PROPOSAL

SKEMA PENELITIAN MAHASISWA S1

Judul Penelitian

DETEKSI MUTASI GEN embB DARI ISOLAT KLINIS MULTIDRUG

RESISTANT TUBERCULOSIS (MRD-TB) DI INSTALASI
LABORATORIUM MIKROBIOLOGI KLINIK RSUP SANGLAH
DENPASAR

Tim Peneliti
Alif Rochmah Izzatul Azka

Dosen Pembimbing:

Dr. dr. Komang Januartha Putra Pinatih, M.Kes

PROGRAM STUDI PENDIDIKAN DOKTER

FAKULTAS KEDOKTERAN UNIVERSITAS UDAYANA
Maret 2018
 PROPOSAL
SKEMA PENELITIAN MAHASISWA S1

Judul Penelitian

DETEKSI MUTASI GEN embB DARI ISOLAT KLINIS MULTIDRUG

RESISTANT TUBERCULOSIS (MRD-TB) DI INSTALASI
LABORATORIUM MIKROBIOLOGI KLINIK RSUP SANGLAH
DENPASAR

Tim Peneliti
Alif Rochmah Izzatul Azka

Dosen Pembimbing:

Dr. dr. Komang Januartha Putra Pinatih, M.Kes

PROGRAM STUDI PENDIDIKAN DOKTER

FAKULTAS KEDOKTERAN UNIVERSITAS UDAYANA
Maret 2018

i
 HALAMAN PENGESAHAN
SKEMA PENELITIAN MAHASISWA S1

Judul Penelitian : Deteksi Mutasi Gen embB dari Isolat Klinis Multidrug
Resistant Tuberculosis (MDR-TB) di Instalasi
Laboratorium Mikrobiologi Klinik RSUP Sanglah
Denpasar

Kode/Nama Rumpun Ilmu : 307/Ilmu Kedokteran (Akademik)

Ketua Peneliti :
a. Nama Lengkap : Alif Rochmah Izzatul Azka
b. NIM : 1502005057
c. Jabatan Fungsional : Peneliti Utama
d. Program Studi : Pendidikan Dokter
e. Nomor HP : 082144379622
f. Email : alifrochmahia@gmail.com

Pembimbing :
a. Nama Lengkap : Dr. dr. Komang Januartha Putra Pinatih, M.Kes
b. NIP : 19670122996011001
c. Jabatan Fungsional : Letkor Kepala
d. Program Studi : Pendidikan Dokter
e. Nomor HP : 08123831710
f. Email : Januartha_putra@unud.ac.id

Biaya penelitian keseluruhan: Rp7.240.000

Denpasar, 7 Maret 2018

Mengetahui, Peneliti utama,
Pembimbing

(Dr. dr. Komang Januartha Putra Pinatih, M.Kes) (Alif Rochmah Izzatul Azka)
NIP: 19670122996011001 NIM: 1502005057

Disetujui,

Koordinator Program Studi Dekan FK Unud

Pendidikan Dokter,

(Dr. dr. Komang Januartha (Dr. dr. I Ketut

Putra Pinatih, M.Kes) Suyasa, SpB, SpOT (K))
NIP: 19670122996011001 NIP: 196607091994121001

ii
 DAFTAR ISI
Halaman
SAMPUL DALAM ........................................................................................ i

HALAMAN PENGESAHAN. ........................................................................ii

DAFTAR ISI ............................................................................................... iii

RINGKASAN ..............................................................................................vi

BAB I PENDAHULUAN ............................................................................. 1

1.1 Latar Belakang .......................................................................... 1

1.2 Tujuan Penelitian....................................................................... 2

1.3 Manfaat Penelitian..................................................................... 2

BAB II KAJIAN PUSTAKA........................................................................ 3

2.1 Mycobacterium tuberculosis ..................................................... 3

2.2 Tuberkulosis .............................................................................. 3

2.2.1 Definisi ............................................................................ 3

2.2.2 Epidemiologi ................................................................... 4

2.2.3 Patogenesis .................................................................... 4

2.2.4 Pengobatan .................................................................... 5

2.3 Multidrug-Resistant Tuberculosis (MDR-TB) ............................ 5

2.4 Gen embB ................................................................................ 6

2.5 Media Loweinstein Jensen (LJ) ................................................ 7

2.6 Metode Analisis Molekuler ....................................................... 7

2.6.1 Ekstraksi DNA dan Polymerase Chain Reaction (PCR) .. 7

2.6.2 Elektroforesis .................................................................. 9

2.6.3 Sekuensing ..................................................................... 9

iii
BAB III METODOLOGI PENELITIAN ..................................................... 11

3.1 Jenis Penelitian ....................................................................... 11

3.2 Tempat dan Waktu Penelitian ................................................. 11

3.3 Variabel Penelitian .................................................................. 11

3.3.1 Identifikasi Variabel ....................................................... 11

3.3.2 Definisi Operasional Variabel ........................................ 11

3.4 Subjek Penelitian..................................................................... 11

3.4.1 Populasi dan Sampel Penelitian ................................... 12

3.4.2 Teknik Pengambilan Sampel ........................................ 12

3.4.3 Besar Sampel ............................................................... 12

3.5 Kriteria Sampel ........................................................................ 12

3.5.1 Kriteria Inklusi ............................................................... 12

3.5.2 Kriteria Eksklusi ............................................................ 12

3.6 Alat dan Bahan Penelitian ....................................................... 13

3.6.1 Alat Penelitian ............................................................... 13

3.6.2 Bahan Penelitian ........................................................... 13

3.7 Prosedur Penelitian ................................................................. 13

3.7.1 Pembuatan Media LJ .................................................... 13

3.7.2 Sub Kultur Isolat MDR-TB............................................. 13

3.7.3 Ekstraksi DNA MDR-TB ................................................ 14

3.7.4 PCR .............................................................................. 14

3.7.5 Elektroforesis ................................................................ 14

3.7.6 Sekuensing ................................................................... 14

3.8 Alur Penelitian ......................................................................... 15

3.9 Analisis Data ........................................................................... 15

iv
BAB IV BIAYA DAN JADWAL PENELITIAN……… ................................. 16

4.1 Biaya Penelitian....................................................................... 16

4.2 Jadwal Penelitian .................................................................... 16

DAFTAR PUSTAKA ................................................................................. 17

LAMPIRAN…………… ............................................................................. 19

v
 RINGKASAN PENELITIAN

Tuberkulosis (TB) merupakan penyakit menular yang hingga saat ini masih menjadi
perhatian dunia. Angka kematian dan kesakitan akibat infeksi kuman Mycobacterium
tuberculosis masih tinggi. Pada tahun 2014, diperkirakan terdapat 9,6 juta kasus kejadian
TB: 5,4 juta pada pria, 3,2 juta pada wanita dan 1,0 juta pada anak-anak dan diantaranya
muncul sebagai TB aktif. Pemberian obat anti tuberculosis (OAT) secara efektif dapat
menurunkan jumlah kesakitan, akan tetapi berbagai efek samping mulai muncul, seperti
munculnya galur bakteri yang tahan terhadap OAT, baik lini pertama maupun lini kedua
yang disebut dengan MDR- dan XDR-TB. Munculnya resistensi terhadap OAT dapat
terjadi karena adanya perubahan/mutasi pada beberapa gen penyandi protein yang
menjadi target dari OAT, salah satunya adalah gen embB yang menjadi target
ethambutol. Penelitian ini bertujuan untuk menganalisa genotif gen embB dari isolate
klinis MDR-TB di Instalasi Laboratorium Mikrobiologi Klinik RSUP Sanglah Denpasar.
Penelitian ini merupakan penelitian observasional deskriptif, dengan metode
pengambilan sampel untuk PCR secara convenient purposive sampling dan selanjutnya
dengan metode simple random sampling ditentukan 5 sampel yang akan disekuensing.
Deteksi gen embB dilakukan dengan metode PCR menggunakan primer spesifik, serta
pola mutasi dianalisa dari hasil sekuensing gen embB.
Kata kunci : MDR-TB, embB, Sanglah, PCR, Mutasi.

vi
 BAB I

PENDAHULUAN

1.1 Latar Belakang

Tuberkulosis (TB) merupakan penyakit menular yang hingga saat ini masih
menjadi perhatian dunia. Angka kematian dan kesakitan akibat infeksi kuman
Mycobacterium tuberculosis masih tinggi. Pada tahun 2014, diperkirakan terdapat 9,6
juta kasus kejadian TB: 5,4 juta pada pria, 3,2 juta pada wanita dan 1,0 juta pada anak-
anak. Angka total secara global mengalami kenaikan setelah adanya revisi dibandingkan
dengan perkiraan sebelumnya, berdasarkan hasil dari survei prevalensi nasional di
Indonesia. Saat ini diperkirakan ada sekitar 1 juta kasus TB baru setiap tahunnya di
Indonesia, dua kali dari tingkat perkiraan sebelumnya.1
Di Provinsi Bali, Case Notification Rate (CNR) selama kurun waktu 3 tahun
terakhir menunjukkan bahwa secara umum sudah terjadi peningkatan walaupun tidak
signifikan. Tahun 2012 CNR Provinsi Bali sebesar 71/100.000 penduduk dan pada tahun
2013 meningkat menjadi 74/100.000 penduduk, sedangkan tahun 2014 angka tersebut
tetap sebesar 74/100.000 penduduk.2
Tuberkulosis (TB) dibagi menjadi 2 jenis, yaitu tuberkulosis paru dan tuberkulosis
ekstra paru. Tuberkulosis paru adalah TB yang terjadi pada parenkim (jaringan) paru.
Sedangkan tuberkulosis ekstra paru adalah TB yang terjadi pada organ selain paru:
pleura, kelenjar limfe, abdomen, saluran kencing, kulit, sendi, selaput otak, dan tulang.
Pengobatan tuberkulosis dapat dilakukan dengan cara memberikan Obat Anti
Tuberkulosis (OAT) sebagai upaya pencegahan penyebaran lebih lanjut dari kuman
Mycobacterium tuberculosis.3 OAT dibagi menjadi dua golongan yaitu lini pertama dan
lini kedua, OAT golongan lini pertama meliputi isoniazid, rifampicin, pyrazinamide, dan
ethambutol. Sedangkan OAT lini kedua meliputi streptomycin, kanamycin, amikacin,
capreomycin, ofloxacin, ethionamide, para-aminosalicylic acid (PAS), dan rifabutin.4
Namun, pemberian OAT tersebut dapat memberikan efek samping ringan, sedang, dan
berat. Salah satu efek samping dari pemberian OAT yaitu Multidrug-Resistant
Tuberculosis (MDR-TB). MDR-TB dapat terjadi karena beberapa faktor, salah satunya
yaitu karena adanya suatu mutasi gen yang berperan dalam interaksi OAT dengan
targetnya pada M. tuberculosis.
Pada tahun 2014, sekitar 190.000 orang meninggal karena MDR-TB. Total
111.000 orang memulai untuk melakukan pengobatan MDR-TB, angka tersebut
menunjukkan adanya peningkatan sebanyak 14% dibandingkan dengan tahun
sebelumnya, 2013. Secara global, hanya 50% dari pasien MDR-TB yang berhasil
melakukan pengobatan1. Salah satu OAT lini pertama yang menunjukkan mulai
terjadinya resistensi adalah ethambutol. Ethambutol berfungsi untuk menghambat

1
pembentukan komponen dinding sel kuman M. tuberculosis yaitu arabinogalaktan,
sehingga menghambat terjadinya replikasi dari kuman M. tuberculosis. Resistensi
terhadap obat ini dikodekan oleh gen embB, beberapa penelitian melaporkan telah terjadi
mutasi pada beberapa titik disekuen gen embB dari isolat MDR-TB maupun yang masih
sensitif terhadap OAT lini pertama.

Mekanisme resistensi berperan penting dalam peningkatan resistensi antibiotika,

dalam hal ini adalah Obat Anti Tuberkulosis (OAT). Agar dapat menegakkan metode
pencegahan serta pengendalian resistensi antibioka dengan tepat, maka diperlukan
untuk mengetahui gen resisten yang terlibat. Oleh karena itu perlu dilakukan analisis gen
embB dari isolat MDR-TB mengingat bahwa saat ini pelaporan resistensi terhadap EMB
di Instalasi Mikrobiologi Klinik Fakultas Kedokteran Universitas Udayana/RSUP Sanglah
hanya berdasarkan uji sensitivitas obat sehingga hanya diketahui fenotifnya saja.

1.2 Tujuan Penulisan

1.2.1 Untuk mengetahui persentase isolat MDR-TB dari sampel penelitian yang
diisolasi dari sampel klinik di Instalasi Laboratorium Mikrobiologi Klinik RSUP
Sanglah Denpasar yang memiliki gen embB
1.2.2 Untuk mengetahui perbedaan genotip gen embB dari isolate MDR-TB dari
sampel penelitian yang diisolasi dari sampel klinik di Instalasi Mikrobiologi Klinik
RSUP Sanglah Denpasar yang telah dibandingkan dengan genotip gen embB di
genbank
1.3 Manfaat Penulisan

1.3.1 Manfaat Teoritis

1. Memberikan informasi dasar mengenai genotif gen embB dari isolate MDR-TB di
Instalasi Laboratorium Mikrobiologi Klinik RSUP Sanglah Denpasar
2. Dengan adanya penelitian ini maka dapat digunakan sebagai data dasar untuk
memprediksi sumber infeksi dan rantai penularan M. tuberculosis
3. Dapat digunakan sebagai data dasar penelitian lebih lanjut untuk
penanggulangan kasus MDR-TB

1.3.2 Manfaat Praktis

1. Bagi klinisi dengan menggunakan pemeriksaan molekuler untuk mengetahui

resistensi M. tuberculosis terhadap OAT memungkinkan hasil akurat dalam
waktu yang singkat
2. Bagi klinisi dapat digunakan untuk memprediksi perkembangan dari infeksi TB
pada pasien sehingga pengobatan menjadi lebih akurat

2
 BAB II

TINJAUAN PUSTAKA

2.1 Mycobacterium tuberculosis

Mycobacterium tuberculosis adalah bakteri tahan asam, yang dapat membentuk

kompleks acid-stable ketika pewarna arylmethane tertentu ditambahkan. Semua spesies
mikobakteri memiliki struktur ropelike peptidoglikan yang disusun sedemikian rupa untuk
memberi mereka sifat dari bakteri tahan asam. Mycobacteria banyak ditemukan di tanah
dan air, tetapi M. tuberculosis terutama diidentifikasi sebagai patogen yang hidup di
inang. Beberapa spesies di kompleks M. tuberculosis telah beradaptasi struktur genetik
mereka secara khusus untuk menginfeksi populasi manusia.5

M. tuberculosis dapat diisolasi di laboratorium dan disimpan pada -80° untuk

dipelajari secara ekstensif, dan strain yang paling umum digunakan M. tuberculosis
adalah strain H37Rv. (Medrano, Gala and Garcı, 2016) M. tuberculosis memiliki
kromosom sirkuler sekitar 4.200.000 panjang nukleotida.6

Gambar 2.1 Mycobacterium tuberculosis, SEM 5 µm 7

2.2 Tuberkulosis

2.2.1 Definisi

Tuberkulosis (TB) adalah penyakit yang disebabkan oleh kuman yang tersebar
dari manusia ke manusia lain melalui udara. TB biasanya mempengaruhi paru-paru,
tetapi juga dapat mempengaruhi bagian tubuh yang lain, seperti otak, ginjal, atau tulang
belakang. Seseorang yang menderita TB dapat meninggal dunia apabila mereka tidak
mendapatkan perawatan.8

Tuberkulosis (TB) merupakan penyakit kuno dengan sejarah yang berkaitan

dengan evolusi dan migrasi manusia, serta dengan asal-usul mikrobiologi. Agen etiologi

3
utama TB, Mycobacterium tuberculosis, diduga telah berevolusi sejak zaman nenek
moyang di Afrika Timur sekitar 3 juta tahun yang lalu.9

2.2.2 Epidemiologi

Berdasarkan data dari World Health Organization (WHO), pada tahun 2014, TB
telah membunuh 1,5 juta orang (1,1 juta HIV-negatif dan 0,4 juta HIV-positif). Korban
terdiri atas 890.000 pria, 480.000 wanita, dan 140.000 anak-anak. Korban meninggal
akibat menderita HIV pada tahun 2014 diperkirakan sekitar 1,2 juta orang, termasuk 0,4
juta orang lainnya merupakan penderita TB dengan HIV-positif. Di seluruh dunia, 9,6 juta
orang diperkirakan menderita penyakit TB pada tahun 2014: 5,4 juta pria, 3,2 juta wanita,
dan 1,0 juta anak-anak. Secara global, 12% dari 9,6 juta kasus TB merupakan HIV-
positif.1
India, Indonesia, dan China merupakan negara dengan jumlah kasus penderita
Tuberkulosis terbesar di dunia dengan persentase 23%, 10%, dan 10% dari total global
dimana Indonesia menduduki peringkat kedua sejajar dengan China.1 Di Provinsi Bali,
Case Notification Rate (CNR) selama kurun waktu 3 tahun terakhir menunjukkan bahwa
secara umum sudah terjadi peningkatan walaupun tidak signifikan. Tahun 2012 CNR
Provinsi Bali sebesar 71/100.000 penduduk dan pada tahun 2013 meningkat menjadi
74/100.000 penduduk, sedangkan tahun 2014 angka tersebut tetap sebesar 74/100.000
penduduk. Sedangkan Success Rate (SR) di Provinsi Bali pada tahun 2014 angka yang
dicapai sebesar 87,5%. Meskipun angka tersebut sudah diatas target Renstra Dinas
Kesehatan 2014-2018 sebesar 85%, namun masih belum mencapai target Renstra
Kemenkes tahun 2014 sebesar 88%.2
2.2.3 Patogenesis
Tuberkulosis (TB) adalah penyakit yang disebabkan oleh kuman Mycobacterium
tuberculosis. Secara umum infeksi tuberkulosis dapat terjadi apabila seseorang
menghirup droplet nuklei yang mengandung basil tuberkel yang mencapai alveoli paru-
paru. Basil tuberkel tersebut akan ditelan oleh makrofag alveolar, sebagian besar basil
tersebut dihancurkan atau dihambat. Sebagian kecil lainnya dapat berkembang biak
secara intraseluler dan dilepas ketika makrofag mati. Jika hidup, basil tersebut dapat
menyebar melalui saluran limfatik atau melalui aliran darah ke jaringan atau organ yang
lebih jauh (termasuk daerah tubuh dimana penyakit TB paling sering berkembang disana:
kelenjar getah bening regional, apeks paru, ginjal, otak, dan tulang). Proses penyebaran
tersebut memancing sistem kekebalan tubuh untuk respon sistemik. 10

Latent Tuberculosis Infection (LTBI) adalah ketika di dalam tubuh seorang

manusia terdapat basil tuberkel, tetapi sistem kekebalan tubuh masih menjaga basilus
tersebut dibawah kontrolnya dan masih dalam keadaan inaktif. Sistem kekebalan tubuh
dapat melakukan hal tersebut dengan cara memproduksi sel imun khusus yang

4
mengelilingi basil tuberkel. Sel-sel tersebut membentuk kulit yang berperan sebagai
dinding dan menjaga isi basilus dan inaktif. Seseorang yang memiliki LTBI tidak dapat
menularkan infeksi ke orang lain. Beberapa orang dengan LTBI akan berkembang
menjadi penyakit Tuberkulosis. Penyakit Tuberkulosis berkembang ketika sistem
kekebalan tubuh tidak dapat menjaga basil tuberkel dibawah kontrol dan basilus mulai
untuk berkembang biak dengan sangat cepat.11

2.2.4 Pengobatan

Pengobatan untuk Tuberkulosis membutuhkan waktu 6 bulan untuk menjalani

proses kemoterapi, dikelompokkan ke dalam fase intensif pengobatan selama 2 bulan
(dengan rifampicin, isoniazid, ethambutol, dan pyrazinamide) dan selanjutnya 4 bulan
dengan rifampicin dan isoniazid. Namun, pengobatan ini dianggap berat bagi pasien TB
dan penuh dengan masalah seperti kurangnya kepatuhan pasien, ketersediaan obat
yang buruk, dan efek samping dari obat itu sendiri.12

2.3 Multidrug-Resistant Tuberculosis (MDR-TB)

Resistensi terhadap OAT (Obat Anti Tuberkulosis) dibagi menjadi dua jenis :
MDR-TB dan XDR-TB. Multidrug-Resistant Tuberculosis (MDR-TB) didefinisikan sebagai
resistensi terhadap isoniazid dan rifampicin, dengan atau tanpa resisten terhadap obat
anti-TB lainnya. Sedangkan Extensively Drug Resistant Tuberculosis (XDR-TB)
didefinisikan sebagai resisten terhadap sekurang-kurangnya isoniazid dan rifampicin
(MDR-TB) ditambah resisten terhadap fluoroquinolone dan salah satu dari obat injeksi lini
kedua.13

Ethambutol merupakan obat lini pertama yang digunakan untuk mengobati

Tuberkulosis dan sering digunakan bersamaan dengan isoniazid dan rifampicin.
Ethambutol pertama kali diperkenalkan dalam pengobatan TB pada tahun 1966 dan
merupakan bagian dari rejimen lini pertama untuk mengobati penyakit tuberkulosis.
Ethambutol bersifat bakteriostatik dengan mengganggu biosintesis arabinogalaktan pada
dinding sel bakteri.14

Ethambutol (EMB) [(S,S’)–2,2’ (ethylenediimino) di–1–butanol] adalah obat lini

pertama yang digunakan dalam bentuk kombinasi dengan isoniazid (INH), rifampicin
(RMP), dan pyrazinamide (PZA) untuk mencegah munculnya resistensi obat. Minimum
Inhibitory Concentration (MIC) dari Ethambutol untuk Mycobacterium tuberculosis berada
pada kisaran 0,5-2 μg/ml. Ethambutol merupakan agen bakteriostatik yang aktif untuk
pertumbuhan basil dan tidak memiliki efek pada basil non-replikasi. Mekanisme kerja dari
Ethambutol yaitu dengan mengganggu biosintesis dari dinding sel arabinogalaktan.
Perilaku tersebut menghambat polimerisasi dinding sel arabinan dari arabinogalaktan

5
dan lipoarabinomannan, dan menginduksi akumulasi dari D-arabinofuranosyl-P-
decaprenol, perantara di biosintesis arabinan. Transferase arabinosil, suatu enzim yang
terlibat dalam sintesis arabinogalaktan, yang merupakan target dari Ethambutol di M.
tuberculosis dan M. avium.15

Gambar 2.2 Mekanisme kerja ethambutol 16

2.4 Gen embB

EMB bertindak melawan TB dengan menghambat pemindahan arabinosil yang
terkait dengan membran yang dikodekan oleh operon embCAB (termasuk embC, embA,
dan embB), yang terlibat dalam sintesis dinding sel arabinogalaktan.17 Gen embCAB M.
tuberculosis merupakan operon dengan besar 10 kbp yang mengkode transferase
arabinosil mikobakteri. Penelitian dengan menggunakan panel M. tuberculosis yang
terdiri dari isolat resisten ethambutol, ditemukan bahwa mendekati 50% mengalami
mutasi pada kodon 306 dari gen embB, perubahan gen terjadi karena adanya substitusi
asam amino pada embB yang tidak ditunjukkan pada isolat ethambutol sensitif.18
Frekuensi munculnya mutasi pada gen embB sebesar 105 dengan nilai MIC sebesar >
7,5 μg/mL.15

Rata-rata mutasi embB di 109 strain ethambutol resisten M. tuberculosis adalah

85,3% (93/109) tetapi hanya 15% (23/153) di strain ethambutol sensitive, dimana 17
berada di lokasi embB306. Pola mutasi embB lainnya juga ditemukan di kodon 328 (3),
354 (5), 406 (20), dan 497 (9) pada isolat resisten ethambutol dan kodon 246 (1), 307 (1),
318 (1), 336 (1), 406 (1), dan 439 (1) pada 153 isolat sensitif ethambutol. Sebelas isolat

6
memiliki mutasi ganda di isolat resisten ethambutol. Kodon wild type ATG di embB306
berubah menjadi GTG, CTG, TTG, ATA, ATT, atau ATC, yang mana GTG adalah yang
paling sering (39), diikuti oleh ATA (11), CTG (8), TTG (2), dan ATC (1). 19

2.5 Media Lowenstein-Jensen (LJ)

Media Lowenstein-Jensen (LJ) merupakan modifikasi dari media Lowenstein, di

modifikasi oleh Jensen. Jensen memodifikasi media dengan mengubah kandungan sitrat
dan fosfat, menghilangkan red dye congo, dan meningkatkan konsentrasi malachite
green. Media LJ biasanya digunakan di laboratorium klinis untuk mengisolasi organisme
tahan asam dari sumber steril dan nonsteril.20

Media LJ digunakan dengan telur segar dan gliserol untuk isolasi dan diferensiasi
Mycobacterium spp. Penggunaan media berbasis telur untuk isolasi utama mikobakteri
memiliki dua keuntungan yang signifikan. Pertama, media berbasis telur mendukung
berbagai macam mikobakteri. Kedua, pertumbuhan mikobakteri pada media telur bisa
digunakan untuk pengujian niasin. Likuifikasi media LJ dapat terjadi jika terkontaminasi. 20

Prinsip kerja dari Media LJ adalah sebagai berikut, L-Asparagine dan Potato
Flour adalah sumber nitrogen dan vitamin di Media LJ. Monopotasium Fosfat dan
Magnesium Sulfat meningkatkan pertumbuhan organisme dan bertindak sebagai
penyangga (buffer). Gliserol dan Suspensi Telur menyediakan asam lemak dan protein
yang dibutuhkan untuk metabolisme mikobakteri. Koagulasi albumin telur selama
sterilisasi memberikan media padat untuk keperluan inokulasi. Sodium Sitrat dan
Malachite Green adalah agen selektif untuk mencegah pertumbuhan sebagian besar
kontaminan dan memungkinkan pertumbuhan awal mikobakteri.20

Media LJ memiliki beberapa keterbatasan dalam prosedur kerjanya meliputi

adanya variasi nutrisi, dimana beberapa strain mungkin akan ditemui dalam keadaan
pertumbuhan yang buruk atau gagal tumbuh pada media. Sehingga tes lebih lanjut
sangat diperlukan untuk konfirmasi Mycobacterium spp.20

2.6 Metode Analisis Molekuler

2.6.1 Ekstraksi DNA dan Polymerase Chain Reaction (PCR)

Polymerase chain reaction (PCR) adalah suatu teknik ilmiah dalam biologi
molekular untuk mengamplifikasi satu atau beberapa salinan dari potongan DNA di
beberapa urutan besarnya, menghasilkan ribuan hingga jutaan salinan urutan DNA
tertentu. Polymerase chain reaction (PCR) dikembangkan pada tahun 1984 oleh seorang
ahli biokimia Amerika, Kary Mullis.21

7
 PCR dapat dilakukan dengan menggunakan DNA sumber dari berbagai jenis
jaringan dan organisme, termasuk darah tepi, kulit, rambut, air liur, dan mikroba. Hanya
jumlah DNA yang dibutuhkan untuk PCR untuk menghasilkan cukup banyak salinan yang
akan dianalisis dengan menggunakan metode konvensional laboratorium. Dalam hal ini,
PCR merupakan tes sensitif.22

Beberapa komponen yang diperlukan pada proses PCR yaitu DNA template,
primer, nukleotida, dan DNA polymerase. DNA polymerase merupakan key enzyme yang
menghubungkan nukleotida individu bersama untuk membentuk produk PCR. Nukleotida
meliputi empat basa – adenine (A), timin (T), sitosin (C), guanine (G) – yang ditemukan
didalam DNA. Nukleotida berperan sebagai building block yang digunakan oleh DNA
polymerase untuk menciptakan produk PCR yang dihasilkan. Primer merupakan suatu
oligonukleotida pendek yang mempunyai urutan nukleotida yang komplementer dengan
urutan nukleotida DNA templat. Primer dalam reaksi menentukan produk DNA yang tepat
untuk diamplifikasi. DNA template merupakan fragmen DNA yang akan diamplifikasi dan
berasal dari pathogen yang terdapat dalam specimen klinik dan dibuat melalui ekstraksi
DNA. Sampel untuk ekstraksi DNA bakteri M. tb diambil dari media tempat kultur bakteri
yaitu pada media LJ.22

Proses PCR terdiri dari beberapa tahapan : (1) pra-denaturasi DNA templat, (2)
denaturasi DNA templat, (3) penempelan primer pada templat (annealing), (4)
pemanjangan primer (extension) dan (5) pemantapan postextension). Pada tahap kedua
hingga keempat merupakan tahapan berulang (siklus), dimana pada setiap siklus terjadi
duplikasi jumlah DNA.23

Gambar 2.3 Tahapan proses PCR 23

8
2.6.2 Elektroforesis
Elektroforesis secara harfiah berarti berjalan di medan listrik. Molekul bermuatan
bergerak ke elektroda muatan balik tapi medan listrik dilepaskan sebelum mencapai
elektroda. Gerakan spesies bermuatan di medan listrik memberikan mobilitas berbeda
pada sampel berdasarkan muatan dan akibat mengatasinya. Gerakan partikel bermuatan
melambat dengan penambahan gel polimer sehingga tersedia waktu yang cukup untuk
menyelesaikan sampel. Gel polimerik inert, tidak bermuatan dan tidak menyebabkan
retardasi dengan mengikat molekul. Sebaliknya, membentuk pori-pori dengan ukuran
yang berbeda (tergantung pada konsentrasi polimer) dan sampel melewati pori-pori ini
dan akibatnya mobilitas elektroforesisnya berkurang.24
Sebagai alat analisis, elektroforesis sederhana, cepat dan sangat sensitif. Ini
digunakan secara analitis untuk mempelajari sifat-sifat dari spesies bermuatan tunggal
dan sebagai teknik pemisahan. Ini menyediakan dasar untuk sejumlah teknik analisis
yang digunakan untuk memisahkan molekul berdasarkan ukuran, muatan, atau afinitas
pengikatan, contoh - untuk pemisahan asam deoksiribonukleat (DNA), asam ribonukleat
(RNA), atau molekul protein yang menggunakan medan listrik yang diterapkan pada
sebuah matriks gel. Gel matriks yang digunakan terutama adalah poliakrilamid dan
agarosa. Gel elektroforesis DNA biasanya dilakukan untuk tujuan analisis, seringkali
setelah amplifikasi DNA melalui PCR, namun dapat digunakan sebagai teknik preparatif
sebelum menggunakan metode lain seperti spektrometri massa, RFLP, PCR, kloning,
sekuensing DNA, atau southern blotting untuk karakterisasi lebih lanjut.
2.6.3 Sekuensing

Istilah sekuensing DNA mengacu pada metode untuk menentukan urutan basa
nukleotida adenin, guanin, sitosin dan timin dalam molekul DNA. Urutan DNA pertama
diperoleh oleh peneliti akademis, dengan menggunakan metode laboratorium
berdasarkan kromatografi 2 dimensi pada awal tahun 1970an.25

Gambar 2.4 Urutan Sekuensing DNA 25

DNA adalah gudang informasi yang pada akhirnya menentukan struktur setiap
produk gen, menggambarkan setiap bagian organisme. Urutan basa di sepanjang DNA
berisi serangkaian instruksi lengkap yang membentuk warisan genetik.25

Pada tahun 1975, Sanger memperkenalkan konsep dari metode sekuensing

DNA dalam kuliah Croonian yang dipimpin olehnya dan kemudian, menerbitkan suatu

9
metode cepat untuk menentukan urutan DNA melalui sintesis primer dengan DNA
polymerase. Pada tahun 1977, dua artikel penting tentang sekuensing DNA diterbitkan,
yaitu teknik sekuensing DNA enzimatis dideoksi Frederick Sanger yang berdasarkan
analoginasi rantai dideoksinukleotida dan teknik sekuensing DNA degradasi kimia yang
pada akhirnya disebut dengan fragmen DNA oleh Allan Maxam dan Walter Gilbert yang
secara kimiawi dipecah pada basa spesifik dan dipisahkan dengan gel elektroforesis.26

10
 BAB III

METODOLOGI PENELITIAN

3.1 Jenis Penelitian

Jenis penelitian ini adalah deskriptif dengan rancangan penelitian potong lintang
(cross sectional) yang diambil dalam jangka waktu sekali penelitian.

3.2 Tempat dan Waktu Penelitian

a. Kultur dan identifikasi M. tuberculosis dilakukan di Instalasi Laboratorium

Mikrobiologi Klinik RSUP Sanglah, telah dilakukan oleh peneliti sebelumnya
namun belum ada publikasi.
b. Pemeriksaan molekuler gen embB meliputi PCR, elektroforesis, dan analisis
data dilakukan di Laboratorium Departemen Mikrobiologi Klinik Fakultas
Kedokteran Universitas Udayana.
c. Produk PCR akan dikirim untuk dilakukan sekuensing di 1st base (PT.
Genetika Science) dan analisa data hasil sekuen akan dilakukan dengan
program Mega.
d. Waktu penelitian akan dilaksanakan selama 9 bulan (Maret hingga
Desember 2018).

3.3 Variabel Penelitian

3.3.1 Identifikasi Variabel

Variabel yang terlibat dalam penelitian ini adalah ekstrak DNA Multidrug
Resistant Tuberculosis (MDR-TB) dan kelompok gen embB.

3.3.2 Definisi Operasional Variabel

1. Ekstrak DNA Multidrug Resistant Tuberculosis (MDR-TB) adalah hasil dari

isolat Mycobacterium tuberculosis yang resisten terhadap rifampisin dan
isoniazid (MDR-TB) yang telah di sub-kultur dan di ekstraksi oleh peneliti
sebelumnya pada bulan Juni-Juli 2017 di Instalasi Laboratorium Mikrobiologi
Klinik RSUP Sanglah Denpasar.
2. Gen embB yang digunakan sebagai primer adalah
Forward : 5'-GGTGATATTCGGCTTCCT-3’
Reverse : 5'-ATAGCGCGGTGATCAAAAAG-3’
Ukuran produk PCR yang akan dihasilkan primer adalah 799 bp 27

3.4 Subjek Penelitian

11
3.4.1 Populasi dan Sampel Penelitian

1. Populasi target adalah semua isolat MDR-TB yang diisolasi dari sampel klinis
di Instalasi Laboratorium Mikrobiologi Klinik RSUP Sanglah Denpasar.
2. Populasi terjangkau adalah isolat MDR-TB yang diisolasi dari sampel klinis
yang telah dilakukan kultur dan isolasi DNA MDR-TB di Instalasi
Laboratorium Mikrobiologi Klinik RSUP Sanglah Denpasar oleh peneliti
sebelumnya pada bulan Juni-Juli 2017.
3. Sampel adalah ekstrak DNA MDR-TB dari isolate klinis MDR-TB di Instalasi
Laboratorium Mikrobiologi Klinik RSUP Sanglah Denpasar yang memenuhi
kriteria inklusi.

3.4.2 Teknik Pengambilan Sampel

Teknik yang digunakan untuk penentuan sampel penelitian untuk PCR yaitu
convenient purposive sampling dengan memakai ekstrak DNA MDR-TB yang memenuhi
kriteria inklusi. Selanjutnya dari sampel yang di PCR terdeteksi gen embB, dilakukan
teknik simple random sampling untuk menentukan 5 sampel yang akan dilakukan
sekuensing.

3.4.3 Besar Sampel

Besar sampel dalam penelitian ini menggunakan semua ekstrak DNA MDR-TB
yang diisolasi dari spesimen klinis yang diperoleh di Instalasi Laboratorium Mikrobiologi
Klinik RSUP Sanglah Denpasar. Sampel untuk PCR berjumlah 30 sampel, selanjutnya
dipilih 5 sampel secara acak yang positif terdeteksi memiliki gen embB untuk dilakukan
sekuensing.

3.5 Kriteria Sampel

3.5.1 Kriteria Inklusi

Ekstrak DNA MDR-TB yang didapat dari spesimen klinis di Instalasi Laboratorium
Mikrobiologi Klinik RSUP Sanglah Denpasar yang telah dilakukan kultur dan isolasi DNA
oleh peneliti sebelumnya pada bulan Juni-Juli 2017

3.5.2 Kriteria Eksklusi

1. Ekstrak DNA MDR-TB yang rusak akibat terkontaminasi baik pada saat
proses ekstraksi maupun saat penyimpanan.
2. Ekstrak DNA MDR-TB yang rusak selama penyimpanan akibat suhu
pendingin yang tidak stabil sehingga menyebabkan DNA tersebut rusak.

12
3.6 Alat dan Bahan Penelitian

3.6.1 Alat Penelitian

Alat-alat dalam penelitian ini adalah Mesin PCR Biometra, Mesin Elektroforesis
(Mupid-exU), Mikro pipet, BSC type II, Tabung mikro sentrifuge volume 1,5 ml, Tube PCR
0,2 ml.

3.6.2 Bahan Penelitian

Bahan-bahan penelitian ini adalah: (1) PCR: Kit PCR: Go Taq* Green Master Mix
(Promega), Rnase free water, primer spesifik; Forward: 5'-GGTGATATTCGGCTTCCT-3’
dan Reverse: 5'-ATAGCGCGGTGATCAAAAAG-3’ (2) Elektroforesis agarosa: bubuk
agarosa, Buffer TBE, Pewarna Gel: GelRedTM NucleiAcid Gel Stain (Biotium), dan DNA
ladder 100bp.

3.7 Prosedur Penelitian

3.7.1 Pembuatan Media L-J

Sebanyak 7,5 gram media L-J dicampur dengan 120 mL akuabidestilata

kemudian ditambahkan dengan 2,4 mL gliserol dicampur hingga homogen. Setelah itu,
disterilkan dengan autoklaf selama 15 menit pada suhu 1210C. Kemudian didinginkan
hingga suhu ±600C. Selanjutnya, ditambahkan telur homogen sebanyak 200 mL yang
telah dipersiapkan secara steril. Dicampur perlahan-lahan agar tidak terbentuk
gelembung.

Media kemudian dituangkan ke dalam tabung McCartney steril sebanyak 7 mL.

Lalu ditutup secara rapat dan diletakkan dengan kemiringan ±300 dalam inspisator yang
telah dipanaskan sampai suhu 850C dan dikoagulasikan selama 45 menit. Media
dikeluarkan dari inspisator dan didiamkan sampai suhu kamar. Bila kualitas media tidak
baik (terjadi perubahan-perubahan warna, berlubang-lubang atau terdapat gelembung-
gelembung pada permukaan) maka media tersebut tidak dapat dipakai. Sebelum dipakai
media LJ terlebih dahulu diuji kekenyalan dengan dipukul-pukulkan ketelapak tangan, uji
sterilisasi dengan menginkubasi media pada suhu ruang 1x24 jam, dan beberapa media
(5%) di inkubasi di inkubator pada suhu 370C selama 1x24 jam. Pembuatan media LJ ini
telah dilakukan oleh peneliti sebelumnya pada tahun 2017.

3.7.2 Sub Kultur Isolat MDR-TB

Stok isolate MDR-TB, diambil dari penyimpanan -800C, diambil sebanyak 100 µl,
kemudian dimasukkan ke NaCl steril yang berisi glass beads, divortex, setelah itu
diteteskan sebanyak 3 tetes suspense pada media LJ yang telah disiapkan, tutup tabung

13
McCartney, lalu diinkubasi media LJ pada posisi miring selama 1x24 jam, setelah itu
media LJ ditegakkan. Inkubasi dilakukan selama 3 minggu. Prosedur ini telah dilakukan
oleh peneliti sebelumnya pada tahun 2017.

3.7.3 Ekstraksi DNA MDR-TB

Setelah sub kultur selama 3 minggu, sebanyak 1 ose koloni bakteri diambil,
kemudian dimasukkan ke dalam tabung ependorf 1,5 ml yang sudah berisi 1 ml cairan
PBS. Selanjutnya ekstraksi dilakukan dengan menggunakan kit dari Rosche DNA
Extraction Kit, sesuai dengan petunjuk perusahaan. Sama dengan prosedur sebelumnya,
ekstraksi DNA MDR-TB ini juga telah dilakukan oleh peneliti sebelumnya pada tahun
2017.

3.7.4 PCR

PCR dilakukan dengan menggunakan protokol seperti yang sudah dilakukan

sebelumnya, dengan menggunakan Primer spesifik sebagai berikut untuk gen embB : 5'-
GGTGATATTCGGCTTCCT-3’ dan 5'-ATAGCGCGGTGATCAAAAAG-3’ (Zhang, et al.,
2014) Dilakukan amplifikasi hasil ekstraksi DNA terdiri dari: fastard mix PCR 25 ul, primer
1,0 μM (Forward Primer dan Reverse Primer) 1.0 μl , aquabidest 12 ul, dan 5 ul templet
0,1 ug dihomogenkan. Untuk kontrol positif (+), DNA template sampel diganti dengan
DNA isolat M. tuberculosis dan kontrol negatif (-) menggunakan aquabidest steril.
Pencampuran bahan – bahan tersebut dilakukan pada eppendrof 200 ml dalam box
pendingin supaya DNA dan enzim yang digunakan tidak rusak. Campuran tersebut
diatas, kemudian di spin down dan selanjutnya di masukkan dalam mesin PCR thermal
cycler untuk amplifikasi dengan kondisi :
Hotstart : 940 C, 4 menit 1x
0
Denaturasi : 94 C, 1 menit
Annealing : 550 C, 1 menit 35x
0
Elongasi : 72 C, 1 menit
Elongasi post PCR : 720 C, 4 menit 1x
3.7.5 Elektroforesis

Hasil amplifikasi kemudian di elektroforesis dengan menggunakan gel Agarose

1% 0,35 gr, dilarutkan dalam 35 ml larutan TBE (Tris Borate EDTA)1X. Gel diletakkan
dalam bak elektroforesis dan dialiri arus listrik 100 volt selama 40 menit. Selanjutnya
produk PCR sebanyak 30 ml dengan primer F dan R masing-masing konsentrasi 10 µM,
yang kemudian akan dikirim untuk dilakukan sekuensing.

3.7.6 Sekuensing

14
 Tahap selanjutnya yaitu produk PCR sebanyak 30 ml dengan primer F dan R
masing-masing konsentrasi 10 µM, kemudian dikirim untuk dilakukan sekuensing di 1st
base PT. Genetika Science. Kemudian hasil sekuensing dianalisa menggunakan
program Mega6, untuk melihat adanya polimorfisme.

3.8 Alur Penelitian

Prosedur dalam penelitian ini secara singkat dapat dilihat pada gambar 3.1
sebagaimana berikut ini :

Pembuatan Media LJ
Keterangan :
Sub Kultur Isolat MDR-TB

Ekstraksi DNA MDR-TB

PCR
=
Elektroforesis Dikerjakan
oleh peneliti
Sekuensing

Gambar 3.1 Skema prosedur penelitian

3.9 Analisis Data

Data penelitian ini diperoleh dari hasil sekuensing produk PCR berupa
elektroperogram. Kemudian, data hasil sekuensing akan dianalisa dengan menggunakan
software Mega dan deteksi mutasi dengan melakukan pencocokan pada GeneBank
dengan menggunakan software BLAST (NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/). Selanjutnya
data akan disajikan dalam bentuk tabel, grafik, dan narasi.

15
 BAB IV

BIAYA DAN JADWAL PENELITIAN

4.1 Biaya Penelitian

Biaya yang diusulkan dalam penelitian ini adalah sebesar Rp7.500.000 (Tujuh
juta lima ratus ribu rupiah).

4.2 Jadwal Penelitian

Bulan ke-
No. Uraian Kegiatan
1 2 3 4 5 6 7 8 9

1. Pembuatan proposal

2. Persiapan bahan untuk PCR,

pemesanan primer

3. PCR

4. Elektroforesis

5. Sekuensing

6. Analisis hasil sekuensing

7. Pelaporan hasil dan publikasi

16
 DAFTAR PUSTAKA

1. World Health Organization (WHO) (2015) Global Tuberculosis Report 20th

Edition.
2. Dinas Kesehatan Provinsi Bali (2015) ‘Profil Kesehatan Provinsi Bali Tahun
2014’, p. 27.
3. Kemenkes RI (2014) ‘Pedoman Nasional Pengendalian Tuberkulosis’, in, pp. 18–
20.
4. Minion, J. et al. (2013) ‘Multidrug and Extensively Drug-resistant Tuberculosis in
Canada 1997 – 2008 : Demographic and Disease Characteristics’, 8(1). doi:
10.1371/journal.pone.0053466.
5. Medrano, F. J., Gala, B. and Garcı, L. (2016) ‘Characterization of the KstR-
dependent promoter of the gene for the first step of the cholesterol degradative
pathway in Mycobacterium smegmatis’, (2011), pp. 2670–2680. doi:
10.1099/mic.0.049213-0.
6. Ouellet, H. et al. (2011) ‘Mycobacterium tuberculosis CYP125A1, a steroid C27
monooxygenase that detoxifies intracellularly generated cholest-4-en-3-one’,
77(3), pp. 730–742. doi: 10.1111/j.1365-2958.2010.07243.x.Mycobacterium.
7. Bauman, R. W., 2012. Microbiology : with Disease by Body System. s.l.:s.n.
8. Division of Tuberculosis Elimination (2011) ‘TB Elimination’, pp. 1–2.
9. Gutierrez MC, Brisse S, Brosch R, Fabre M, Omaı¨s B, et al. (2005) ‘Ancient
Origin and Gene Mosaicism of the Progenitor of Mycobacterium tuberculosis’,
PLoS Pathog, 1(1). doi: 10.1371/journal.ppat.0010005.
10. Division of Tuberculosis Elimination (2013) ‘Core Curriculum on Tuberculosis :
What the Clinician Should Know’, pp. 26–27.
11. Division of Tuberculosis Elimination (2008) ‘Self-Study Modules on Tuberculosis :
Transmission and Pathogenesis of Tuberculosis’, pp. 12–18.
12. Kana, B. et al. (2013) ‘Tuberculosis : The global killer’, 109(9), pp. 9–11.
13. Kapadiya, B., Raval, N. B. and Patel, V. (2009) ‘MDR and XDR Tuberculosis’,
GUJARAT MEDICAL JOURNAL, 64(2), pp. 19–20.
14. Takayama, K. and Kilburn, J. (1989) ‘Inhibition of Synthesis of Arabinogalactan
by Ethambutol in Mycobacterium smegmatis’, pp. 1493–1499.
15. Zhang, Y. and Yew, W. W. (2009) ‘STATE OF THE ART SERIES : Mechanisms
of drug resistance in Mycobacterium tuberculosis’, 13(11), pp. 1320–1330.
16. Nofriyanda. 2010. Gambaran Hasil Pengobatan Penderita TB Paru di Poliklinik
Paru RS. DR. M. Djamil Padang Periode 1 Januari 2007-31 Desember 2008.
Padang: Universitas Andalas.

17
17. Zhao, L.-l.et al., 2015. Analysis of embCAB Mutations Associated with
Ethambutol Resistance. Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 59(4), pp.
2045-2050.
18. Eduardo, P., Da Silva, A. and Palomino, J. C. (2011) ‘Molecular basis and
mechanisms of drug resistance in Mycobacterium tuberculosis : classical and
new drugs’, (May), pp. 1417–1430. doi: 10.1093/jac/dkr173.
19. Xu, Y. et al. (2015) ‘Genes of Ethambutol-Sensitive and -Resistant
Mycobacterium tuberculosis Clinical Isolates from China’. Hindawi Publishing
Corporation, 2015.
20. Anon., 2004. LOWENSTEIN - JENSEN MEDIUM. In: Acumedia Manual and
Product Information Sheets. USA: Neogen Corporation, p. PI 7245.
21. Joshi, M. and Deshpande, J. D. (2010) ‘Polymerase Chain Reaction : Methods ,
Principles and Application’, International Journal of Biomedical Research, 1(5),
pp. 81–97. doi: http://dx.doi.org/10.7439/ijbr.v2i1.83.
22. Garibyan, L. and Avashia, N. (2013) ‘Research Techniques Made Simple:
Polymerase Chain Reaction (PCR)’, 18(4), pp. 1–8. doi:
10.1038/jid.2013.1.Research.
23. Handoyo, D. and Rudiretna, A. (2001) ‘Prinsip umum dan pelaksanaan
Polymerase Chain Reaction (PCR)’, Unitas, 9(1), pp. 17–29.
24. Khijwania,S.,2013.NPTEL.[Online]Availableat:http://nptel.ac.in/downloads/10210
3044/[Accessed 6 February 2018].
25. Kumar, B. R., 2012. Methods of DNA Sequencing-DNA Representation. Dna
Sequencing – Methods and Applications, p. 175.
26. Pareek, C. S., Smoczynski, R. & Tretyn, A., 2011. Sequencing technologies and
genome sequencing. HUMAN GENETICS • REVIEW, Issue 52, p. 413–435.
27. Zhang, Z., Wang, Y., Pang, Y. & Kam, K. M., 2014. Ethambutol Resistance as
Determined by Broth Dilution Method. 52(2), p. 638–641.

18
Lampiran 1 Justifikasi Anggaran Penelitian
1. Honorarium
Waktu
Honor Honor/jam (Rp) Minggu Harga (Rp)
(jam/minggu)
Laboran 10.000 8 8 640.000
SUB TOTAL (Rp) 640.000
2. Peralatan Penunjang
Justifikasi Harga Satuan
Peralatan Kuantitas Biaya (Rp)
Pemakaian (Rp)
Tempat
Sewa
pelaksanaan 2 bulan 1.000.000 1.000.000
laboratorium
penelitian
Amplifikasi
Tube PCR 30 50.000 1.500.000
DNA
SUB TOTAL (Rp) 2.500.000
3. Bahan Habis Pakai
Justifikasi Harga Satuan Jumlah Biaya
Material Kuantitas
Pemakaian (Rp) (Rp)
Amplifikasi
Primer spesifik 1 300.000 300..000
DNA
Pembacaan
Sekuensing urutan 5 300.000 1.500.000
nukleotida
Promega PCR
Reagen PCR 1 1.000.000 1.000.000
mix
Serbuk agarose Elektroforesis 50 gram 500.000 500.000
Buffer TBE Elektroforesis 50 gram 450.000 450.000
SUB TOTAL (Rp) 3.750.000
4. Perjalanan
Justifikasi Harga Satuan Jumlah Biaya
Material Kuantitas
Perjalanan (Rp) (Rp)
Pengambilan
Perjalanan 1 50.000 50.000
sampe
SUB TOTAL (Rp) 50.000
5. Lain-lain
Harga Satuan Jumlah BIaya
Kegiatan Justifikasi Kuantitas
(Rp) (Rp)
Administrasi, Publikasi 1 300.000 300.000

19
Publikasi laporan dan
lainnya
SUB TOTAL (Rp) 300.000

TOTAL ANGGARAN YANG DIPERLUKAN (Rp) 7.240.000

20
Lampiran 2. Dukungan Sarana dan Prasarana Penelitian
Nama Fasilitas Kondisi Keterangan

Tempat pengerjaan
BSC IIA (Telsar) Baik
penelitian
Laboratorium
Departemen Mesin PCR Amplifikasi DNA
Baik
Mikrobiologi FK Unud (Biometra) bakteri

Untuk pembacaan
Mesin elektroforesis Baik
hasil PCR

Laboratorium
Untuk visualisasi
Biomedik Terpadu Bio Rad Gel DOC Baik
hasil elektroforesis
FK Unud

21
 Lampiran 3. Biodata Peneliti dan Pembimbing

1. Biodata Peneliti

A. Identitas Diri

1. Nama Lengkap Alif Rochmah Izzatul Azka P

2. Tempat dan Tanggal Lahir Bojonegoro, 19 Juli 1997

3. NIM 1502005057

4. Program Studi/Fakultas Pendidikan Dokter/Kedokteran

Jl. Diponegoro Gg. Pertani No. 5 Dusun Sanglah Barat,

5. Alamat Rumah
Denpasar

6. Nomor Telepon/HP 082144379622

7. Alamat e-mail alifrochmahia@gmail.com

B. Riwayat Pendidikan
SD SMP SMA Perguruan Tinggi
MIN Kepatihan SMP Negeri 2 SMA Negeri 2 Universitas
Nama Institusi
Bojonegoro Bojonegoro Bojonegoro Udayana
Jurusan - - IPA Pendidikan Dokter
Tahun Masuk 2003 2009 2012 2015
Tahun Keluar 2009 2012 2015 -

C. Pengalaman Organisasi
Nama Organisasi Jabatan Masa Jabatan

Pengurus Divisi
Kelompok Ilmiah Hippocrates FK
Hubungan Luar dan 2017/2018
Unud
Dana Usaha

D. Sertifikat/Penghargaan yang Pernah Diraih

Kegiatan Sebagai Tahun
- - -
E. Pengalaman Penulisan Artikel Ilmiah dalam Jurnal dalam 5 Tahun Terakhir
No. Judul Artikel Ilmiah Volume/Nomor Nama Jurnal
- - - -
F. Karya Ilmiah yang Pernah Dibuat
Judul Karya Jenis Tahun
- - -

22
Semua data yang saya isikan dan tercantum dalam biodata ini adalah benar dan dapat
dipertanggungjawabkan secara hukum. Apabila dikemudian hari ternyata dijumpai
ketidak- sesuaian dengan kenyataan, saya sanggup menerima sanksi.

Demikian biodata ini saya buat dengan sebenarnya untuk memenuhi salah satu
persyaratan dalam pengajuan penelitian/pengabdian: skema penelitian mahasiswa S1.

Denpasar, 7 Maret 2018

Pengusul,

(Alif Rochmah Izzatul Azka)

23
 2. Biodata Pembimbing
A. Identitas Diri

1. Nama Lengkap (dengan gelar) Dr. dr. Komang Januartha Putra Pinatih, M.Kes

2. Jabatan Fungsional Letkor Kepala

3. Pangkat/Gol. Pembina/IV.a

4. NIP/NIK/No. Identitas Lainnya 196701221996011001

5. NIDN 0022016702

6. Tempat dan Tanggal Lahir Denpasar, 22 Januari 1967

7. Alamat Rumah Jl. Sekar Jepun VI/45 Denpasar

8. No. Telp/Fax/HP 08123831710

9. Alamat Kantor Jl. PB Sudirman Denpasar

10. No. Telp/Fax 467724

11. Alamat E-mail Januartha_putra@unud.ac.id

B. Riwayat Pendidikan
Program S-1 S-2 S-3
Nama Perguruan Tinggi FK Unud FK UGM FK Unud
Bidang Ilmu Kedokteran Kedokteran Tropis Kedokteran
Tahun Lulus 1992 2001 2017
C. Pengalaman Penelitian

No Tahun Judul Penelitian

1 2010 Identifikasi Gen Shiga-like Toxin STx1 dan StX2 dari Bakteri
Eschericia coli 0157:H7 pada Daging babi di Kota Denpasar Bali
2 2011 Identifikasi Gen Ctx-A dari DNA Bakteri Vibrio cholerae Serotype 01
dengan Metode PCR pada Air Laut di Pantai Wisata seluruh Bali
3 2012 Identifikasi Gen Shiga like Toxin (SLT-II atau VT2) pada pakteri
patogen Escherichia coli 0157:H7 dan Gen CtxA pada Vibrio cholerae
01 sebagai Pencemar kolam renang di daerah wisata seluruh Bali
4 2012 Pengembangan probe diagnostik berbasis kloning gen untuk deteksi
Shiga-like toxin-2 producing E.coli sebagai agen zoonosis penyebab
gagal ginjal
5 2013 Ekstrak ethanol cacing tanah (Lumbricus rubeuus) meningkatkan
ekspresi mRNA gen tlr4 dan il-1β serta jumlah makrofag pada
jaringan usus halus mencit Balb/c dengan infeksi Salmonella typhi
6 2014 Identifikasi gen stx2 pada bakteri patogen Escherichia coli serotipe
O157 dari minuman es teh waralaba di sekitar Kota Denpasar
7 2015 Ekstrak ethanol cacing tanah (Lumbricus rubeuus) meningkatkan
ekspresi IncRNA NF-kβ2 dan mRNA IL-18 pada jaringan usus halus
mencit Balb/c dengan infeksi Salmonella typhi
8 2016 Eksplorasi bakteri asam laktat asal susu sapi Bali sebagai probiotik
unggul dengan aktivitas pro apoptosis pada sel kanker kolorektal

24
 D. Pengalaman Pengabdian Kepada Masyarakat dalam 5 Tahun Terakhir

Pendanaan
Judul Pengabdian Kepada
No Tahun Masyarakat Jumlah (juta
Sumber *)
Rp)
1 - - - -
E. Pengalaman Penulisan Artikel Ilmiah dalam Jurnal
No. Judul Artikel Ilmiah Nama Jurnal
1 Analisis SSCP untuk mendeteksi Mutasi QRDR Gen Majalah Kedokteran Udayana, Vol.
gyrA Mycobacterium tuberculosis yang resisten 34 No. 122, Oktober 2003
Siprofloksasin
2 Deteksi koinfeksi Chlamydia trachomatis pada Medicina, Vol.38 No.1, januari 2007
penderita servisitis gonore di RS Sanglah Denpasar
3 Detection of Shiga like toxin (SLT-II) or Verotoxin-2 The 4th International Seminar of
(VT-2) gene from bacteria Escherichia coli serotype Indonesian Society for Microbiology
O157 on pork in Denpasar City and IUMS-IMS Outreach Program in
Food safety, Bali 2011
4 Deteksi bakteri E.coli serotipe O-157 pada daging Medicina (2012): 43 (1)
babi dari pedagang daging babi di Kota Denpasar
5 Protein profile analysis of E.coli O-157:H7 from Int.J.Curr.Microbiol.App.Sci (2013):
human and animals origin 2(6): 204-214
6 Penentuan marka genetik E.coli O-157:H7 asal J.Veteriner (2014):15(3): 323-329
hewan dan manusia dengan metode random
amplified polymorfic DNA
7 Deteksi gen Shiga-like toxin 1 isolat E.coli O-157:H7 Indonesia Medicus Veterinus (2015):
asal Sapi Bali di Kuta Selatan, Badung 4(4): 295-304
8 Prevalensi infeksi E.coli O-157:H7 pada Sapi Bali di Indonesia Medicus Veterinus (2015):
Kecamatan Mengwi dan Kuta Selatan, Badung 4(10: 31-39
9 Uji kepekaan E.coli O-157:H7 feses sapi di Indonesia Medicus Veterinus (2015):
Kecamatan Kuta Selatan Bdung Bali terhadap 4(4): 342-350
Antibiotik
10 Evaluation of zoonotic potency of E.coli O-157:H7 Asian Pac.J Trop Biomed (2015):
throuht arbitralily primed pCR methods 5(11): 915-920
11 Antibiotic resistence profile of E.coli O-157:H7 in Global veterinaria (2015): 15(5): 480-
Cattle at south Kuta, Badung regency, Bali, 484
Indonesia
12 Pola mikroba pasien yang dirawat di Intensive Care e-Jurnal Medika (2016) : 5(4): 1-6
Unit (ICU) serta kepekaannya terhadap antibiotik di
RSUP Sanglah Denpasar Bagi Agustus-Oktober
2013
13 Regulatory elements of stx2 gene and the J of Microbiology, Immmunology and
expression level of Shiga-like toxin 2 in E.coli O- Infection (2016) :
157:H7 http://dx.doi.org/10.1016/j.jmii.2016.0
4.006
14 Probiotic potency and molecular identification of Global Advanced Research Journal
lactic acid bacteria isolated from Bali cattle’s colon, of Medicine and Medical Science
Indonesia (2016): 5(5): 143-149
http://garj.org/garjmms/
15 Sekuen nukleotida gene Shiga like toxin 2 dari isolat Jurnal Veteriner (2017): Maret 18 (1),
lokal E.coli O-157:H7 asal hewan dan manusia 83-93
16 Prevalensi kelompok gen blaCTX-M-1 pada E-Jurnal Medika Udayana (2017):
Klebisella pneumoniae di Rumah sakit Umum Pusat 6(2),1-7
Sanglah Denpasar
17 Molecular analysis of lactic acid bacteria isolate SR2 Journal of Global Pharma Tecnology
from bali Cattle rumen (2017): 9 (5)

25
 F. Pengalaman Perolehan HKI dalam 5-10 Tahun Terakhir

No Judul/Tema HKI Tahun Jenis No P/ID

Escherichia coli O-157:H7 strain

KL-48(2) Stx-2 sub-unit A (stx2A)
1 2014 Program Komputer 073217
and Stx2 sub unit B (stx2B)
genes, complete cds

Semua data yang saya isikan dan tercantum dalam biodata ini adalah benar dan dapat
dipertanggungjawabkan secara hukum. Apabila dikemudian hari ternyata dijumpai
ketidak- sesuaian dengan kenyataan, saya sanggup menerima sanksi.
Demikian biodata ini saya buat dengan sebenarnya untuk memenuhi salah satu
persyaratan dalam pengajuan penelitian/pengabdian: Skema Penelitian Mahasiswa S1.

Denpasar, 6 Maret 2018

Pembimbing,

(Dr.dr. Komang Januartha Putra Pinatih M.Kes)

26
Lampiran 4. Susunan Organisasi Tim Peneliti dan Pembagian Tugas
Alokasi waktu
Posisi dalam
No. Nama Institusi Uraian tugas
penelitian (jam/minggu/tahun)
1 Alif Rochmah FK Unud Peneliti utama 8 jam/minggu Mempersiapkan
Izzatul Azka proposal penelitian,
merencanakan
penelitian dan
mengadakan
peralatan
penelitian,melakuka
n PCR dan
elektroforesis,
analisis hasil
sekuensing dan
pembuatan laporan
hasil penelitian

27
Lampiran 5. Surat Pernyataan Ketua Pengusul Penelitian/Pengabdian
KEMENTERIAN RISET, TEKNOLOGI DAN PENDIDIKAN TINGGI
UNIVERSITAS UDAYANA
UNIT PENELITIAN DAN PENGABDIAN PADA MASYARAKAT

Jalan PB. Sudirman Denpasar Bali (80114) Telp. (0361) 222510 email litbangfkunud@gmail.com

SURAT PERNYATAAN KETUA PENGUSUL

Yang bertanda tangan di bawah ini :
Nama Lengkap : Alif Rochmah Izzatul Azka
NIM : 1502005057
Pangkat / Golongan : Mahasiswa
Jabatan Fungsional : Peneliti Utama
Program Studi/Fakultas : Program Studi Pendidikan Dokter/Fakultas Kedokteran
Universitas Udayana
Dengan ini menyatakan bahwa proposal saya dengan judul:
“Deteksi Mutasi Gen embB dari Isolat Klinis Multidrug Resistant Tuberculosis (MDR-
TB) di Instalasi Laboratorium Mikrobiologi Klinik RSUP Sanglah Denpasar”

yang diusulkan dalam skema penelitian hibah mahasiswa S1 untuk tahun anggaran
2018 dibuat secara bersama-sama oleh tim pengusul dan bersifat original dan
belum pernah dibiayai oleh lembaga/sumber dana lain.

Bilamana di kemudian hari ditemukan ketidaksesuaian dengan pernyataan ini, maka

saya bersedia dituntut dan diproses sesuai dengan ketentuan yang berlaku dan
mengembalikan seluruh biaya penugasan yang sudah diterima ke Kas Negara.

Demikian Surat Pernyataan ini dibuat dengan sesungguhnya dan dengan sebenar-
benarnya.

Denpasar, 6 Maret 2018

Mengetahui Yang menyatakan,
Ketua Unit Penelitian dan Pengabdian pada
Masyarakat FK Unud,

(dr. Ni Nengah Dwi Fatmawati, S.Ked, SpMK, PhD) (Alif Rochmah Izzatul Azka)
NIP 19780114 200212 2 003 NIM 1502005057