabinogalaktan,
sehingga menghambat terjadinya replikasi dari kuman M. tuberculosis. Resistensi
terhadap obat ini dikodekan oleh gen embB, beberapa penelitian melaporkan telah
terjadi mutasi pada beberapa titik disekuen gen embB dari isolat MDR-TB maupun
yang masih sensitif terhadap OAT lini pertama.
Mekanisme resistensi berperan penting dalam peningkatan resistensi
antibiotika, dalam hal ini adalah Obat Anti Tuberkulosis (OAT). Agar dapat
menegakkan metode pencegahan serta pengendalian resistensi antibioka dengan
tepat, maka diperlukan untuk mengetahui gen resisten yang terlibat. Oleh karena itu
perlu dilakukan analisis gen embB dari isolat MDR-TB mengingat bahwa saat ini
pelaporan resistensi terhadap EMB di Instalasi Mikrobiologi Klinik Fakultas
Kedokteran Universitas Udayana/RSUP Sanglah hanya berdasarkan uji
sensitivitas obat sehingga hanya diketahui fenotifnya saja.
Penelitian ini dikerjakan dengan menggunakan teknik PCR dan sekuensing.
Sampel yang digunakan untuk sekuensing dan kemudian dilakukan analisis adalah
5 dari 29 sampel yang positif memiliki gen embB. Hasil penelitian menunjukkan
bahwa satu dari 5 sampel yang disekuensing yaitu pada sampel P69 terdapat
substitusi basa nukleotida A → G pada posisi nukleotida 916 yang menyebabkan
terjadinya perubahan asam amino Met306Val setelah dibandingkan dengan sekuens
gen embB pada M. tb strain H37Rv. Namun, hasil ini belum bisa menyimpulkan
bahwa sampel tersebut resisten terhadap ethambutol dikarenakan belum diketahui
fenotif sampel.
viii
SUMMARY
DETECTION OF embB GENE MUTATION FROM CLINICAL

ISOLATES OF MULTIDRUG RESISTANT TUBERCULOSIS
(MDR-TB) IN THE LABORATORY OF MICROBIOLOGY
FACULTY OF MEDICINE UDAYANA UNIVERSITY
Tuberculosis (TB) is an infectious disease caused by Mycobacterium

tuberculosis spread from human to human by air. TB usually affects the organs of
the lungs, but can also affect other parts of the body, such as the brain, kidneys or
spine. Tuberculosis is still a serious concern in the world. This is because the
mortality and morbidity due to infection by Mycobacterium tuberculosis is still
high. Treatment of tuberculosis can be done by Anti-Tuberculosis drugs as an effort
to prevent further spread of Mycobacterium tuberculosis. Anti-Tuberculosis drugs
are divided into two groups namely first line and second line. Giving Anti-
Tuberculosis drugs can cause several side effects. One of them is Multidrug-
Resistant Tuberculosis (MDR-TB).
MDR-TB is defined as resistance to isoniazid and rifampicin, with or
without resistance to other anti-TB drugs. MDR-TB can occur due to several
factors, one of which is due to a gene mutation that plays a role in the interaction
of anti-TB with its target in M. tuberculosis. In addition to isoniazid and rifampicin,
other first-line anti-TBs that begin to show resistance is ethambutol. Ethambutol
serves to inhibit the formation of components of the cell wall of M. tuberculosis
bacteria, namely arabinogalactan, thus inhibiting the replication of M.
tuberculosis. Resistance to this drug is encoded by the embB gene, several studies
have reported mutations at several points as per the embB gene from MDR-TB
isolates and those that are still sensitive to first-line Anti-Tuberculosis drugs.
The mechanism of resistance plays an important role in increasing
antibiotic resistance, in this case the Anti-Tuberculosis drugs. In order to properly
enforce the methods of prevention and control of antibiotic resistance, it is
necessary to know the resistant genes involved. Therefore, it is necessary to analyze
the embB gene from MDR-TB isolates considering that currently reporting on EMB
resistance in Clinical Microbiology Installation at the Faculty of Medicine,
Udayana University/Sanglah Hospital is only based on drug sensitivity testing so
that only known phenotype is known.
This research was carried out using PCR techniques and sequencing. The
sample used for sequencing and then analyzed was 5 of 29 positive samples that
had the embB gene. The results showed that one of the 5 samples were sequenced,
namely in the P69 sample, there was a substitution of nucleotide base A → G at
916 nucleotide position which caused changes in the amino acid Met306Val after
being compared with the embB gene sequence on M. tb strain H37Rv. However,
this result cannot conclude that the sample is resistant to ethambutol because the
sample phenotype is not yet known.
ix
DAFTAR ISI
Sampul Dalam..................................................................................................................... i
Lembar Persetujuan Pembimbing ...................................................................................... ii
Halaman Penetapan Panitia Penguji Skripsi ...................................................................... iii
Kata Pengantar .................................................................................................................. iv
Pernyataan Keaslian Karya Tulis Skripsi ........................................................................... v
Abstrak.............................................................................................................................. vi
Abstract ............................................................................................................................ vii
Ringkasan ....................................................................................................................... viii
Summary ........................................................................................................................... ix
Daftar Isi ............................................................................................................................ x
Daftar Tabel ..................................................................................................................... xii
Daftar Gambar ................................................................................................................ xiii
Daftar Singkatan ..............................................................................................................xiv
Daftar Lampiran ............................................................................................................... xv
BAB I Pendahuluan ........................................................................................................... 1
1.1 Latar Belakang ......................................................................................................... 1
1.2 Rumusan Masalah .................................................................................................... 3
1.3 Tujuan Penulisan ...................................................................................................... 3
1.4 Manfaat Penulisan .................................................................................................... 3
1.4.1 Manfaat Teoritis ................................................................................................ 3
1.4.2 Manfaat Praktis ................................................................................................. 4
BAB II Tinjauan Pustaka ................................................................................................... 5
2.1 Mycobacterium tuberculosis .................................................................................... 5
2.2 Tuberkulosis ............................................................................................................. 6
2.2.1 Definisi .............................................................................................................. 6
2.2.2 Epidemiologi ..................................................................................................... 6
2.2.3 Patogenesis ........................................................................................................ 7
2.2.4 Pengobatan ........................................................................................................ 8
2.3 Multidrug-Resistant Tuberculosis (MDR-TB) ......................................................... 9
2.4 Gen embB ............................................................................................................... 10
2.5 Metode Analisis Molekuler .................................................................................... 11
2.5.1 Ekstraksi DNA dan Polymerase Chain Reaction (PCR).................................. 11
2.5.2 Elektroforesis .................................................................................................. 13
x
2.5.3 Sekuensing ...................................................................................................... 14
BAB III Kerangka Berpikir dan Konsep Penelitian ......................................................... 17
3.1 Kerangka Berfikir................................................................................................... 17
3.2 Kerangka Konsep ................................................................................................... 18
BAB IV Metode Penelitian .............................................................................................. 19
4.1 Jenis Rancangan Penelitian .................................................................................... 19
4.2 Subjek Penelitian .................................................................................................... 19
4.2.1 Populasi dan Sampel Penelitian ....................................................................... 19
4.2.2 Kriteria Sampel ............................................................................................... 19
4.2.3 Teknik Pengambilan Sampel ........................................................................... 20
4.2.4 Besar Sampel ................................................................................................... 20
4.3 Variabel Penelitian ................................................................................................. 20
4.3.1 Identifikasi Variabel ........................................................................................ 20
4.3.2 Definisi Operasional Variabel ......................................................................... 20
4.4 Alat dan Bahan Penelitian ...................................................................................... 21
4.4.1 Alat Penelitian ................................................................................................. 21
4.4.2 Bahan Penelitian.............................................................................................. 21
4.5 Tempat dan Waktu Penelitian ................................................................................ 22
4.6 Alur Penelitian ....................................................................................................... 22
4.7 Prosedur Penelitian ................................................................................................. 23
4.7.1 PCR ................................................................................................................. 23
4.7.2 Elektroforesis .................................................................................................. 24
4.7.3 Sekuensing ...................................................................................................... 24
4.8 Analisis Data .......................................................................................................... 24
BAB V Hasil dan Pembahasan......................................................................................... 25
5.1 Karakteristik Sampel .............................................................................................. 25
5.2 Polymerase Chain Reaction (PCR) ........................................................................ 25
5.3 Sekuensing ............................................................................................................. 27
BAB VI Simpulan dan Saran ........................................................................................... 32
6.1 Simpulan ................................................................................................................ 32
6.2 Saran ...................................................................................................................... 32
DAFTAR PUSTAKA ...................................................................................................... 33
xi
DAFTAR TABEL
Tabel 5.1 Deteksi mutasi pada 50 isolat MDR-TB berdasarkan hasil penelitian
Bakula et al ............................................................................................................ 30
xii
DAFTAR GAMBAR
Gambar 2.1 Mycobacterium tuberculosis, SEM 5 µm............................................. 5

Gambar 2.2 Mekanisme kerja ethambutol ............................................................. 10
Gambar 2.3 Tahapan proses PCR .......................................................................... 12
Gambar 2.4 Urutan Sekuensing DNA .................................................................... 14
Gambar 2.5 Teknologi sekuensing DNA generasi pertama ................................... 15
Gambar 3.1 Kerangka konsep peneletian............................................................... 18
Gambar 4.1 Skema prosedur penelitian ................................................................. 22
Gambar 4.2 Proses PCR dalam amplifikasi gen embB .......................................... 23
Gambar 5.1 Amplifikasi PCR grn embB dengan marker 100 bp DNA ................. 25
Gambar 5.2 Contoh hasil sekuensing isolat sampel dalam bentuk format AB1 .... 27
Gambar 5.3 Hasil alignment basa nukleotida pada sampel dengan sekuens embB
pada M. tuberculosis strain H37Rv ........................................................................ 28
Gambar 5.4 Hasil alignment protein pada sampel dengan sekuens embB pada M.
tuberculosis strain H37Rv ...................................................................................... 28
xiii
DAFTAR SINGKATAN
TB : Tuberkulosis
OAT : Obat Anti Tuberkulosis
MDR-TB : Multidrug Resistant Tuberculosis
EMB : Ethambutol
DNA : Deoxyribonucleic Acid
RNA : Ribonucleic Acid
PCR : Polymerase Chain Reaction
xiv
DAFTAR LAMPIRAN
Lampiran 1. Daftar Sampel dan Hasil .................................................................... 36

Lampiran 2. Prosedur (Metode) Penelitian ............................................................ 37
Lampiran 3. Interpretasi Hasil PCR ....................................................................... 43
Lampiran 4. Kromatogram Hasil Sekuensing ........................................................ 47
Lampiran 5. Hasil alignment nukleotida sampel.................................................... 50
Lampiran 6. Hasil alignment protein sampel ........................................................ 56
xv
BAB I
PENDAHULUAN
1.1 Latar Belakang
Tuberkulosis (TB) merupakan penyakit menular yang hingga saat ini masih
menjadi perhatian dunia. Angka kematian dan kesakitan akibat infeksi kuman
Mycobacterium tuberculosis masih tinggi. Pada tahun 2014, diperkirakan terdapat
9,6 juta kasus kejadian TB: 5,4 juta pada pria, 3,2 juta pada wanita dan 1,0 juta pada
anak-anak. Angka total secara global mengalami kenaikan setelah adanya revisi
dibandingkan dengan perkiraan sebelumnya, berdasarkan hasil dari survei
prevalensi nasional di Indonesia. Saat ini diperkirakan ada sekitar 1 juta kasus TB
baru setiap tahunnya di Indonesia, dua kali dari tingkat perkiraan sebelumnya
(World Health Organization, 2015).
Di Provinsi Bali, Case Notification Rate (CNR) selama kurun waktu 3 tahun
terakhir menunjukkan bahwa secara umum sudah terjadi peningkatan walaupun
tidak signifikan. Tahun 2012 CNR Provinsi Bali sebesar 71/100.000 penduduk dan
pada tahun 2013 meningkat menjadi 74/100.000 penduduk, sedangkan tahun 2014
angka tersebut tetap sebesar 74/100.000 penduduk (Dinas Kesehatan Provinsi Bali,
2015).
Tuberkulosis (TB) dibagi menjadi 2 jenis, yaitu tuberkulosis paru dan
tuberkulosis ekstra paru. Tuberkulosis paru adalah TB yang terjadi pada parenkim
(jaringan) paru. Sedangkan tuberkulosis ekstra paru adalah TB yang terjadi pada
organ selain paru: pleura, kelenjar limfe, abdomen, saluran kencing, kulit, sendi,
selaput otak, dan tulang. Pengobatan tuberkulosis dapat dilakukan dengan cara
1
2
memberikan Obat Anti Tuberkulosis (OAT) sebagai upaya pencegahan penyebaran
lebih lanjut dari kuman Mycobacterium tuberculosis (Kementerian Kesehatan
Republik Indonesia, 2014). OAT dibagi menjadi dua golongan yaitu lini pertama
dan lini kedua, OAT golongan lini pertama meliputi isoniazid, rifampicin,
pyrazinamide, dan ethambutol. Sedangkan OAT lini kedua meliputi streptomycin,
kanamycin, amikacin, capreomycin, ofloxacin, ethionamide, para-aminosalicylic
acid (PAS), dan rifabutin (Minion et al., 2013). Namun, pemberian OAT tersebut
dapat memberikan efek samping ringan, sedang, dan berat. Salah satu efek samping
dari pemberian OAT yaitu Multidrug-Resistant Tuberculosis (MDR-TB). MDR-TB
merupakan resistensi terhadap setidaknya isoniazid dan rifampicin yang merupakan
dua obat anti tuberkulosis paling efektif. MDR-TB dapat terjadi karena beberapa
faktor, salah satunya yaitu karena adanya suatu mutasi gen yang berperan dalam
interaksi OAT dengan targetnya pada M. tuberculosis. Mutasi dapat diinduksi oleh
inadekuatnya kadar terapeutik obat, terutama akibat ketidakpatuhan pasien selama
mengkonsumsi obat (Siregar, 2015).
Pada tahun 2014, sekitar 190.000 orang meninggal karena MDR-TB. Total
111.000 orang memulai untuk melakukan pengobatan MDR-TB, angka tersebut
menunjukkan adanya peningkatan sebanyak 14% dibandingkan dengan tahun
sebelumnya, 2013. Secara global, hanya 50% dari pasien MDR-TB yang berhasil
melakukan pengobatan (World Health Organization, 2015). Salah satu OAT lini
pertama yang menunjukkan mulai terjadinya resistensi adalah ethambutol.
Ethambutol berfungsi untuk menghambat pembentukan komponen dinding sel
kuman M. tuberculosis yaitu arabinogalaktan, sehingga menghambat terjadinya
replikasi dari kuman M. tuberculosis. Resistensi terhadap obat ini dikodekan oleh
3
gen embB, beberapa penelitian melaporkan telah terjadi mutasi pada beberapa titik
disekuen gen embB dari isolat MDR-TB maupun yang masih sensitif terhadap OAT
lini pertama (Irianti et al., 2016).
Mekanisme resistensi berperan penting dalam peningkatan resistensi
antibiotika, dalam hal ini adalah Obat Anti Tuberkulosis (OAT). Agar dapat
menegakkan metode pencegahan serta pengendalian resistensi antibioka dengan
tepat, maka diperlukan untuk mengetahui gen resisten yang terlibat. Oleh karena itu
perlu dilakukan analisis gen embB dari isolat MDR-TB mengingat bahwa saat ini
pelaporan resistensi terhadap EMB di Instalasi Mikrobiologi Klinik Fakultas
Kedokteran Universitas Udayana/RSUP Sanglah hanya berdasarkan uji sensitivitas
obat sehingga hanya diketahui fenotifnya saja.
1.2 Rumusan Masalah
Apakah ada perbedaan genotip gen embB dari isolat MDR-TB di Instalasi
Mikrobiologi Klinik RSUP Sanglah Denpasar periode 2017 apabila dibandingkan
dengan genotip gen embB pada M. tuberculosis strain H37Rv?
1.3 Tujuan Penulisan
Untuk mengetahui perbedaan genotip gen embB dari isolat MDR-TB di
Instalasi Mikrobiologi Klinik RSUP Sanglah Denpasar periode 2017 apabila
dibandingkan dengan genotip gen embB pada M. tuberculosis strain H37Rv.
1.4 Manfaat Penulisan
1.4.1 Manfaat Teoritis
1. Memberikan informasi dasar mengenai genotip gen embB dari isolat MDR-
TB di Instalasi Laboratorium Mikrobiologi Klinik RSUP Sanglah
Denpasar.
4
2. Dengan adanya penelitian ini maka dapat digunakan sebagai data dasar
untuk memprediksi sumber infeksi dan rantai penularan M. tuberculosis.
3. Dapat digunakan sebagai data dasar penelitian lebih lanjut untuk
penanggulangan kasus MDR-TB.
1.4.2 Manfaat Praktis
1. Bagi klinisi dengan menggunakan pemeriksaan molekuler untuk
mengetahui resistensi M. tuberculosis terhadap OAT memungkinkan hasil
akurat dalam waktu yang singkat.
2. Bagi klinisi dapat digunakan untuk memprediksi perkembangan dari
infeksi TB pada pasien sehingga pengobatan menjadi lebih akurat.

BAB II
TINJAUAN PUSTAKA
2.1 Mycobacterium tuberculosis
Mycobacterium tuberculosis adalah bakteri tahan asam, yang dapat
membentuk kompleks acid-stable ketika pewarna arylmethane tertentu
ditambahkan. Semua spesies mikobakteri memiliki struktur ropelike peptidoglikan
yang disusun sedemikian rupa untuk memberi mereka sifat dari bakteri tahan asam.
Mycobacteria banyak ditemukan di tanah dan air, tetapi M. tuberculosis terutama
diidentifikasi sebagai patogen yang hidup di inang. Beberapa spesies di M.
tuberculosis complex telah beradaptasi struktur genetik mereka secara khusus untuk
menginfeksi populasi manusia (Uhia et al., 2011).
M. tuberculosis dapat diisolasi di laboratorium dan disimpan pada -80°
untuk dipelajari secara ekstensif, dan strain yang paling umum digunakan M.
tuberculosis adalah strain H37Rv (Uhia et al., 2011). M. tuberculosis memiliki
kromosom sirkuler dengan ukuran basa nukleotida sekitar 4.200.000 (Ouellet et al.,
2010).
Gambar 2.1 Mycobacterium tuberculosis, SEM 5 µm (Bauman, 2015)
5
6
2.2 Tuberkulosis
2.2.1 Definisi
Tuberkulosis (TB) adalah penyakit yang disebabkan oleh kuman yang
tersebar dari manusia ke manusia lain melalui udara. TB biasanya mempengaruhi
paru-paru, tetapi juga dapat mempengaruhi bagian tubuh yang lain, seperti otak,
ginjal, atau tulang belakang. Seseorang yang menderita TB dapat meninggal dunia
apabila mereka tidak mendapatkan perawatan (Centers for Disease Control and
Prevention, 2011).
Tuberkulosis (TB) merupakan penyakit kuno dengan sejarah yang berkaitan
dengan evolusi dan migrasi manusia, serta dengan asal-usul mikrobiologi. Agen
etiologi utama TB, Mycobacterium tuberculosis, diduga telah berevolusi sejak
zaman nenek moyang di Afrika Timur sekitar 3 juta tahun yang lalu (Gutierrez et
al., 2005).
2.2.2 Epidemiologi
Berdasarkan data dari World Health Organization (WHO), pada tahun 2014,
TB telah membunuh 1,5 juta orang (1,1 juta HIV-negatif dan 0,4 juta HIV- positif).
Korban terdiri atas 890.000 pria, 480.000 wanita, dan 140.000 anak-anak. Korban
meninggal akibat menderita HIV pada tahun 2014 diperkirakan sekitar 1,2 juta
orang, termasuk 0,4 juta orang lainnya merupakan penderita TB dengan HIV-
positif. Di seluruh dunia, 9,6 juta orang diperkirakan menderita penyakit TB pada
tahun 2014: 5,4 juta pria, 3,2 juta wanita, dan 1,0 juta anak-anak. Secara global,
12% dari 9,6 juta kasus TB merupakan HIV-positif (World Health Organization,
2015).
7
India, Indonesia, dan China merupakan negara dengan jumlah kasus
penderita tuberkulosis terbesar di dunia dengan persentase 23%, 10%, dan 10% dari
total global dimana Indonesia menduduki peringkat kedua sejajar dengan China
(World Health Organization, 2015). Di Provinsi Bali, Case Notification Rate
(CNR) selama kurun waktu 3 tahun terakhir menunjukkan bahwa secara umum
sudah terjadi peningkatan walaupun tidak signifikan. Tahun 2012 CNR Provinsi
Bali sebesar 71/100.000 penduduk dan pada tahun 2013 meningkat menjadi
74/100.000 penduduk, sedangkan tahun 2014 angka tersebut tetap sebesar
74/100.000 penduduk. Sedangkan Success Rate (SR) di Provinsi Bali pada tahun
2014 angka yang dicapai sebesar 87,5%. Meskipun angka tersebut sudah diatas
target Renstra Dinas Kesehatan 2014-2018 sebesar 85%, namun masih belum
mencapai target Renstra Kemenkes tahun 2014 sebesar 88% (Dinas Kesehatan
Provinsi Bali, 2015).
2.2.3 Patogenesis
Tuberkulosis (TB) adalah penyakit yang disebabkan oleh kuman
Mycobacterium tuberculosis. Secara umum infeksi tuberkulosis dapat terjadi
apabila seseorang menghirup droplet nuklei yang mengandung basil tuberkel yang
mencapai alveoli paru-paru. Basil tuberkel tersebut akan ditelan oleh makrofag
alveolar, sebagian besar basil tersebut dihancurkan atau dihambat. Sebagian kecil
lainnya dapat berkembang biak secara intraseluler dan dilepas ketika makrofag
mati. Jika hidup, basil tersebut dapat menyebar melalui saluran limfatik atau
melalui aliran darah ke jaringan atau organ yang lebih jauh (termasuk daerah tubuh
dimana penyakit TB paling sering berkembang disana: kelenjar getah bening
regional, apeks paru, ginjal, otak, dan tulang). Proses penyebaran tersebut
8
memancing sistem kekebalan tubuh untuk respon sistemik (Centers for
Disease Control and Prevention, 2013).
Latent Tuberculosis Infection (LTBI) adalah ketika di dalam tubuh seorang
manusia terdapat basil tuberkel, tetapi sistem kekebalan tubuh masih menjaga
basilus tersebut dibawah kontrolnya dan masih dalam keadaan inaktif. Sistem
kekebalan tubuh dapat melakukan hal tersebut dengan cara memproduksi sel imun
khusus yang mengelilingi basil tuberkel. Sel-sel tersebut membentuk kulit yang
berperan sebagai dinding dan menjaga isi basilus dan inaktif. Seseorang yang
memiliki LTBI tidak dapat menularkan infeksi ke orang lain. Beberapa orang
dengan LTBI akan berkembang menjadi penyakit Tuberkulosis. Penyakit
Tuberkulosis berkembang ketika sistem kekebalan tubuh tidak dapat menjaga basil
tuberkel dibawah kontrol dan basilus mulai untuk berkembang biak dengan sangat
cepat (Centers for Disease Control and Prevention, 2008).
2.2.4 Pengobatan
Pengobatan untuk Tuberkulosis membutuhkan waktu 6 bulan untuk
menjalani proses kemoterapi, dikelompokkan ke dalam fase intensif pengobatan
selama 2 bulan (dengan rifampicin, isoniazid, ethambutol, dan pyrazinamide) dan
selanjutnya 4 bulan dengan rifampicin dan isoniazid. Namun, pengobatan ini
dianggap berat bagi pasien TB dan penuh dengan masalah seperti kurangnya
kepatuhan pasien, ketersediaan obat yang buruk, dan efek samping dari obat itu
sendiri (Kana and Churchyard, 2013).

9
2.3 Multidrug-Resistant Tuberculosis (MDR-TB)
Resistensi terhadap OAT (Obat Anti Tuberkulosis) dibagi menjadi dua
jenis: MDR-TB dan XDR-TB. Multidrug-Resistant Tuberculosis (MDR-TB)
didefinisikan sebagai resistensi terhadap isoniazid dan rifampicin, dengan atau
tanpa resisten terhadap obat anti-TB lainnya. Sedangkan Extensively Drug
Resistant Tuberculosis (XDR-TB) didefinisikan sebagai resisten terhadap
sekurang-kurangnya isoniazid dan rifampicin (MDR-TB) ditambah resisten
terhadap fluoroquinolone dan salah satu dari obat injeksi lini kedua (Kapadiya,
Raval and Patel, 2009).
Ethambutol merupakan obat lini pertama yang digunakan untuk mengobati
Tuberkulosis dan sering digunakan bersamaan dengan isoniazid dan rifampicin.
Ethambutol pertama kali diperkenalkan dalam pengobatan TB pada tahun 1966 dan
merupakan bagian dari rejimen lini pertama untuk mengobati penyakit tuberkulosis.
Ethambutol bersifat bakteriostatik dengan mengganggu biosintesis arabinogalaktan
pada dinding sel bakteri (Takayama and Kilburn, 1989).
Ethambutol (EMB) [(S,S’)–2,2’ (ethylenediimino) di–1–butanol] adalah
obat lini pertama yang digunakan dalam bentuk kombinasi dengan isoniazid
(INH), rifampicin (RMP), dan pyrazinamide (PZA) untuk mencegah munculnya
resistensi obat. Minimum Inhibitory Concentration (MIC) dari Ethambutol untuk
Mycobacterium tuberculosis berada pada kisaran 0,5-2 μg/ml. Ethambutol
merupakan agen bakteriostatik yang aktif untuk pertumbuhan basil dan tidak
memiliki efek pada basil non-replikasi. Mekanisme kerja dari Ethambutol yaitu
dengan mengganggu biosintesis dari dinding sel arabinogalaktan. Perilaku tersebut
menghambat polimerisasi dinding sel arabinan dari arabinogalaktan dan

10
lipoarabinomannan, dan menginduksi akumulasi dari D-arabinofuranosyl-P-
decaprenol, perantara di biosintesis arabinan. Transferase arabinosil, suatu enzim
yang terlibat dalam sintesis arabinogalaktan, yang merupakan target dari
Ethambutol di M. tuberculosis dan M. avium (Zhang and Yew, 2009).
Gambar 2.2 Mekanisme kerja ethambutol (Rattan, Kalia and Ahmad, 1998)
2.4 Gen embB
EMB bertindak melawan TB dengan menghambat pemindahan arabinosil
yang terkait dengan membran yang dikodekan oleh operon embCAB (termasuk
embC, embA, dan embB), yang terlibat dalam sintesis dinding sel arabinogalactan
(Zhao et al., 2015). Gen embCAB M. tuberculosis merupakan operon dengan besar
10 kbp yang mengkode transferase arabinosil mikobakteri. Penelitian dengan
menggunakan panel M. tuberculosis yang terdiri dari isolat resisten ethambutol,
ditemukan bahwa mendekati 50% mengalami mutasi pada kodon 306 dari gen
embB, perubahan gen terjadi karena adanya substitusi asam amino pada embB yang
11
tidak ditunjukkan pada isolat sensitive ethambutol (Da Silva and Palomino, 2011).
Frekuensi munculnya mutasi pada gen embB sebesar 105 dengan nilai MIC sebesar
> 7,5 μg/mL (Zhang and Yew, 2009).
Rata-rata mutasi embB di 109 strain ethambutol resisten M. tuberculosis
adalah 85,3% (93/109) tetapi hanya 15% (23/153) di strain ethambutol sensitif,
dimana 17 berada di lokasi embB306. Pola mutasi embB lainnya juga ditemukan di
kodon 328 (3), 354 (5), 406 (20), dan 497 (9) pada isolat resisten ethambutol dan
kodon 246 (1), 307 (1), 318 (1), 336 (1), 406 (1), dan 439 (1) pada 153 isolat sensitif
ethambutol. Sebelas isolat memiliki mutasi ganda di isolat resisten ethambutol.
Kodon wild type ATG di embB306 berubah menjadi GTG, CTG, TTG, ATA, ATT,
atau ATC, yang mana GTG adalah yang paling sering (39), diikuti oleh ATA (11),
CTG (8), TTG (2), dan ATC (1) (Xu et al., 2015).
2.5 Metode Analisis Molekuler
2.5.1 Ekstraksi DNA dan Polymerase Chain Reaction (PCR)
Polymerase chain reaction (PCR) adalah suatu teknik ilmiah dalam biologi
molekular untuk mengamplifikasi satu atau beberapa salinan dari potongan DNA
di beberapa urutan besarnya, menghasilkan ribuan hingga jutaan salinan urutan
DNA tertentu. Polymerase chain reaction (PCR) dikembangkan pada tahun 1984
oleh seorang ahli biokimia Amerika, Kary Mullis (Mohini and Deshpande, 2010).
PCR dapat dilakukan dengan menggunakan DNA sumber dari berbagai
jenis jaringan dan organisme, termasuk darah tepi, kulit, rambut, air liur, dan
mikroba. Hanya jumlah DNA yang dibutuhkan untuk PCR untuk menghasilkan
cukup banyak salinan yang akan dianalisis dengan menggunakan metode

12
konvensional laboratorium. Dalam hal ini, PCR merupakan tes sensitive (Garibyan
and Avashia, 2013).
Beberapa komponen yang diperlukan pada proses PCR yaitu DNA template,
primer, nukleotida, dan DNA polymerase. DNA polymerase merupakan key enzyme
yang menghubungkan nukleotida individu bersama untuk membentuk produk PCR.
Nukleotida meliputi empat basa – adenine (A), timin (T), sitosin (C), guanine (G) –
yang ditemukan didalam DNA. Nukleotida berperan sebagai building block yang
digunakan oleh DNA polymerase untuk menciptakan produk PCR yang dihasilkan.
Primer merupakan suatu oligonukleotida pendek yang mempunyai urutan
nukleotida yang komplementer dengan urutan nukleotida DNA templat. Primer
dalam reaksi menentukan produk DNA yang tepat untuk diamplifikasi. DNA
template merupakan fragmen DNA yang akan diamplifikasi dan berasal dari
pathogen yang terdapat dalam spesimen klinik dan dibuat melalui ekstraksi DNA.
Sampel untuk ekstraksi DNA bakteri M. tb diambil dari media tempat kultur bakteri
yaitu pada media LJ (Garibyan and Avashia, 2013).
Gambar 2.3 Tahapan proses PCR (Garibyan and Avashia, 2013)

13
Proses PCR terdiri dari beberapa tahapan: (1) pra-denaturasi DNA templat,
(2) denaturasi DNA templat, (3) penempelan primer pada templat (annealing), (4)
pemanjangan primer (extension) dan (5) pemantapan (postextension). Pada tahap
kedua hingga keempat merupakan tahapan berulang (siklus), dimana pada setiap
siklus terjadi duplikasi jumlah DNA (Handoyo and Rudiretna, 2000).
2.5.2 Elektroforesis
Elektroforesis secara harfiah berarti berjalan di medan listrik. Elektroforesis
merupakan alat analisis yang cukup sederhana, cepat dan sangat sensitif. Ini
digunakan secara analitis untuk mempelajari sifat-sifat dari spesies bermuatan
tunggal dan sebagai teknik pemisahan, sebagai contoh untuk pemisahan asam
deoksiribonukleat (DNA), asam ribonukleat (RNA), atau molekul protein yang
menggunakan medan listrik yang diterapkan pada sebuah matriks gel. Gel matriks
yang digunakan terutama adalah poliakrilamid dan agarosa. Gel agarosa adalah cara
paling efektif untuk memisahkan fragmen DNA dengan berbagai ukuran mulai dari
100 bp hingga 25 kb. Agarosa diisolasi dari genus rumput laut Gelidium dan
Gracilaria, dan terdiri dari subunit agarobiose (L- and D-galactose) yang diulang-
ulang. Penggunaan gel agarosa merevolusi pemisahan DNA. Sebelum adopsi gel
agarosa, DNA terutama dipisahkan menggunakan sentrifugasi gradien densitas
sukrosa, yang hanya memberikan perkiraan ukuran. Teknik yang digunakan untuk
memisahkan DNA menggunakan elektroforesis gel agarosa, DNA dimuat ke dalam
sumur pra-cetak dalam gel dan dialiri oleh arus listrik. Phosphate backbone dari
molekul DNA (dan RNA) bermuatan negatif, oleh karena itu ketika ditempatkan
dalam medan listrik, fragmen DNA akan bermigrasi ke anoda bermuatan positif.
Tingkat migrasi molekul DNA melalui gel ditentukan oleh hal-hal berikut: 1)
14
ukuran molekul DNA; 2) konsentrasi agarosa; 3) konformasi DNA; 4) tegangan
yang diterapkan, 5) ethidium bromide, 6) jenis agarosa dan 7) buffer elektroforesis.
Setelah pemisahan, molekul DNA dapat divisualisasikan di bawah sinar UV setelah
pewarnaan dengan pewarna yang sesuai. (Lee et al., 2012)
2.5.3 Sekuensing
Istilah sekuensing DNA mengacu pada metode untuk menentukan urutan
basa nukleotida adenin, guanin, sitosin dan timin dalam molekul DNA. Urutan
DNA pertama diperoleh oleh peneliti akademis, dengan menggunakan metode
laboratorium berdasarkan kromatografi 2 dimensi pada awal tahun 1970an (Kumar,
2012).
Gambar 2.4 Urutan Sekuensing DNA (Kumar, 2012)
DNA adalah gudang informasi yang pada akhirnya menentukan struktur
setiap produk gen, menggambarkan setiap bagian organisme. Urutan basa di
sepanjang DNA berisi serangkaian instruksi lengkap yang membentuk warisan
genetik (Kumar, 2012).
Pada tahun 1975, Sanger memperkenalkan konsep dari metode sekuensing
DNA dalam kuliah Croonian yang dipimpin olehnya dan kemudian, menerbitkan
suatu metode cepat untuk menentukan urutan DNA melalui sintesis primer dengan
DNA polymerase. Pada tahun 1977, dua artikel penting tentang sekuensing DNA
diterbitkan, yaitu teknik sekuensing DNA enzimatis dideoksi Frederick Sanger

15
yang berdasarkan analoginasi rantai dideoksinukleotida dan teknik sekuensing
DNA degradasi kimia yang pada akhirnya disebut dengan fragmen DNA oleh Allan
Maxam dan Walter Gilbert yang secara kimiawi dipecah pada basa spesifik dan
dipisahkan dengan gel elektroforesis (Pareek, Smoczynski and Tretyn, 2011).
Gambar 2.5 Teknologi sekuensing DNA generasi pertama. (a) Contoh DNA yang akan diurutkan
(b) diilustrasikan sedang menjalani sekuens Sanger (c) atau Maxam – Gilbert (Heather and Chain,
2015)
Teknik sekuensing Alan Coulson dan Sanger disebut juga dengan sistem
'plus dan minus' pada tahun 1975, sementara teknik Allan Maxam dan Walter
Gilbert disebut dengan teknik pembelahan kimia. Teknik plus dan minus
menggunakan DNA polimerase untuk mensintesis dari primer, menggabungkan
radiolabelled nukleotida, sebelum melakukan reaksi polimerisasi selama dua detik
(reaksi 'plus') di mana hanya satu jenis nukleotida yang ada, sehingga semua
ekstensi akan berakhir dengan basis tersebut. Reaksi 'minus' menghasilkan urutan
sampai ke posisi sebelum nukleotida yang hilang berikutnya dengan menjalankan
produk pada gel poliakrilamid dan membandingkan antara delapan jalur. Sementara
itu, masih menggunakan gel poliakrilamida untuk menyelesaikan fragmen DNA,

16
teknik Maxam dan Gilbert berbeda secara signifikan dalam pendekatannya. Alih-
alih mengandalkan DNA polimerase untuk menghasilkan fragmen, radiolabelled
DNA diperlakukan dengan bahan kimia yang memutuskan rantai pada basis
tertentu, setelah berjalan pada gel poliakrilamida, panjang fragmen yang terpotong
(posisi nukleotida spesifik) dapat ditentukan dan urutan atau sekuens dapat
disimpulkan (Heather and Chain, 2015).

BAB III
KERANGKA BERPIKIR DAN KONSEP PENELITIAN
3.1 Kerangka Berfikir
Tuberkulosis (TB) adalah suatu penyakit infeksi menular yang disebabkan
oleh bakteri Mycobacterium tuberculosis. Metode primary screening untuk infeksi
tuberculosis (TB), aktif maupun laten, adalah Mantoux tuberculin skin test dengan
purified protein derivative (PPD). Suatu tes darah in vitro yang berdasarkan
interferon-gamma release assay (IGRA) dengan antigen spesifik untuk
Mycobacterium tuberculosis dapat juga digunakan untuk skrining infeksi TB laten.
Tuberkulosis lebih sering terjadi pada seseorang yang memiliki gangguan pada
sistem kekebalan tubuh seperti AIDS daripada pada populasi umum. TB yang
resistan terhadap banyak jenis obat (MDR-TB) adalah suatu bentuk infeksi TB
yang disebabkan oleh bakteri yang resisten terhadap pengobatan dengan
paling sedikit dua obat anti-TB lini pertama yang paling kuat, isoniazid (KatG) dan
rifampisin (rpoB). Beberapa bentuk TB juga resisten terhadap obat lini kedua.
Ethambutol adalah obat anti tuberkulosis lini pertama yang digunakan dengan
kombinasi obat tuberkulosis intensif lainnya. Mekanisme kerja ethambutol yaitu
dengan mengganggu biosintesis dari dinding sel arabinogalaktan. Ethambutol
(EMB) bertindak melawan TB dengan menghambat pemindahan arabinosil yang
terkait dengan membran yang dikodekan oleh operon embCAB (termasuk embC,
embA, dan embB), yang terlibat dalam sintesis dinding sel arabinogalaktan. Gen
embCAB M. tuberculosis merupakan operon dengan besar 10 kbp yang mengkode
transferase arabinosil mikobakteri. Penelitian dengan menggunakan panel M.
17
18
tuberculosis yang terdiri dari isolat resisten ethambutol, ditemukan bahwa
mendekati 50% mengalami mutasi pada kodon 306 dari gen embB, perubahan gen
terjadi karena adanya substitusi asam amino pada embB yang tidak ditunjukkan
pada isolat ethambutol sensitif.
3.2 Kerangka Konsep
Uji
Fenotif
Multidrug Resistant Menyebabkan
Tuberculosis (MDR-TB) kegagalan terapi
Uji
Genotip
Mutasi Mutasi Mutasi Mutasi Mutasi

Gen KatG Gen rpoB Gen embB Gen pncA Gen rpsL
Deteksi Mutasi
Gen embB
Gambar 3.1 Kerangka konsep peneletian
Keterangan:
= Dikerjakan oleh peneliti

BAB IV
METODE PENELITIAN
4.1 Jenis Rancangan Penelitian
Jenis penelitian ini adalah deskriptif dengan rancangan penelitian potong
lintang (cross sectional) yang diambil dalam jangka waktu sekali penelitian.
4.2 Subjek Penelitian
4.2.1 Populasi dan Sampel Penelitian
1. Populasi target adalah DNA MDR-TB yang diisolasi dari isolat klinis MDR-
TB periode 2017 yang telah dikultur di Laboratorium Mikrobiologi Fakultas
Kedokteran Universitas Udayana.
2. Populasi terjangkau adalah DNA MDR-TB yang diisolasi dari isolat klinis
MDR-TB yang positif memiliki gen embB diperiksa dengan PCR.
3. Sampel adalah lima DNA dari populasi terjangkau yang dipilih secara acak.
4.2.2 Kriteria Sampel
a. Kriteria inklusi : DNA isolat MDR-TB yang positif memiliki gen embB
diperiksa dengan PCR.
b. Kriteria eksklusi : Sampel yang mengalami degradasi DNA sehingga
tidak bisa dilakukan sekuensing.
19
20
4.2.3 Teknik Pengambilan Sampel
Teknik yang digunakan untuk penentuan sampel penelitian untuk PCR
yaitu total sampling dengan memakai ekstrak DNA MDR-TB yang memenuhi
kriteria inklusi. Selanjutnya dari sampel yang di PCR terdeteksi gen embB,
dilakukan teknik random sampling untuk menentukan 5 sampel yang akan
dilakukan sekuensing.
4.2.4 Besar Sampel
Besar sampel dalam penelitian ini menggunakan semua ekstrak DNA MDR
TB yang diisolasi dari isolat klinis MDR-TB yang disimpan di Laboratorium
Mikrobiologi Fakultas Kedokteran Universitas Udayana. Sampel untuk PCR
berjumlah 30 sampel, selanjutnya dipilih 5 sampel secara acak yang positif
terdeteksi memiliki gen embB untuk dilakukan sekuensing.
4.3 Variabel Penelitian
4.3.1 Identifikasi Variabel
Variabel yang terlibat dalam penelitian ini adalah ekstrak DNA Multidrug
Resistant Tuberculosis (MDR-TB) dan kelompok gen embB.
4.3.2 Definisi Operasional Variabel
1. Ekstrak DNA Multidrug Resistant Tuberculosis (MDR-TB) adalah hasil
ekstraksi DNA dari isolat Mycobacterium tuberculosis yang resisten
terhadap rifampisin dan isoniazid (MDR-TB) yang telah di sub-kultur
menggunakan media L-J dan di ekstraksi menggunakan Wizard Genomic
DNA Purification Kit oleh peneliti sebelumnya, Dwija et.al., 2017
(unpublished data) pada bulan Agustus 2017 di Instalasi Laboratorium
Mikrobiologi Klinik RSUP Sanglah Denpasar.

21
2. Gen embB merupakan gen yang mengkode enzim arabinosyl transferase
yaitu suatu enzim yang terlibat dalam proses pembentukan dinding sel
bakteri.
3. Amplifikasi gen embB dilakukan menggunakan metode PCR dengan Primer
F: 5’-GGTGATATTCGGCTTCCT-3’ dan R: 5’-
ATAGCGCGGTGATCAAAAAG-3’ dengan suhu annealing 50oC.
Ukuran produk PCR yang akan dihasilkan primer adalah 799 bp (Zhang et
al., 2014).
4. Sekuensing DNA adalah proses penentuan urutan nukleotida dari fragmen
DNA yang disediakan. Metode sekuensing yang digunakan adalah metode
Sanger. Proses sekuensing dilakukan di 1st Base Malaysia melalui PT.
Genetika Science Jakarta.
4.4 Alat dan Bahan Penelitian
4.4.1 Alat Penelitian
Alat-alat dalam penelitian ini adalah Mesin PCR Biometra, Mesin
Elektroforesis (Mupid-exU), Mikro pipet, Biological Safety Cabinet (BSC) type
II, Tabung mikro sentrifuge volume 1,5 ml, Tube PCR 0,2 ml.
4.4.2 Bahan Penelitian
Bahan-bahan penelitian ini adalah: (1) PCR: Kit PCR: Go Taq* Green
Master Mix (Promega), Rnase free water, primer spesifik; Forward: 5'-
GGTGATATTCGGCTTCCT-3’ dan Reverse: 5'-
ATAGCGCGGTGATCAAAAAG-3’ (2) Elektroforesis agarosa: bubuk agarosa,
Buffer TBE, Pewarna Gel: GelRedTM NucleiAcid Gel Stain (Biotium), dan DNA
ladder 100bp.
22
4.5 Tempat dan Waktu Penelitian
a. Pemeriksaan molekuler gen embB meliputi PCR, elektroforesis, dan
analisis data dilakukan di Laboratorium Mikrobiologi Fakultas Kedokteran
Universitas Udayana.
b. Produk PCR dikirim untuk dilakukan sekuensing di 1 st base Malaysia
(PT. Genetika Science) dan analisa data hasil sekuen dilakukan dengan
program Mega6.
c. Waktu penelitian dilaksanakan selama 7 bulan (April hingga November
2018).
4.6 Alur Penelitian
Prosedur dalam penelitian ini secara singkat dapat dilihat pada Gambar 4.1
sebagaimana berikut ini:
Pembuatan Media L-J
Ekstraksi DNA MDR-TB
Sub Kultur Isolat MDR-TB
= yang dikerjakan
PCR oleh peneliti
Elektroforesis
Sekuensing
Analisis Data
Gambar 4.1 Skema prosedur penelit ian

23
4.7 Prosedur Penelitian
4.7.1 PCR
PCR dilakukan dengan menggunakan protokol seperti yang sudah
dilakukan sebelumnya, dengan menggunakan primer spesifik sebagai berikut
untuk gen embB: 5'-GGTGATATTCGGCTTCCT-3’ dan 5'-
ATAGCGCGGTGATCAAAAAG-3’ (Zhang et al., 2014). Dilakukan amplifikasi
hasil ekstraksi DNA terdiri dari: master mix PCR (Go Taq* Green Master Mix
(Promega)) 12,5 µl, primer 0,8 µM (Forward Primer dan Reverse Primer) 2 μl ,
aquabidest 6,5 µl, dan 2 µl DNA dihomogenkan. Penelitian ini tidak
menggunakan kontrol positif, sementara untuk kontrol negatif (-)
menggunakan aquabidest steril. Pencampuran bahan – bahan tersebut dilakukan
pada PCR tube 200 ul dalam box pendingin supaya DNA dan enzim yang
digunakan tidak rusak. Campuran tersebut diatas, kemudian di spin down dan
selanjutnya di masukkan dalam mesin PCR thermal cycler untuk amplifikasi sesuai
dengan kondisi pada Gambar 4.2:
35 siklus
Pre-denaturasi Denaturasi
95oC, 3 menit 95oC, 1 menit
Ekstensi Final ekstensi
72oC, 1 menit 72oC, 5 menit
Annealing
50oC, 1 menit
∞
Gambar 4.2 Proses PCR dalam amplifikasi gen embB

24
4.7.2 Elektroforesis
Hasil amplifikasi kemudian di elektroforesis dengan menggunakan gel
Agarose 1% sebanyak 0,35 gram, dilarutkan dalam 35 ml larutan TBE (Tris Borate
EDTA)1X dan ditambahkan gel Red 1 µl sebagai pewarna. Agarose selanjutnya
dituang ke dalam cetakan yang sudah diberi sisir untuk membentuk sumuran. Gel
diletakkan dalam bak elektroforesis dan produk PCR sebanyak 2 µl dimasukkan
ke dalam sumuran, kemudian di running di mesin elektroforesis (Mupid exU)
dengan voltase 100 Volt selama 35 menit.
4.7.3 Sekuensing
Tahap selanjutnya yaitu produk PCR yang positif memiliki gen embB
diambil lima sampel untuk dikirim dan dilakukan sekuensing di 1st Base Malaysia
melalui PT. Genetika Science. Sekuensing dilakukan dengan menggunakan teknik
Sanger. Kemudian hasil sekuensing dianalisa menggunakan program Mega6, untuk
melihat adanya polimorfisme.
4.8 Analisis Data
Data penelitian ini diperoleh dari hasil sekuensing produk PCR berupa
kromatogram. Kemudian, data hasil sekuensing akan dianalisa dengan
menggunakan software Mega6 dan deteksi mutasi dengan melakukan pencocokan
pada GeneBank dengan menggunakan software BLAST NCBI
(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/). Selanjutnya data disajikan dalam bentuk tabel,
grafik, dan narasi.

BAB V
HASIL DAN PEMBAHASAN
5.1 Karakteristik Sampel
Penelitian ini menggunakan 30 sampel. Sampel adalah DNA dari isolat
klinis MDR-TB dan positif terdeteksi memiliki gen embB dari hasil PCR. Sampel
yang dilakukan PCR memiliki kode sampel P102, P115, P154, P011, P69, P80, P82,
P52, P22, 106, 86I, P84, P052, 105, 131, 134, P50, P07, P106, P153, P05, P55, P72,
P36/26?, P151, 19P31, P123, P43, P34, dan P124.
5.2 Polymerase Chain Reaction (PCR)
Visualisasi hasil amplifikasi gen embB dilakukan dengan gel agarose 1%
yang mengandung ethidium bromide 10% dan dielektroforesis dengan voltase
sebesar 100 V selama 35 menit. Hasil visualisasi dapat dilihat pada Gambar 5.1.
Ukuran produk PCR untuk gen embB yaitu 799 bp, dinyatakan positif memiliki gen
embB apabila pada elektroforesis hasil PCR ditemukan band pada 799 bp dan
dinyatakan negatif apabila pada elektroforesis hasil PCR tidak ditemukan band
pada 799 bp.

1 2 3 4 5 K(-)
3000
800
500
100
Gambar 5.1 Amplifikasi PCR gen embB dengan marker 100 bp DNA dan suhu annealing 500C.
Pada lane 1 (P102) positif gen embB; lane 2 (P115) positif gen embB (799 bp); lane 3 (P154)
positif gen embB (799 bp); lane 4 (P69) positif gen embB (799 bp); lane 5 (131) positif gen embB
(799 bp); lane K(-) kontrol negatif H2O.
25
26
Setelah tahap PCR dari 30 sampel isolat klinis ditemukan 29 sampel (97%)
positif terhadap gen embB. Sampel yang positif dikodekan oleh P102, P115, P154,
P011, P69, P80, P82, P52, P22, 106, 86I, P84, P052, 105, 131, 134, P50, P07, P106,
P153, P05, P55, P72, P36/26?, P151, P31, P123, P43, dan P34. Sampel dinyatakan
positif karena telah mencapai target 799 bp. Sementara sampel dengan kode P124
dinyatakan negatif karena tidak mencapai 799 bp dan di eksklusi dari sampel.
Ethambutol (EMB), analog arabinose, adalah obat bakteriostatik, anti-
mikobakteria, yang telah digunakan untuk pengobatan TB sejak pertengahan 1960-
an. Obat tersebut secara rutin direkomendasikan untuk terapi fase intensif penyakit
tuberculosis, sebagai bagian dari empat rejimen obat, termasuk isoniazid (INH),
rifampicin (RMP), dan pirazinamid (PZA) (Bakuła et al., 2013). Target utama dari
mekanisme kerja ethambutol adalah pada enzim arabinosyl transferase yaitu suatu
enzim yang terlibat dalam proses pembentukan dinding sel bakteri dimana enzim
ini di kode oleh gen embB, gen embA dan embC. Enzim arabinosyl transferase
berperan dalam pembentukan arabinan yang merupakan salah satu komponen
arabinogalaktan pada dinding sel Mycobacterium tuberculosis. Akan terjadi suatu
proses dimana asam mikolat berikatan pada gugus D-arabinose dari
arabinogalaktan. Ikatan tersebut akan membentuk komplek mycolyl-
arabinogalactan-peptidoglycan pada dinding sel. Pemberian ethambutol maka akan
mengganggu proses sintesis arabinogalaktan, yang pada akhirnya tidak akan
terbentuk ikatan komplek mycolyl-arabinogalactan-peptidoglycan pada dinding sel
(Alderwick et al., 2015). EMB yang menghambat sintesis arabinan akan
menyebabkan kurangnya arabinan reseptor untuk asam mikolat dan akan terjadi
27
penumpukan asam mikolat di dalam sel sehingga menyebabkan sel mati (Bakuła et
al., 2013).
Interpretasi hasil negatif pada PCR dalam penelitian ini dapat terjadi akibat
dua kemungkinan. Pertama, hasil PCR negatif karena sampel tidak mengandung
DNA target. Kedua, sampel mengandung DNA target tetapi mengalami kesalahan
laboratorium seperti ekstraksi DNA yang kurang baik dari sampel, DNA mengalami
degradasi, kinerja primer yang digunakan buruk, optimasi reaksi buruk, terjadi
kesalahan transkrip, atau sampel telah terkontaminasi (Paxson, 2008).
5.3 Sekuensing
Lima sampel dari 29 sampel yang positif terhadap gen embB (P102, P115,
P154, P69, dan 131) pada penelitian ini diambil secara acak untuk kemudian
dikirimkan ke 1st Base Malaysia melalui PT. Genetika Science Indonesia Jakarta
untuk dilakukan sekuensing. Hasil sekuensing isolat sampel yang dikirimkan oleh
1st Base Malaysia berupa urutan pasangan basa nukleotida forward dan reverse
dalam bentuk format AB1. Salah satu contohnya dapat dilihat pada Gambar 5.2.
Gambar 5.2 Contoh hasil sekuensing isolat sampel dalam bentuk format AB1
Metode sekuensing yang dilakukan yaitu menggunakan metode Sanger atau
yang biasa disebut juga dengan chain termination atau teknik dideoksi. Teknik ini
menggunakan analog kimia dari deoksiribonukleotida (dNTP) yang merupakan
monomer untaian DNA. Urutan nukleotida dapat disimpulkan menggunakan
autoradiografi dalam template, akan ada pita radioaktif di jalur yang sesuai pada
28
posisi gel. Prinsip kerja yang sama dengan teknik lain (yang menghasilkan semua
kemungkinan urutan panjang inkremental dan pelabelan nukleotida akhir), akurasi,
ketangguhan dan kemudahan penggunaan menjadikan metode ini sebagai teknologi
paling umum yang digunakan untuk mengurutkan DNA (Heather and Chain, 2015)
Data urutan pasangan basa isolat sampel yang diperoleh dari hasil
sekuensing kemudian dibandingkan dengan sekuen referens gen embB pada M.
tuberculosis strain H37Rv yang ada pada GeneBank (NC_000962.3) menggunakan
online program BLAST dari NCBI. Selanjutnya untuk melihat posisi polimorfisme
pada basa nukleotida dilakukan alignment dengan menggunakan Clustal Omega
(https://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/) dan didapatkan hasil seperti pada
Gambar 5.3.
Gambar 5.3 Hasil alignment basa nukleotida pada sampel dengan sekuens embB pada M.
tuberculosis strain H37Rv (NC_000962.3) menggunakan Clustal Omega
Gambar 5.4 Hasil alignment protein pada sampel dengan sekuens embB pada M. tuberculosis
strain H37Rv (NC_000962.3) menggunakan Clustal Omega
Hasil alignment pada kode sampel P69 didapatkan adanya substitusi basa
nukleotida A → G pada posisi nukleotida 916 yang menyebabkan terjadinya
perubahan asam amino Met306Val, seperti tertera pada Gambar 5.4. Mutasi yang
tampak pada gambar merupakan hasil dari perbandingan sekuens yang telah di
29
sekuensing dengan referens sekuens embB dari M. tuberculosis strain H37Rv yang
didapat dari data GeneBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/).
Ethambutol (EMB) telah digunakan untuk terapi penyakit tuberkulosis
selama kurang lebih 40 tahun, meskipun begitu mekanisme molekuler resistensi
EMB masih kurang dipahami. Penelitian-penelitian sebelumnya memiliki
hubungan fenotip resisten EMB dengan mutasi pada gen dengan operon embCAB,
terutama pada gen embB. Mutasi pada posisi kodon 306 pada gen embB merupakan
kejadian yang paling sering ditemui (Bakuła et al., 2013).
Hasil penelitian ini sesuai dengan penelitian yang telah dilakukan oleh Shen
et al., (2007), strain multidrug-resistant (MDR) memiliki proporsi mutasi pada
embB306 lebih tinggi daripada strain non-MDR (odds ratio, 6.78; P < 0.001). Lokus
embB306 merupakan penanda untuk deteksi MDR dan extremely drug resistant
(EDR) tuberkulosis. Penelitian sebelum-sebelumnya menunjukkan bahwa mutasi
embB306 hanya diamati pada strain EMB-resistant sehingga lokus embB306 dapat
dianggap sebagai penanda diagnostik untuk resistensi ethambutol. Deteksi
embB306 pada isolate EMB-susceptible menimbulkan pertanyaan mengenai
validitas dari pernyataan sebelumnya (Shi et al., 2011).
Bakuła et al., (2013) didalam penelitiannya juga menyatakan dari 50 isolat
MDR-TB, 17 (34%) resisten terhadap EMB. Perubahan asam amino pada kodon
306 adalah yang paling sering dan terjadi pada 20 (40%) isolate. Perubahan asam
amino Met306Val yang dihasilkan dari adanya substitusi basa nukleotida A → G
pada posisi nukleotida 916 terdeteksi di 4 isolat EMB-resistant dan 3 isolat EMB-
susceptible. Ringkasan yang lebih rinci dari hasil sekuensing telah disediakan dalam
Tabel 5.1.
30
Tabel 5.1. Deteksi mutasi pada 50 isolat MDR-TB berdasarkan hasil penelitian (Bakuła et al.,
2013)
Mutation No. (%) of isolates with detected
mutation
Nucleotide Amino acid EMB-resistant EMB-susceptible
(n = 17) (n = 33)
A → G (916) Met → Val (306) 4 (23.5) 3 (9.1)
G → A (918) Met → Ile (306) 3 (17.6) 5 (15.1)
G → C (918) Met → Ile (306) 1 (5.9) 3 (9.1)
G → C (1217) Gly → Ala (406) 4 (23.5) -
T → C (1238)* Leu → Pro (413) - 1 (3)
A → G (1490) Gln → Arg (497) - 1 (3)
G → C (1510)* Glu → Gln (504) - 1 (3)
G → A (918) and Met → Ile (306) and 1 (5.9) -
A → G (1519)* Arg → Gly (507)
*Numbers in brackets indicate nucleotide positions and amino acid residue positions; *novel
mutation.
Peran perubahan embB306 dalam menciptakan resistensi tuberkel bacilli
pada EMB dikonfirmasi oleh mutagenesis pertukaran alelik. Namun, sejumlah
laporan menunjukkan bahwa hanya kurang dari 35% isolat M. tuberculosis EMB-
resistant yang memendam mutasi pada embB kodon 306. Selain itu, mutasi pada
kodon embB306 juga ditemukan pada M. tuberculosis strain EMB-susceptible, dan
frekuensi mutasi tersebut pada strain rentan EMB mendekati mereka diantara strain
yang resisten EMB. Pernyataan tersebut memunculkan kesimpulan bahwa gen
embB tidak cukup untuk deteksi cepat resistensi EMB dan mutasi kodon 306 bukan
penanda yang baik untuk prediksi resistensi terhadap EMB. Analisis lokus genetik
lainnya diperlukan untuk identifikasi lebih spesifik terkait dengan resistensi EMB
(Bakuła et al., 2013).
Penelitian lain juga menemukan adanya mutasi embB yang terdeteksi di
tempat lain, tidak hanya embB306, tetapi embB497 dan embB406 juga tampak
dengan cukup baik. Mutasi pada embB497 ditemukan pada 16/86 (18.6%) EMB-
resistant dan 3/52 (5.8%) EMB-susceptible. Tujuh dari 86 (8.1%) isolat EMB-
resistant dan 3/52 (5.8%) EMB-susceptible membawa mutasi embB406. Proporsi
yang tinggi dari mutasi embB497 dan embB406 yang terjadi pada isolat EMB-
31
resistant kurang dari mutasi embB306 mengindikasikan pentingnya mutasi
embB497 dan embB406 sebagai hotspot tambahan untuk embB306 untuk deteksi
cepat resistensi ethambutol menggunakan tes molekuler (Shi et al., 2011).
Hasil penelitian ini hanya menunjukkan adanya mutasi pada embB306,
sementara itu tidak ditemukan adanya mutasi embB497 dan embB406 seperti pada
penelitian-penelitian sebelumnya. Keempat sampel lainnya yaitu sampel P102,
P115, P154, dan 131 tidak ditemukan adanya mutasi pada kodon 306, begitu juga
dengan kodon 497 dan 406. Hal ini didasari oleh suatu teori yang menyatakan
bahwa sifat resistensi etambutol dapat melibatkan beberapa gen lainnya, selain
embB (Telenti et al., 1997). Isolat yang digunakan sebagai sampel dalam penelitian
ini belum diketahui fenotipnya merupakan isolat EMB-resistant atau EMB-
susceptible, sehingga hasil dari penelitian ini belum bisa digunakan untuk
menentukan adanya resistensi EMB.

BAB VI
SIMPULAN DAN SARAN
6.1 Simpulan
Simpulan yang dapat disampaikan berdasarkan dari hasil penelitian ini,
yaitu berdasarkan hasil perbandingan sekuens dari hasil sekuensing sampel
penelitian dengan sekuens gen embB pada M. tuberculosis strain H37Rv sesuai
dengan referens data GeneBank (NC_000962.3), satu dari 5 sampel terdapat
perbedaan genotip gen embB. Hasil alignment sampel P69 didapatkan adanya
substitusi basa nukleotida A → G pada posisi nukleotida 916 yang menyebabkan
terjadinya perubahan asam amino Met306Val.
6.2 Saran
Penelitian ini perlu dilakukan uji sensitifitas ethambutol pada seluruh
sampel yang digunakan agar mengetahui jenis sampel yang digunakan yaitu EMB-
resistant atau EMB-susceptible. Selain itu, perlu dilakukan sekuensing terhadap 24
sampel lainnya yang positif memiliki gen embB yang digunakan di dalam penelitian
ini.
32
DAFTAR PUSTAKA
Alderwick, L. J. et al. (2015) ‘The Mycobacterial Cell Wall—Peptidoglycan and

Arabinogalactan’, Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine, pp. 1–15. doi:
10.1101/cshperspect.a021113.
Bakuła, Z. et al. (2013) ‘Mutations in the embB gene and their association with
ethambutol resistance in multidrug-resistant mycobacterium tuberculosis clinical
isolates from Poland’, BioMed Research International, 2013, pp. 1–5. doi:
10.1155/2013/167954.
Bauman, R. W. (2015) Microbiology with Diseases by Body System. Fourth. United

States of America: Pearson education.
Centers for Disease Control and Prevention (2008) Self-Study Modules on

Tuberculosis: Transmission and Pathogenesis of Tuberculosis.
Centers for Disease Control and Prevention (2011) ‘Tuberculosis Elimination:

Tuberculosis general information’. Available at: http://www.cdc.gov/tb.
Centers for Disease Control and Prevention (2013) Core Curriculum on

TUberculosis: What the Clinician Should Know. 6th edn. Available at:
https://www.cdc.gov/tb/education/corecurr/pdf/corecurr_all.pdf.
Da Silva, P. E. A. and Palomino, J. C. (2011) ‘Molecular basis and mechanisms of

drug resistance in Mycobacterium tuberculosis : classical and new drugs’, Journal
of Antimicrobial Chemotherapy, pp. 1417–1430. doi: 10.1093/jac/dkr173.
Dinas Kesehatan Provinsi Bali (2015) Profil Kesehatan Provinsi Bali Tahun 2014.
Garibyan, L. and Avashia, N. (2013) ‘Research Techniques Made Simple:

Polymerase Chain Reaction (PCR)’, The Journal of investigative dermatology,
133(3), p. e6. doi: 10.1038/jid.2013.1.Research.
Gutierrez, M. C. et al. (2005) ‘Ancient Origin and Gene Mosaicism of the

Progenitor of Mycobacterium tuberculosis’, PLoS Pathogens, p. e5. doi:
10.1371/journal.ppat.0010005.
Handoyo, D. and Rudiretna, A. (2000) ‘PRINSIP UMUM DAN PELAKSANAAN

POLYMERASE CHAIN REACTION (PCR) [General Principles and
Implementation of Polymerase Chain Reaction]’, Unitas, 9(1), pp. 17–29. doi:
10.3390/s100706535.
Heather, J. M. and Chain, B. (2015) ‘The sequence of sequencers: The history of

sequencing DNA’, Genomics. Elsevier B.V., pp. 1–30. doi:
10.1016/j.ygeno.2015.11.003.
Irianti et al. (2016) Anti-Tuberkulosis. Yogyakarta: Grafika Indah.
33
Kana, B. and Churchyard, G. (2013) ‘Tuberculosis : The global killer’, South
African Journal of Science, 109(9/10), pp. 1–2. doi: http://dx.doi.
org/10.1590/sajs.2013/a0036.
Kapadiya, B., Raval, N. B. and Patel, V. (2009) ‘MDR and XDR Tuberculosis’,
Gujarat Medical Journal, 64(2), pp. 19–24.
Kementerian Kesehatan Republik Indonesia (2014) Pedoman Nasional

Pengendalian Tuberkulosis.
Kumar, B. R. (2012) Methods of DNA Sequencing- DNA Representation, Dna

Sequencing – Methods and Applications. InTech. doi: 10.5772/2158.
Lee, P. Y. et al. (2012) ‘Agarose Gel Electrophoresis for the Separation of DNA
Fragments’, Journal of Visualized Experiments, (62), pp. 1–5. doi: 10.3791/3923.
Minion, J. et al. (2013) ‘Multidrug and Extensively Drug-resistant Tuberculosis in

Canada 1997 – 2008 : Demographic and Disease Characteristics’, PLOS ONE, 8(1).
doi: 10.1371/journal.pone.0053466.
Mohini, J. and Deshpande, J. D. (2010) ‘Polymerase Chain Reaction : Methods ,

Principles and Application’, International Journal of Biomedical Research, 5, pp.
81–97. doi: http://dx.doi.org/10.7439/ijbr.v2i1.83.
Ouellet, H. et al. (2010) ‘Mycobacterium tuberculosis CYP125A1, a steroid C27

monooxygenase that detoxifies intracellularly generated cholest-4-en-3-one’, Mol
Microbiol, pp. 730–742. doi: 10.1111/j.1365-2958.2010.07243.x. Mycobacterium.
Pareek, C. S., Smoczynski, R. and Tretyn, A. (2011) ‘Sequencing technologies and

genome sequencing’, Journal of Applied Genetics, 52(4), pp. 413–435. doi:
10.1007/s13353-011-0057-x.
Paxson, J. (2008) ‘Polymerase Chain Reaction Test Interpretation’, Compendium

Equine, pp. 186–196. Available at: http://vetfolio-
vetstreet.s3.amazonaws.com/mmah/ba/e4d32bc0854d3ca002b1e4c3713fae/filePV
E_03_04_186.pdf.
Rattan, A., Kalia, A. and Ahmad, N. (1998) ‘Multidrug-resistant Mycobacterium

tuberculosis: Molecular perspectives’, Emerging Infectious Diseases, 4(2), pp. 195–
209. doi: 10.3201/eid0402.980207.
Shen, X. et al. (2007) ‘Association between embB codon 306 mutations and drug
resistance in Mycobacterium tuberculosis’, Antimicrobial Agents and
Chemotherapy, 51(7), pp. 2618–2620. doi: 10.1128/AAC.01516-06.
Shi, D. et al. (2011) ‘Characteristics of embB mutations in multidrug-resistant

Mycobacterium tuberculosis isolates in Henan, China’, Journal of Antimicrobial
Chemotherapy, 66(10), pp. 2240–2247. doi: 10.1093/jac/dkr284.
Siregar, M. I. T. (2015) ‘Mekanisme Resistensi Isoniazid & Mutasi Gen KatG
34
Ser315Thr ( G944C ) Mycobacterium tuberculosis Sebagai Penyebab Tersering
Resistensi Isoniazid’, Jambi Medical Journal, 3, pp. 119–131.
Takayama, K. and Kilburn, J. O. (1989) ‘Inhibition of Synthesis of Arabinogalactan

by Ethambutol in Mycobacterium smegmatis’, Antimicrobial Agents and
Chemotherapy, 33(9), pp. 1493–1499.
Telenti, A. et al. (1997) ‘The emb operon, a gene cluster of Mycobacterium

tuberculosis involved in resistance to ethambutol’, Nature Medicine, 3(5), pp. 567–
570.
Uhia, I. et al. (2011) ‘Characterization of the KstR-dependent promoter of the gene

for the first step of the cholesterol degradative pathway in Mycobacterium
smegmatis’, Microbiology, 157(9), pp. 2670–2680. doi: 10.1099/mic.0.049213-0.
World Health Organization (2015) Global Tuberculosis Report 2015. 20th edn.
Xu, Y. et al. (2015) ‘Mutations Found in embCAB, embR,and ubiA Genes of

Ethambutol-Sensitive and -Resistant Mycobacterium tuberculosis Clinical Isolates
from China’, BioMed Research International. Hindawi Publishing Corporation,
2015(1–8). doi: http://dx.doi.org/10.1155/2015/951706.
Zhang, Y. and Yew, W. W. (2009) ‘Mechanisms of drug resistance in

Mycobacterium tuberculosis’, State of the Art, 13(11), pp. 1320–1330.
Zhang, Z. et al. (2014) ‘Ethambutol resistance as determined by broth dilution

method correlates better than sequencing results with embB mutations in multidrug-
resistant Mycobacterium tuberculosis isolates’, Journal of Clinical Microbiology,
52(2), pp. 638–641. doi: 10.1128/JCM.02713-13.
Zhao, L. L. et al. (2015) ‘Analysis of embCAB mutations associated with

ethambutol resistance in multidrug-resistant mycobacterium tuberculosis isolates
from China’, Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 59(4), pp. 2045–2050. doi:
10.1128/AAC.04933-14.
35
Lampiran 1. Daftar Sampel dan Hasil
No. Kode Sampel Kelompok Gen embB
1. P102 Positif
2. P115 Positif
3. P154 Positif
4. P011 Positif
5. P69 Positif
6. P80 Positif
7. P82 Positif
8. P52 Positif
9. P22 Positif
10. 106 Positif
11. 86I Positif
12. P84 Positif
13. P052 Positif
14. 105 Positif
15. 131 Positif
16. 134 Positif
17. P50 Positif
18. P07 Positif
19. P106 Positif
20. P153 Positif
21. P05 Positif
22. P55 Positif
23. P72 Positif
24. P36/26? Positif
25. P151 Positif
26. P31 Positif
27. P123 Positif
28. P43 Positif
29. P34 Positif
30. P124 Negatif
36
Lampiran 2. Prosedur (Metode) Penelitian
A. Pembuatan Media L-J
(Prosedur telah dilakukan oleh peneliti sebelumnya pada tahun 2017 sesuai dengan
prosedur di Instalasi Mikrobiologi Klinik RSUP Sanglah Denpasar)
1. Sebanyak 7,5 gram media L-J dicampur dengan 120 mL akuabidestilata
kemudian ditambahkan dengan 2,4 mL gliserol dicampur hingga
homogen.
2. Setelah itu, sterilkan dengan autoklaf selama 15 menit pada suhu
1210C.
3. Kemudian dinginkan hingga suhu ±600C.
4. Tambahkan telur homogen sebanyak 200 mL yang telah dipersiapkan
secara steril. Dicampur perlahan-lahan agar tidak terbentuk gelembung.
5. Media kemudian dituangkan ke dalam tabung McCartney steril sebanyak 7
mL.
6. Tutup secara rapat dan letakkan dengan kemiringan ±300 dalam inspisator
yang telah dipanaskan sampai suhu 850C dan dikoagulasikan selama 45
menit.
7. Media dikeluarkan dari inspisator dan didiamkan sampai suhu kamar. Bila
kualitas media tidak baik (terjadi perubahan-perubahan warna, berlubang-
lubang atau terdapat gelembung-gelembung pada permukaan) maka media
tersebut tidak dapat dipakai.
8. Sebelum dipakai media LJ terlebih dahulu diuji kekenyalan dengan
dipukul-pukulkan ketelapak tangan, uji sterilisasi dengan menginkubasi
media pada suhu ruang 1x24 jam, dan beberapa media (5%) di inkubasi di
inkubator pada suhu 370C selama 1x24 jam.
B. Sub-Kultur Isolat MDR-TB
prosedur di Instalasi Mikrobiologi Klinik RSUP Sanglah Denpasar)
1. Stok isolat MDR-TB, diambil dari penyimpanan -800C, diambil sebanyak
100 ul.
2. Masukkan ke dalam NaCl steril yang berisi glass beads dan divortex.
3. Teteskan sebanyak 3 tetes suspensi pada media LJ yang telah disiapkan.
37
4. Tutup tabung McCartney, lalu inkubasi media LJ pada posisi miring selama
1x24 jam, setelah itu media LJ ditegakkan. Inkubasi dilakukan selama 3
minggu.
C. Ekstraksi DNA MDR-TB
prosedur di Laboratorium Mikrobiologi Fakultas Kedokteran Universitas Udayana)
1. Setelah sub kultur selama 3 minggu, sebanyak 1 ose koloni bakteri
diambil.
2. Masukkan koloni bakteri ke dalam tabung eppendorf 1,5 ml yang sudah
berisi 1 ml cairan Phospat Buffered Saline (PBS).
3. Ekstraksi dilakukan dengan menggunakan kit dari Wizard Genomic DNA
Extraction Kit, sesuai dengan petunjuk perusahaan.
D. Optimasi PCR
1. Mencuci tangan dan menggunakan APD kemudian mengambil 5 tube yang
berisi sampel dari kulkas dan dibawa ke dalam ruang isolasi. Selain itu,
dipersiapkan juga master mix, H2O, Primer embB F dan embB R dari dalam
kulkas ruang mix.
2. Membuat master mix PCR sesuai resep dari dalam ruang mix. Sebelumnya,
bersihkan meja serta alat-alat dengan alcohol 70% dan gunakan APD.
3. Menggosokkan master mix, H2O, dan primer diantara kedua telapak tangan
agar tidak terdapat bekuan es dalam tube.
4. Mengambil 1 tube kemudian mengisi sesuai formula 6 reaksi yang telah
dibuat untuk 5 sampel dan 1 kontrol negatif
5. Memasukkan master mix 30 µl dengan pipet 100 µl dan tip 100 µl,
kemudian membuang tip ke tempat sampah medis. Dilanjutkan dengan
primer embB F sebanyak 4,8 µl dengan pipet 10 µl, tip 10 µl dan membuang
tip setelahnya. Lalu, masukkan primer embB R sebanyak 4,8 µl dengan pipet
10 µl dan tip 10 µl. Masukkan H2O sebanyak 15,6 µl dengan pipet 20 µl dan
tip 20 µl dan dibuang setelahnya.
6. Tube dan mix PCR dihomogenkan dengan menggunakan pipet 20 µl dan tip
20 µl. Setelah dihomogenkan, disiapkan 5 tube lalu beri label 1E, 2E, 3E,
…… dst, dan -E (sebagai kontrol negatif).
38
7. Memindahkan mix PCR sebanyak 9,2 µl dengan pipet 10 µl dan tip 10 µl ke
tube 1E, 2E, 3E, …… dst. Kemudian mix PCR yang tersisa digunakan
sebagai kontrol negatif.
8. Membersihkan meja serta alat-alat yang digunakan dengan alcohol 70% dan
meletakkannya ke tempat semula.
9. Meletakkan master mix, H2O, primer embB F dan embB R ke dalam kulkas
ruang mix.
10. Melepaskan APD dari ruang mix.
11. Menggunakan APD yang disediakan diruang isolasi. Area yang akan
digunakan serta pipet sudah dibersihkan saat akan memasukan 5 sampel.
12. Mengambil 0,8 µl DNA mycobacterium tuberculosis dari tiap tube sampel
kemudian dipindahkan ke tube yang berlabel 1E, 2E, 3E, …… dst dengan
menggunakan pipet 0,2-20 µl dan tip 20 µl. label -E tidak ditambahkan
DNA.
13. Membersihkan meja serta alat-alat yang digunakan dengan alkohol 70% dan
meletakannya ke tempat semula.
14. Meletakan kembali 5 sampel bakteri pada kotak pendingin lalu mix PCR
dibawa ke ruang PCR.
15. Masukan 6 tube PCR kedalam mesin PCR dengan suhu annealing 50oC
selama 2 jam dan 47 menit.
16. Rak yang telah digunakan dibersihkan dengan alkohol 70% dan
meletakannya ketempat semula.
Formula (Resep PCR)
1. Pembuatan primer kerja (work sheet) 50 µl, konsentrasi 10 µM. diambil dari
stok primer 100 µM.
V1 x N1 = V2 x N2
V1 x 100 µM = 50 µl x 10 µM
V1 = 500/100
V1 = 5 µl
Untuk membuat volume nya menjadi 50 µl, maka ditambahkan 45 µl
akuades (H2O).
39
2. Menghitung TM Primer
• embB F = 5’ – GGTGATATTCGGCTTCCT – 3’
TM = [(G + C) 4] + [(A + T) 2]
= [(5 + 4) 4] + [(2 + 7) 2]
= [(9) 4] + [(9) 2]
= 36 + 18
= 54
• embB R = 5’ – ATAGCGCGGTGATCAAAAAG – 3’
TM = [(G + C) 4] + [(A + T) 2]
= [(6 + 3) 4] + [(8 + 3) 2]
= [(9) 4] + [(11) 2]
= 36 + 22
= 58
• Rata-rata TM = (54 + 58) / 2 = 112 / 2 = 56
• Suhu annealing = TM - 5oC dan TM - 10oC
= 56 – 5 = 51oC
= 56 – 10 = 46oC
Jadi, rentang suhu annealing yaitu 46oC – 51oC
3. Menghitung larutan reaksi
(Jika ingin melakukan PCR pada 5 sampel, maka reaksi ditambahkan 1
untuk kontrol negatif. Begitupun jika dilakukan pada 15 sampel, maka
reaksi menjadi 11x)
• PCR Master Mix (MM) = 5 µl 30 µl
• Primer embB F (0,8 µM) = 0,8 µl 4,8 µl
• Primer embB R (0,8 µM) = 0,8 µl 4,8 µl
• H2O = 2,6 µl 15,6 µl
----------------- + -------------- +
9,2 µl ……
• DNA = 0,8 µl ……
----------------- + -------------- +
10 µl 60 µl
40
4. Reaksi PCR
• Pre-denaturasi : 95oC selama 3 menit (1x reaksi)
• Denaturasi : 95oC selama 1 menit
• Annealing : 50oC selama 1 menit (35x reaksi)
• Ekstensi : 72oC selama 1 menit
• Final Ekstensi : 72oC selama 5 menit (1x reaksi)
E. Elektroforesis
1. Mencuci tangan dan menggunakan APD
2. Membuat agarose 1% dengan menimbang bubuk agarose 0,35 gram dan
mengukur TBE 1x sebanyak 35 ml. Setelah itu, dituangkan bubuk agarose
dan TBE 1x ke dalam tabung Erlenmeyer.
3. Memasukkan tabung Erlenmeyer ke microwave dan mengoperasikannya
dengan menekan tombol power sebanyak 2x dilanjutkan dengan menekan
tombol 1 min sebanyak 1x. Kemudian menekan tombol start.
4. Menunggu selama 1 menit kemudian keluarkan tabung dengan sarung
tangan.
5. Menunggu hingga tabung terasa hangat tidak terlalu panas kurang lebih
selama 5 menit sembari menyiapkan plate agar serta sisir agar line well.
6. Menambahkan 1 µl gel red dengan menggunakan pipet 0,2-2 µl dan tip 20
µl ke dalam tabung Erlenmeyer. Buang tip ke tempat sampah medis.
7. Menuangkan campuran ke dalam plate agar lalu tunggu selama 20-30 menit.
8. Menyiapkan mesin elektroforesis dengan menuangkan TBE 0,5x hingga
mencapai bahu mesin.
9. Setelah gel mengeras, dibersihkan dari sisa gel lalu letakkan ke mesin.
10. Mengisi sumur dengan mix PCR sebanyak 2 µl dengan pipet 10 µl dan tip
10 µl. Sumur paling pertama diisi dengan marker sebanyak 2 µl. Sumur
kedua diisi dengan tube kontrol negatif, sumur ketiga dan seterusnya diisi
dengan tube 1E, 2E, dst.
11. Menutup mesin elektroforesis dilanjutkan mengoperasikan mesin dengan
menekan tombol on lalu diatur tegangannyamenjadi 100 Volt selama 35
menit. Menekan run/start dan menunggu selama 35 menit.
12. Membersihkan plate dan pipet.
41
13. Setelah selesai, gel diletakkan pada mesin UV dan dapat dilihat hasil
elektroforesisnya.
14. Foto hasil elektroforesisnya dan gel agarosa dibuang ke tempat sampah
medis.
15. Membersihkan meja serta alat-alat yang digunakan dengan alcohol 70% dan
meletakkannya ke tempat semula dilanjutkan melepaskan APD.
42
Lampiran 3. Interpretasi Hasil PCR
A. Rabu, 4 Juli 2018

K(-) P102 P115 P154 P011 P69 Mark
PCR pertama dilakukan dengan suhu annealing 50oC, terbentuk pita pada
kelima sampel, namun pada sampel P011 pita yang terbentuk sangat tipis. Hasil
elektroforesis diatas menunjukkan bahwa kelima sampel positif.
B. Senin, 9 Juli 2018
Mark P80 P82 P52 P22 106 86I P84 P052 105 131
PCR sebelumnya tidak ada kendala dan suhu annealing yang digunakan sudah
dianggap sesuai yaitu 50oC, sehingga dilanjutkan untuk melakukan
elektroforesis pada produk PCR 10 sampel lainnya. Sesuai dengan gambar hasil
43
elektroforesis diatas didapatkan hasil negatif pada sampel P52. Oleh karena itu
pada sampel tersebut perlu untuk dilakukan pengulangan.
C. Rabu, 18 Juli 2018
1 2 3 4 5 K(-)
3000
800
500
100
PCR dan elektroforesis dilakukan pada sampel P102 (lane 1), P115 (lane 2),
P154 (lane 3), P69 (lane 4), dan 131 (lane 5) yang kemudian dikirimkan untuk
dilakukan sekuensing di 1st base Malaysia.
D. Kamis, 1 November 2018
134 P50 P07 P106 P153 P05 P55 P72 P151 P31 P123 Mark
P36/26?
P43 P34 P124 Mark
44
PCR kali ini dilakukan pada 15 sampel lainnya yang berbeda dengan yang
sebelum-sebelumnya. PCR dilakukan dengan suhu annealing 50oC. Setalah di
elektroforesis muncul hasil bahwa pada sampel 134, P07, P55, P31, dan P124
adalah negatif. Sehingga akan pengulangan bersamaan dengan sampel P52 yang
juga negatif pada elektroforesis sebelumnya.
E. Selasa, 6 November 2018
Mark K(-) P52 134 P07 P55 P31 P124
Hasil elektroforesis diatas merupakan hasil dari 6 sampel yang sebelumnya

dinyatakan negatif. Setelah dilakukan pengulangan masih didapatkan hasil yang
negatif pada sampel P31 dan P124. Sementara pada sampel P07 dan P55 pita
yang tampak sangat tipis. Dikarenakan hasil dari keempat sampel belum baik
maka dilakukan pengulangan sekali lagi dengan diencerkan sebanyak 5 kali.
F. Kamis, 8 November 2018
Mark P07 P55 P31 P124
45
Setelah dilakukan pengenceran sebanyak 5 kali pada sampel P07, P55, dan P31,
maka dilakukan elektroforesis kembali dan didapatkan hasil seperti pada
gambar. Pada sampel P124 tidak dilakukan pengenceran namun pada PCR kali
ini pita berhasil tampak. Namun, pita yang tampak berada dibawah batas target
yaitu 799 bp sehingga sampel P124 dinyatakan negatif. Sementara sampel P07,
P55, dan P31 adalah positif.
46
Lampiran 4. Kromatogram Hasil Sekuensing
A. Kromatogram hasil sekuensing sampel P102
B. Kromatogram hasil sekuensing sampel P115
47
C. Kromatogram hasil sekuensing sampel P154
D. Kromatogram hasil sekuensing sampel P69
E. Kromatogram hasil sekuensing sampel 131
48
Kromatogram hasil sekuensing dari kelima sampel setelah diteliti tidak
ditemukan puncak ganda ataupun noise di bawah. Dapat disimpulkan bahwa kelima
kromatogram baik.
49
Lampiran 5. Hasil aligntment nukleotida sampel dengan gen embB dari M. tb
H37Rv
1 ------------------------------------------------------------
Mycobacterium ATGACACAGTGCGCGAGCAGACGCAAAAGCACCCCAAATCGGGCGATTTTGGGGGCTTTT
2 ------------------------------------------------------------
3 ------------------------------------------------------------
5 ------------------------------------------------------------
4 ------------------------------------------------------------
1 ------------------------------------------------------------
Mycobacterium GCGTCTGCTCGCGGGACGCGCTGGGTGGCCACCATCGCCGGGCTGATTGGCTTTGTGTTG
2 ------------------------------------------------------------
3 ------------------------------------------------------------
5 ------------------------------------------------------------
4 ------------------------------------------------------------
1 ------------------------------------------------------------
Mycobacterium TCGGTGGCGACGCCGCTGCTGCCCGTCGTGCAGACCACCGCGATGCTCGACTGGCCACAG
2 ------------------------------------------------------------
3 ------------------------------------------------------------
5 ------------------------------------------------------------
4 ------------------------------------------------------------
1 ------------------------------------------------------------
Mycobacterium CGGGGGCAACTGGGCAGCGTGACCGCCCCGCTGATCTCGCTGACGCCGGTCGACTTTACC
2 ------------------------------------------------------------
3 ------------------------------------------------------------
5 ------------------------------------------------------------
4 ------------------------------------------------------------
1 ------------------------------------------------------------
Mycobacterium GCCACCGTGCCGTGCGACGTGGTGCGCGCCATGCCACCCGCGGGCGGGGTGGTGCTGGGC
2 ------------------------------------------------------------
3 ------------------------------------------------------------
5 ------------------------------------------------------------
4 ------------------------------------------------------------
1 ------------------------------------------------------------
Mycobacterium ACCGCACCCAAGCAAGGCAAGGACGCCAATTTGCAGGCGTTGTTCGTCGTCGTCAGCGCC
2 ------------------------------------------------------------
3 ------------------------------------------------------------
5 ------------------------------------------------------------
4 ------------------------------------------------------------
1 ------------------------------------------------------------
Mycobacterium CAGCGCGTGGACGTCACCGACCGCAACGTGGTGATCTTGTCCGTGCCGCGCGAGCAGGTG
2 ------------------------------------------------------------
3 ------------------------------------------------------------
5 ------------------------------------------------------------
4 ------------------------------------------------------------
1 ------------------------------------------------------------
Mycobacterium ACGTCCCCGCAGTGTCAACGCATCGAGGTCACCTCTACCCACGCCGGCACCTTCGCCAAC
2 ------------------------------------------------------------
3 ------------------------------------------------------------
5 ------------------------------------------------------------
4 ------------------------------------------------------------
1 ------------------------------------------------------------
Mycobacterium TTCGTCGGGCTCAAGGACCCGTCGGGCGCGCCGCTGCGCAGCGGCTTCCCCGACCCCAAC
2 ------------------------------------------------------------
3 ------------------------------------------------------------
5 ------------------------------------------------------------
50
4 ------------------------------------------------------------
1 ------------------------------------------------------------
Mycobacterium CTGCGCCCGCAGATTGTCGGGGTGTTCACCGACCTGACCGGGCCCGCGCCGCCCGGGCTG
2 ------------------------------------------------------------
3 ------------------------------------------------------------
5 ------------------------------------------------------------
4 ------------------------------------------------------------
1 ------------------------------------------------------------
Mycobacterium GCGGTCTCGGCGACCATCGACACCCGGTTCTCCACCCGGCCGACCACGCTGAAACTGCTG
2 ------------------------------------------------------------
3 ------------------------------------------------------------
5 ------------------------------------------------------------
4 ------------------------------------------------------------
1 ------------------------------------------------------------
Mycobacterium GCGATCATCGGGGCGATCGTGGCCACCGTCGTCGCACTGATCGCGTTGTGGCGCCTGGAC
2 ------------------------------------------------------------
3 ------------------------------------------------------------
5 ------------------------------------------------------------
4 ------------------------------------------------------------
1 ------------------------------------------------------------
Mycobacterium CAGTTGGACGGGCGGGGCTCAATTGCCCAGCTCCTCCTCAGGCCGTTCCGGCCTGCATCG
2 ------------------------------------------------------------
3 ------------------------------------------------------------
5 ------------------------------------------------------------
4 ------------------------------------------------------------
1 ------------------------------------------------------------
Mycobacterium TCGCCGGGCGGCATGCGCCGGCTGATTCCGGCAAGCTGGCGCACCTTCACCCTGACCGAC
2 ------------------------------------------------------------
3 ------------------------------------------------------------
5 ------------------------------------------------------------
4 ------------------------------------------------------------
1 TTTGGTGATTATTTTCGCTTCCTGCTCTGGCATGTCATCGGCGCGAATTCGTCGGACGAC
Mycobacterium GCCGTGGTGATATTCGGCTTCCTGCTCTGGCATGTCATCGGCGCGAATTCGTCGGACGAC
2 ----------------GCTTCCTGCTCTGGCATGTCATCGGCGCGAATTCGTCGGACGAC
********************************************
1 GGCTACATCCTGGGCATGGCCCGAGTCGCCGACCACGCCGGCTACATGTCCAACTATTTC
Mycobacterium GGCTACATCCTGGGCATGGCCCGAGTCGCCGACCACGCCGGCTACATGTCCAACTATTTC
4 GGCTACATCCTGGGCGTGGCCCGAGTCGCCGACCACGCCGGCTACATGTCCAACTATTTC
*************** ********************************************
1 CGCTGGTTCGGCAGCCCGGAGGATCCCTTCGGCTGGTATTACAACCTGCTGGCGCTGATG
Mycobacterium CGCTGGTTCGGCAGCCCGGAGGATCCCTTCGGCTGGTATTACAACCTGCTGGCGCTGATG
************************************************************
1 ACCCATGTCAGCGACGCCAGTCTGTGGATGCGCCTGCCAGACCTGGCCGCCGGGCTAGTG
Mycobacterium ACCCATGTCAGCGACGCCAGTCTGTGGATGCGCCTGCCAGACCTGGCCGCCGGGCTAGTG
************************************************************
51
1 TGCTGGCTGCTGCTGTCGCGTGAGGTGCTGCCCCGCCTCGGGCCGGCGGTGGAGGCCAGC
Mycobacterium TGCTGGCTGCTGCTGTCGCGTGAGGTGCTGCCCCGCCTCGGGCCGGCGGTGGAGGCCAGC
************************************************************
1 AAACCCGCCTACTGGGCGGCGGCCATGGTCTTGCTGACCGCGTGGATGCCGTTCAACAAC
Mycobacterium AAACCCGCCTACTGGGCGGCGGCCATGGTCTTGCTGACCGCGTGGATGCCGTTCAACAAC
************************************************************
1 GGCCTGCGGCCGGAGGGCATCATCGCGCTCGGCTCGCTGGTCACCTATGTGCTGATCGAG
Mycobacterium GGCCTGCGGCCGGAGGGCATCATCGCGCTCGGCTCGCTGGTCACCTATGTGCTGATCGAG
************************************************************
1 CGGTCCATGCGGTACAGCCGGCTCACACCGGCGGCGCTGGCCGTCGTTACCGCCGCATTC
Mycobacterium CGGTCCATGCGGTACAGCCGGCTCACACCGGCGGCGCTGGCCGTCGTTACCGCCGCATTC
************************************************************
1 ACACTGGGTGTGCAGCCCACCGGCCTGATCGCGGTGGCCGCGCTGGTGGCCGGCGGCCGC
Mycobacterium ACACTGGGTGTGCAGCCCACCGGCCTGATCGCGGTGGCCGCGCTGGTGGCCGGCGGCCGC
************************************************************
1 CCGATGCTGCGGATCTTGGTGCGCCGTCATCGCCTGGTCGGCACGTTGCCGTTGGTGTCG
Mycobacterium CCGATGCTGCGGATCTTGGTGCGCCGTCATCGCCTGGTCGGCACGTTGCCGTTGGTGTCG
************************************************************
1 CCGATGCTGGCCGCCGGCACCGTCATCCTGACCGTGGTGTTCGCCGACCAGACCCTGTCA
Mycobacterium CCGATGCTGGCCGCCGGCACCGTCATCCTGACCGTGGTGTTCGCCGACCAGACCCTGTCA
************************************************************
1 ACGGTGTTGGAAGCCACCAGGGTTCGCGCCAAAATCGGGCCGAGCCAGGCGTGGTATACC
Mycobacterium ACGGTGTTGGAAGCCACCAGGGTTCGCGCCAAAATCGGGCCGAGCCAGGCGTGGTATACC
************************************************************
1 GAGAACCTGCGTTACTACTACCTCATCCTGCCCACCGTCGACG-----------------
Mycobacterium GAGAACCTGCGTTACTACTACCTCATCCTGCCCACCGTCGACGGTTCGCTGTCGCGGCGC
*******************************************
1 ------------------------------------------------------------
52
Mycobacterium TTCGGCTTTTTGATCACCGCGCTATGCCTGTTCACCGCGGTGTTCATCATGTTGCGGCGC
2 ------------------------------------------------------------
3 ------------------------------------------------------------
5 ------------------------------------------------------------
4 ------------------------------------------------------------
1 ------------------------------------------------------------
Mycobacterium AAGCGAATTCCCAGCGTGGCCCGCGGACCGGCGTGGCGGCTGATGGGCGTCATCTTCGGC
2 ------------------------------------------------------------
3 ------------------------------------------------------------
5 ------------------------------------------------------------
4 ------------------------------------------------------------
1 ------------------------------------------------------------
Mycobacterium ACCATGTTCTTCCTGATGTTCACGCCCACCAAGTGGGTGCACCACTTCGGGCTGTTCGCC
2 ------------------------------------------------------------
3 ------------------------------------------------------------
5 ------------------------------------------------------------
4 ------------------------------------------------------------
1 ------------------------------------------------------------
Mycobacterium GCCGTAGGGGCGGCGATGGCCGCGCTGACGACGGTGTTGGTATCCCCATCGGTGCTGCGC
2 ------------------------------------------------------------
3 ------------------------------------------------------------
5 ------------------------------------------------------------
4 ------------------------------------------------------------
1 ------------------------------------------------------------
Mycobacterium TGGTCGCGCAACCGGATGGCGTTCCTGGCGGCGTTATTCTTCCTGCTGGCGTTGTGTTGG
2 ------------------------------------------------------------
3 ------------------------------------------------------------
5 ------------------------------------------------------------
4 ------------------------------------------------------------
1 ------------------------------------------------------------
Mycobacterium GCCACCACCAACGGCTGGTGGTATGTCTCCAGCTACGGTGTGCCGTTCAACAGCGCGATG
2 ------------------------------------------------------------
3 ------------------------------------------------------------
5 ------------------------------------------------------------
4 ------------------------------------------------------------
1 ------------------------------------------------------------
Mycobacterium CCGAAGATCGACGGGATCACAGTCAGCACAATCTTTTTCGCCCTGTTTGCGATCGCCGCC
2 ------------------------------------------------------------
3 ------------------------------------------------------------
5 ------------------------------------------------------------
4 ------------------------------------------------------------
1 ------------------------------------------------------------
Mycobacterium GGCTATGCGGCCTGGCTGCACTTCGCGCCCCGCGGCGCCGGCGAAGGGCGGCTGATCCGC
2 ------------------------------------------------------------
3 ------------------------------------------------------------
5 ------------------------------------------------------------
4 ------------------------------------------------------------
1 ------------------------------------------------------------
Mycobacterium GCGCTGACGACAGCCCCGGTACCGATCGTGGCCGGTTTCATGGCGGCGGTGTTCGTCGCG
2 ------------------------------------------------------------
3 ------------------------------------------------------------
5 ------------------------------------------------------------
4 ------------------------------------------------------------
1 ------------------------------------------------------------
Mycobacterium TCCATGGTGGCCGGGATCGTGCGACAGTACCCGACCTACTCCAACGGCTGGTCCAACGTG
2 ------------------------------------------------------------
53
3 ------------------------------------------------------------
5 ------------------------------------------------------------
4 ------------------------------------------------------------
1 ------------------------------------------------------------
Mycobacterium CGGGCGTTTGTCGGCGGCTGCGGACTGGCCGACGACGTACTCGTCGAGCCTGATACCAAT
2 ------------------------------------------------------------
3 ------------------------------------------------------------
5 ------------------------------------------------------------
4 ------------------------------------------------------------
1 ------------------------------------------------------------
Mycobacterium GCGGGTTTCATGAAGCCGCTGGACGGCGATTCGGGTTCTTGGGGCCCCTTGGGCCCGCTG
2 ------------------------------------------------------------
3 ------------------------------------------------------------
5 ------------------------------------------------------------
4 ------------------------------------------------------------
1 ------------------------------------------------------------
Mycobacterium GGTGGAGTCAACCCGGTCGGCTTCACGCCCAACGGCGTACCGGAACACACGGTGGCCGAG
2 ------------------------------------------------------------
3 ------------------------------------------------------------
5 ------------------------------------------------------------
4 ------------------------------------------------------------
1 ------------------------------------------------------------
Mycobacterium GCGATCGTGATGAAACCCAACCAGCCCGGCACCGACTACGACTGGGATGCGCCGACCAAG
2 ------------------------------------------------------------
3 ------------------------------------------------------------
5 ------------------------------------------------------------
4 ------------------------------------------------------------
1 ------------------------------------------------------------
Mycobacterium CTGACGAGTCCTGGCATCAATGGTTCTACGGTGCCGCTGCCCTATGGGCTCGATCCCGCC
2 ------------------------------------------------------------
3 ------------------------------------------------------------
5 ------------------------------------------------------------
4 ------------------------------------------------------------
1 ------------------------------------------------------------
Mycobacterium CGGGTACCGTTGGCAGGCACCTACACCACCGGCGCACAGCAACAGAGCACACTCGTCTCG
2 ------------------------------------------------------------
3 ------------------------------------------------------------
5 ------------------------------------------------------------
4 ------------------------------------------------------------
1 ------------------------------------------------------------
Mycobacterium GCGTGGTATCTCCTGCCTAAGCCGGACGACGGGCATCCGCTGGTCGTGGTGACCGCCGCG
2 ------------------------------------------------------------
3 ------------------------------------------------------------
5 ------------------------------------------------------------
4 ------------------------------------------------------------
1 ------------------------------------------------------------
Mycobacterium GGCAAGATCGCCGGCAACAGCGTGCTGCACGGGTACACCCCCGGGCAGACTGTGGTGCTC
2 ------------------------------------------------------------
3 ------------------------------------------------------------
5 ------------------------------------------------------------
4 ------------------------------------------------------------
1 ------------------------------------------------------------
Mycobacterium GAATACGCCATGCCGGGACCCGGAGCGCTGGTACCCGCCGGGCGGATGGTGCCCGACGAC
2 ------------------------------------------------------------
3 ------------------------------------------------------------
5 ------------------------------------------------------------
54
4 ------------------------------------------------------------
1 ------------------------------------------------------------
Mycobacterium CTATACGGAGAGCAGCCCAAGGCGTGGCGCAACCTGCGCTTCGCCCGAGCAAAGATGCCC
2 ------------------------------------------------------------
3 ------------------------------------------------------------
5 ------------------------------------------------------------
4 ------------------------------------------------------------
1 ------------------------------------------------------------
Mycobacterium GCCGATGCCGTCGCGGTCCGGGTGGTGGCCGAGGATCTGTCGCTGACACCGGAGGACTGG
2 ------------------------------------------------------------
3 ------------------------------------------------------------
5 ------------------------------------------------------------
4 ------------------------------------------------------------
1 ------------------------------------------------------------
Mycobacterium ATCGCGGTGACCCCGCCGCGGGTACCGGACCTGCGCTCACTGCAGGAATATGTGGGCTCG
2 ------------------------------------------------------------
3 ------------------------------------------------------------
5 ------------------------------------------------------------
4 ------------------------------------------------------------
1 ------------------------------------------------------------
Mycobacterium ACGCAGCCGGTGCTGCTGGACTGGGCGGTCGGTTTGGCCTTCCCGTGCCAGCAGCCGATG
2 ------------------------------------------------------------
3 ------------------------------------------------------------
5 ------------------------------------------------------------
4 ------------------------------------------------------------
1 ------------------------------------------------------------
Mycobacterium CTGCACGCCAATGGCATCGCCGAAATCCCGAAGTTCCGCATCACACCGGACTACTCGGCT
2 ------------------------------------------------------------
3 ------------------------------------------------------------
5 ------------------------------------------------------------
4 ------------------------------------------------------------
1 ------------------------------------------------------------
Mycobacterium AAGAAGCTGGACACCGACACGTGGGAAGACGGCACTAACGGCGGCCTGCTCGGGATCACC
2 ------------------------------------------------------------
3 ------------------------------------------------------------
5 ------------------------------------------------------------
4 ------------------------------------------------------------
1 ------------------------------------------------------------
Mycobacterium GACCTGTTGCTGCGGGCCCACGTCATGGCCACCTACCTGTCCCGCGACTGGGCCCGCGAT
2 ------------------------------------------------------------
3 ------------------------------------------------------------
5 ------------------------------------------------------------
4 ------------------------------------------------------------
1 ------------------------------------------------------------
Mycobacterium TGGGGTTCCCTGCGCAAGTTCGACACCCTGGTCGATGCCCCTCCCGCCCAGCTCGAGTTG
2 ------------------------------------------------------------
3 ------------------------------------------------------------
5 ------------------------------------------------------------
4 ------------------------------------------------------------
1 ---------------------------------------------------------
Mycobacterium GGCACCGCGACCCGCAGCGGCCTGTGGTCACCGGGCAAGATCCGAATTGGTCCATAG
2 ---------------------------------------------------------
3 ---------------------------------------------------------
5 ---------------------------------------------------------
4 ---------------------------------------------------------
55
Lampiran 6. Hasil aligntment protein sampel dengan gen embB dari M. tb H37Rv
Mycobacterium MTQCASRRKSTPNRAILGAFASARGTRWVATIAGLIGFVLSVATPLLPVVQTTAMLDWPQ
4 ------------------------------------------------------------
1 ------------------------------------------------------------
2 ------------------------------------------------------------
3 ------------------------------------------------------------
5 ------------------------------------------------------------
Mycobacterium RGQLGSVTAPLISLTPVDFTATVPCDVVRAMPPAGGVVLGTAPKQGKDANLQALFVVVSA
4 ------------------------------------------------------------
1 ------------------------------------------------------------
2 ------------------------------------------------------------
3 ------------------------------------------------------------
5 ------------------------------------------------------------
Mycobacterium QRVDVTDRNVVILSVPREQVTSPQCQRIEVTSTHAGTFANFVGLKDPSGAPLRSGFPDPN
4 ------------------------------------------------------------
1 ------------------------------------------------------------
2 ------------------------------------------------------------
3 ------------------------------------------------------------
5 ------------------------------------------------------------
Mycobacterium LRPQIVGVFTDLTGPAPPGLAVSATIDTRFSTRPTTLKLLAIIGAIVATVVALIALWRLD
4 ------------------------------------------------------------
1 ------------------------------------------------------------
2 ------------------------------------------------------------
3 ------------------------------------------------------------
5 ------------------------------------------------------------
Mycobacterium QLDGRGSIAQLLLRPFRPASSPGGMRRLIPASWRTFTLTDAVVIFGFLLWHVIGANSSDD
4 --------------------------------------------XXFLLWHVIGANSSDD
1 ---------------------------------------XXGDYFRFLLWHVIGANSSDD
**************
Mycobacterium GYILGMARVADHAGYMSNYFRWFGSPEDPFGWYYNLLALMTHVSDASLWMRLPDLAAGLV
4 GYILGVARVADHAGYMSNYFRWFGSPEDPFGWYYNLLALMTHVSDASLWMRLPDLAAGLV
1 GYILGMARVADHAGYMSNYFRWFGSPEDPFGWYYNLLALMTHVSDASLWMRLPDLAAGLV
*****:******************************************************
Mycobacterium CWLLLSREVLPRLGPAVEASKPAYWAAAMVLLTAWMPFNNGLRPEGIIALGSLVTYVLIE
4 CWLLLSREVLPRLGPAVEASKPAYWAAAMVLLTAWMPFNNGLRPEGIIALGSLVTYVLIE
************************************************************
Mycobacterium RSMRYSRLTPAALAVVTAAFTLGVQPTGLIAVAALVAGGRPMLRILVRRHRLVGTLPLVS
4 RSMRYSRLTPAALAVVTAAFTLGVQPTGLIAVAALVAGGRPMLRILVRRHRLVGTLPLVS
************************************************************
Mycobacterium PMLAAGTVILTVVFADQTLSTVLEATRVRAKIGPSQAWYTENLRYYYLILPTVDGSLSRR
4 PMLAAGTVILTVVFADQTLSTVLEATRVRAKIGPSQAWYTENLRYYYLILPTVDX-----
56
******************************************************
Mycobacterium FGFLITALCLFTAVFIMLRRKRIPSVARGPAWRLMGVIFGTMFFLMFTPTKWVHHFGLFA
4 ------------------------------------------------------------
1 ------------------------------------------------------------
2 ------------------------------------------------------------
3 ------------------------------------------------------------
5 ------------------------------------------------------------
Mycobacterium AVGAAMAALTTVLVSPSVLRWSRNRMAFLAALFFLLALCWATTNGWWYVSSYGVPFNSAM
4 ------------------------------------------------------------
1 ------------------------------------------------------------
2 ------------------------------------------------------------
3 ------------------------------------------------------------
5 ------------------------------------------------------------
Mycobacterium PKIDGITVSTIFFALFAIAAGYAAWLHFAPRGAGEGRLIRALTTAPVPIVAGFMAAVFVA
4 ------------------------------------------------------------
1 ------------------------------------------------------------
2 ------------------------------------------------------------
3 ------------------------------------------------------------
5 ------------------------------------------------------------
Mycobacterium SMVAGIVRQYPTYSNGWSNVRAFVGGCGLADDVLVEPDTNAGFMKPLDGDSGSWGPLGPL
4 ------------------------------------------------------------
1 ------------------------------------------------------------
2 ------------------------------------------------------------
3 ------------------------------------------------------------
5 ------------------------------------------------------------
Mycobacterium GGVNPVGFTPNGVPEHTVAEAIVMKPNQPGTDYDWDAPTKLTSPGINGSTVPLPYGLDPA
4 ------------------------------------------------------------
1 ------------------------------------------------------------
2 ------------------------------------------------------------
3 ------------------------------------------------------------
5 ------------------------------------------------------------
Mycobacterium RVPLAGTYTTGAQQQSTLVSAWYLLPKPDDGHPLVVVTAAGKIAGNSVLHGYTPGQTVVL
4 ------------------------------------------------------------
1 ------------------------------------------------------------
2 ------------------------------------------------------------
3 ------------------------------------------------------------
5 ------------------------------------------------------------
Mycobacterium EYAMPGPGALVPAGRMVPDDLYGEQPKAWRNLRFARAKMPADAVAVRVVAEDLSLTPEDW
4 ------------------------------------------------------------
1 ------------------------------------------------------------
2 ------------------------------------------------------------
3 ------------------------------------------------------------
5 ------------------------------------------------------------
Mycobacterium IAVTPPRVPDLRSLQEYVGSTQPVLLDWAVGLAFPCQQPMLHANGIAEIPKFRITPDYSA
4 ------------------------------------------------------------
1 ------------------------------------------------------------
2 ------------------------------------------------------------
3 ------------------------------------------------------------
5 ------------------------------------------------------------
Mycobacterium KKLDTDTWEDGTNGGLLGITDLLLRAHVMATYLSRDWARDWGSLRKFDTLVDAPPAQLEL
4 ------------------------------------------------------------
1 ------------------------------------------------------------
2 ------------------------------------------------------------
3 ------------------------------------------------------------
5 ------------------------------------------------------------
57
Mycobacterium GTATRSGLWSPGKIRIGP
4 ------------------
1 ------------------
2 ------------------
3 ------------------
5 ------------------
58

Deteksi Mutasi Gen Embb Pada MDR-TB

Diunggah oleh

Informasi Dokumen

Judul Asli

Hak Cipta

Format Tersedia

Bagikan dokumen Ini

Bagikan atau Tanam Dokumen

Opsi Berbagi

Apakah menurut Anda dokumen ini bermanfaat?

Apakah konten ini tidak pantas?

Hak Cipta:

Format Tersedia

Deteksi Mutasi Gen Embb Pada MDR-TB

Diunggah oleh

Hak Cipta:

Format Tersedia

SKRIPSI

DETEKSI MUTASI GEN embB DARI ISOLAT KLINIS

ALIF ROCHMAH IZZATUL AZKA

PROGRAM STUDI SARJANA KEDOKTERAN DAN PROFESI

DETEKSI MUTASI GEN embB DARI ISOLAT KLINIS

ALIF ROCHMAH IZZATUL AZKA

PROGRAM STUDI SARJANA KEDOKTERAN DAN PROFESI

Lembar Persetujuan Pembimbing

SKRIPSI INI TELAH DISETUJUI

Dr. dr. Komang Januartha dr. Made Agus

Dr. dr. Komang Januartha Putra Pinatih, M.Kes

Panitia Penguji Skripsi adalah:

Ketua dr. Ni Nengah Dwi Fatmawati, S.Ked, Sp.MK, Ph.D

1. Dr. dr. Komang Januartha Putra Pinatih, M.Kes

2. dr. Made Agus Hendrayana, M.Ked

Denpasar, November 2018

Denpasar, 29 November 2018

Alif Rochmah Izzatul Azka

DETEKSI MUTASI GEN embB DARI ISOLAT KLINIS

Kata kunci: Tuberkulosis, M. tuberculosis, ethambutol, embB, mutasi

DETECTION OF embB GENE MUTATION FROM CLINICAL

Tuberculosis (TB) is an infectious disease that is still a concern of the world,

Keywords: Tuberculosis, M. tuberculosis, ethambutol, embB, mutation

DETEKSI MUTASI GEN embB DARI ISOLAT KLINIS

Tuberkulosis (TB) adalah penyakit menular yang disebabkan oleh

DETECTION OF embB GENE MUTATION FROM CLINICAL

Tuberculosis (TB) is an infectious disease caused by Mycobacterium

Gambar 2.1 Mycobacterium tuberculosis, SEM 5 µm............................................. 5

Lampiran 1. Daftar Sampel dan Hasil .................................................................... 36

1.1 Latar Belakang

Mycobacterium tuberculosis masih tinggi. Pada tahun 2014, diperkirakan terdapat

dibandingkan dengan perkiraan sebelumnya, berdasarkan hasil dari survei

(World Health Organization, 2015).

terakhir menunjukkan bahwa secara umum sudah terjadi peningkatan walaupun

Tuberkulosis (TB) dibagi menjadi 2 jenis, yaitu tuberkulosis paru dan

memberikan Obat Anti Tuberkulosis (OAT) sebagai upaya pencegahan penyebaran

lebih lanjut dari kuman Mycobacterium tuberculosis (Kementerian Kesehatan

pyrazinamide, dan ethambutol. Sedangkan OAT lini kedua meliputi streptomycin,

kanamycin, amikacin, capreomycin, ofloxacin, ethionamide, para-aminosalicylic

dari pemberian OAT yaitu Multidrug-Resistant Tuberculosis (MDR-TB). MDR-TB

merupakan resistensi terhadap setidaknya isoniazid dan rifampicin yang merupakan

inadekuatnya kadar terapeutik obat, terutama akibat ketidakpatuhan pasien selama

mengkonsumsi obat (Siregar, 2015).

111.000 orang memulai untuk melakukan pengobatan MDR-TB, angka tersebut

menunjukkan adanya peningkatan sebanyak 14% dibandingkan dengan tahun

pertama yang menunjukkan mulai terjadinya resistensi adalah ethambutol.

Ethambutol berfungsi untuk menghambat pembentukan komponen dinding sel

kuman M. tuberculosis yaitu arabinogalaktan, sehingga menghambat terjadinya

lini pertama (Irianti et al., 2016).

Mekanisme resistensi berperan penting dalam peningkatan resistensi

menegakkan metode pencegahan serta pengendalian resistensi antibioka dengan

pelaporan resistensi terhadap EMB di Instalasi Mikrobiologi Klinik Fakultas

Kedokteran Universitas Udayana/RSUP Sanglah hanya berdasarkan uji sensitivitas

obat sehingga hanya diketahui fenotifnya saja.

1.2 Rumusan Masalah

Mikrobiologi Klinik RSUP Sanglah Denpasar periode 2017 apabila dibandingkan

dengan genotip gen embB pada M. tuberculosis strain H37Rv?

1.3 Tujuan Penulisan

Untuk mengetahui perbedaan genotip gen embB dari isolat MDR-TB di

Instalasi Mikrobiologi Klinik RSUP Sanglah Denpasar periode 2017 apabila

dibandingkan dengan genotip gen embB pada M. tuberculosis strain H37Rv.

1.4 Manfaat Penulisan

1.4.1 Manfaat Teoritis