TUGAS FITOKIMIA II

SENYAWA GLIKOSIDA SIANOGENIK

Dosen : Dr. Tiah Rachmatiah, M.Si.,Apt.

Disusun Oleh :

Kelas D ( Kelompok 6 )

1. Riska Pandala Putri (173307160)

2. Rauzatul Ulfa (17330716)
3. Ika Septiana (17330726)
4. Nurul Fajriah (17330718 )
5. Yunus Adil zebua (17330725)
6. Vega Lacerta VAE (17330734)
7. Wayan Esa Sari Putri (18330707 )
8. Nurita Purwanti BR Tarigan ( 18330710)
9. Eka Riyani (18330719)

PROGRAM STUDI S1 FARMASI

FAKULTAS FARMASI
INSTITUT SAINS DAN TEKNOOGI NASIONAL JAKARTA
2019
Judul : Determinasi Isi Komponen Sianogenik dalam Transgenik
Asianogenik Kenyan Cassava (Manihot esculenta Crantz) Genotif :
Menghubungkan Analisa Molekuler menjadi Analisa Biokimia

Penulis : Ngugi M Piero, Murugi N Joan, Oduor O Richard, Mgutu A Jalemba,

Ombori R Omwoyo dan Cheruiyot R Chelule

Instansi : Departemen Biokimia dan Biotekhnologi, Universitas Kenyatta,

Nairobi, Kenya ; Departemen Lingkungan dan Populasi Kesehatan,
Universitas Kenyatta, Nairobi, Kenya ; Departemen Ilmu Tumbuhan,
Universitas Kenyatta, Nairobi, Kenya

Nama Jurnal : J Analytical & Bioanalytical Technology, Vol. 6, Issue 5, 2015

1. Abstrak

Menjadi tanaman terpenting keempat di negara-negara berkembang hanya

dilampaui oleh jagung, beras dan tebu sebagai sumber kalori, singkong (Manihot
esculenta Crantz) tidak diragukan lagi merupakan tanaman cadangan kelaparan karena
kekeringannya. toleransi, kemampuan untuk tumbuh di tanah yang tidak subur dan
kemampuannya untuk pulih dari serangan penyakit dan hama. Namun ini tanaman
umbi penting memiliki bagian kerugian yang adil, di antaranya adalah kenyataan
bahwa semua bagian tanaman mengandung racun tingkat glikosida sianogenik, yang
harus dihilangkan dengan proses yang melelahkan sebelum singkong dapat aman
dikonsumsi. Metode konvensional untuk menghilangkan glikosida sianogen dalam
singkong jarang berhasil dekade. Rekayasa genetika memegang kunci untuk mengatasi
sebagian besar keterbatasan ini untuk menghasilkan singkong pabrik di mana sifat-sifat
yang diinginkan dioptimalkan dan sifat-sifat yang tidak diinginkan diturunkan regulasi.
Tujuan dari penelitian ini adalah untuk menentukan tingkat senyawa sianogenik dalam
tiga genotipe singkong Kenya bersama dengan model eksotis kultivar di mana
glikosida sianogenik telah diturunkan regulasi melalui pendekatan interferensi RNA
dalam penelitian sebelumnya oleh penulis. Akar singkong dari genotipe tipe transgenik
dan liar dipanen, dikupas, dipotong-potong dan dicuci tiga kali dengan air dingin,
setelah senyawa sianogenik diekstraksi dengan homogenisasi dalam asam media
ekstraksi. Supernatan yang diperoleh setelah sentrifugasi homogenat dianalisis untuk
sianogenik senyawa konten dengan prosedur spektrofotometri. Dari penelitian ini, garis
singkong transgenik dengan sianida konten tiga kali lipat kurang dari konten sianida
dalam kerabat tipe liar diproduksi. Hal ini mengonfirmasi penurunan regulasi ekspresi
gen sitokrom P450 yang bertanggung jawab untuk biosintesis cyano-glikosida.
sebelumnya dilakukan oleh penulis dalam studi sebelumnya.

Kata kunci: Manihot esculenta; Linamarin; Cyanohydrin; gangguan RNA

2. Latar Belakang
Glikosida sianogen adalah sekelompok senyawa sekunder tanaman yang
mengandung nitril yang menghasilkan sianida (sianogenesis) setelah pemecahan
enzimatiknya. Fungsi glikosida sianogenik masih harus ditentukan di banyak tanaman.
Diperkirakan bahwa antara 3.000 dan 12.000 spesies tanaman menghasilkan dan
menyita glikosida sianogen. Tanaman yang dapat dimakan utama di mana glikosida
sianogenik terjadi adalah almond, sorgum, singkong, lima kacang, buah-buahan batu
dan rebung.
Dalam biji sapindaceous tertentu, HCN dapat muncul selama hidrolisis sianolipid.
Lebih sering, produksi HCN di tanaman yang lebih tinggi dihasilkan dari katabolisme
glikosida sianogenik. Sekitar 75 glikosida sianogenik yang terdokumentasi adalah
semua turunan O-β-glikosidik dari ahydroxynitriles. Tergantung pada asam amino
prekursor mereka, mereka mungkin aromatik, alifatik, atau siklopentenoid di alam.
Sebagian besar adalah monosakarida sianogenik di mana gugus sianohidrin yang tidak
stabil distabilkan oleh hubungan glikosidik dengan residu gula tunggal. Atau, dalam
disakarida sianogenik [mis. (R) -amygdalin, (R) -vicianin, dan linustatin] atau
trisaccharides (mis. Xeranthin), masing-masing dua atau tiga gugus gula, terlibat dalam
stabilisasi tersebut. Turunan-turunan glikosida sianogen yang tersulfasi, malonilasi,
dan terasilasi juga diketahui juga dikenal. Sianogenesis tidak eksklusif untuk spesies
tanaman yang mengumpulkan sianolipid dan glikosida sianogen.. Sianogenesis juga
dikenal pada hewan, tetapi terbatas pada artropoda, terutama untuk kelabang, kelabang,
dan serangga tertentu. Pada jamur dan bakteri, HCN dapat berasal melalui
dekarboksilasi oksidatif glisin.Sianida terjadi di singkong dalam bentuk dua glikosida
sianogen; linamarin dan lotaustralin.
Toksisitas singkong pada manusia adalah masalah terdokumentasi dengan baik.
Umbi singkong bervariasi dalam konten sianogen mereka, meskipun sebagian besar
varietas mengandung 15-400 mg HCN per kg berat segar. Dosis sianida dari 50 sampai
100 mg dilaporkan mematikan untuk orang dewasa.
Teknik-teknik yang berbeda dari pengolahan singkong bertujuan untuk mengurangi
tingkat senyawa sianogen untuk mendapatkan makanan yang aman. Metode tradisional
biasanya termasuk chipping, perendaman, fermentasi, memasak, mengukus,
pengeringan dan pemanggangan. Mereka semua mengizinkan linamarase enzim untuk
berinteraksi dengan senyawa sianogen untuk melepaskan HCN. HCN maka baik larut
dalam air atau lolos ke udara. Namun, sering tidak mungkin untuk menghapus semua
senyawa sianogen melalui pengolahan konvensional. Pendekatan rekayasa genetika
menawarkan metode alternatif untuk mengurangi senyawa sianogen di singkong.
Metode yang berbeda tersedia untuk penentuan kuantitatif senyawa sianogenik
(linamarin, sianohidrin dan sianida bebas). Mayoritas membutuhkan tiga langkah.
Langkah pertama, ekstraksi sianogen, biasanya dilakukan dalam asam encer untuk
menghentikan degradasi senyawa sianogen. Langkah kedua melibatkan degradasi
linamarin untuk sianohidrin dan glukosa dan, kemudian, untuk HCN. Hal ini dapat
dicapai baik dengan autolisis, yang bergantung pada linamarase endogeneous, oleh
hidrolisis enzimatik dengan menambahkan linamarase eksogen atau dengan hidrolisis
alkalinic dengan penambahan NaOH.

Untuk langkah ketiga, penentuan HCN, berbagai metode telah dikembangkan, seperti
titrasi dengan AgNO 3, reaksi dengan picrate alkali, dan yang paling banyak digunakan,
metode fotometri berdasarkan reaksi König. Metode berdasarkan reaksi König cocok
untuk laboratorium dengan peralatan terbatas dan untuk analisis lapangan, dan karena
itu dipilih untuk penelitian ini. Penelitian ini dirancang untuk menentukan tingkat
senyawa sianogen dalam tiga baris singkong Kenya transgenik yang digunakan dalam
penelitian ini bersama dengan model kultivar eksotis, TMS 60444.

3. Metode Penelitian yang Digunakan

Penentuan Senyawa Sianogen

Singkong dipanen, dikupas, dipotong-potong dan dicuci tiga kali dengan air dingin.
Sejak sianida konten bervariasi baik secara longitudinal dan radial, sampel homogen
diperoleh dengan menghapus kedua ujung batang dan ujung distal dari umbi dan
memotong akar ke dalam kubus. Mereka dikeringkan pada ruang suhu (25 ° C) dan
kemudian ditumbuk menjadi bubuk. Daun juga dipanen dari kedua transgenik dan tipe
liar Singkong dicuci sekali dengan air dingin dan dikeringkan pada suhu kamar setelah
mereka tanah untuk bubuk. Untuk penentuan distribusi total kandungan sianida di akar,
bubuk dari bagian akar yang berbeda disiapkan secara terpisah untuk analisis terpisah.
Bagian yang berbeda dari akar disiapkan adalah disc pusat, ujung akar distal, ujung
akar apikal, bagian radial luar dan akar korteks.

Ekstraksi senyawa sianogen

Sampel dari 10 g dihomogenasi dalam 30 ml media ekstraksi asam (Polytron).
Jumlah sampel bervariasi, tetapi rasio sampel untuk ekstraksi media selalu sekitar 1: 3.
Sampel yang telah di homogenkan selama 10 menit kemudian disentrifugasi pada
10.000 g selama 10 menit. Supernatan disimpan pada suhu 4 ° C sampai diuji untuk
senyawa sianogen.

Prosedur Enzimatik
Reagen yang digunakan dalam tes enzimatik sebagai berikut: Buffer fosfat pH 7,0,
6,0 dan 4,0 dibuat dari 0.1MH 3 PO 4 dan 0,1 M Na 3 P0 4. Linamarase dari BDH
dilarutkan dalam buffer fosfat pH 6,0 untuk memberikan aktivitas 5 unit enzim (EU) /
ml (hidrolisis 5 umol dari linamarin per menit pada 30 ° C dalam buffer fosfat, pH 6,0).
Chloramin T reagen dibuat dengan melarutkan 0,5 g chloramin T di 100 ml air.
 Mid-parenchyma

Core

Reagen asam / asam barbiturat isonikotinat dibuat dengan melarutkan 3,5 g asam
barbiturat dan 2,85 g asam isonikotinat dalam larutan 0,5 M NaOH. PH reagen ini
disesuaikan antara 7 dan 8 dengan 2M HCl atau NaOH, masing-masing. Aseton
sianohidrin, digunakan untuk mengkalibrasi sampel, dibuat sebagai berikut: Sebuah
solusi stok 628 mg sianohidrin per liter di 0,1 M asam fosfat (sesuai dengan 200 mg
HCN / L) diencerkan dalam 0,1 M asam fosfat sehingga solusi standar yang terkandung
3.1, 9.4, 15.7, 25.1, 31.4, 47.1 dan 62.8 mg / l sianohidrin.

Prosedur Pengujian
1. Total sianida (cyanogenic glikosida + sianohidrin + HCN)
Dalam tabung tersumbat 1,5 ml, 0,1 ml ekstrak dan 0,05 ml linamarase ditambahkan
0,45 ml dapar fosfat pH 7,0. Setelah inkubasi pada 37 ° C selama 30 menit,
campuran dipindahkan ke tabung 15 ml mengandung 0,6 ml 0,2 M NaOH. Setelah
5 menit, sampel diencerkan dengan tambahan 2,8 ml dapar fosfat (pH 6,0) dan
dianalisis dalam prosedur spektrofotometri.
2. Sianida bebas (HCN sianohidrin +)
Sejumlah ekstrak 0,1 ml dicampur dengan 0,4 ml dapar fosfat pH 4.0 dalam tabung
15 ml, dan ditambahkan NaOH 2M 0,6 ml. Setelah 5 menit, tambahkan 2,9 ml buffer
fosfat (pH 4.0) dan campuran dianalisis secara spektrofotometri.

Standar Kalibrasi
Solusi standar diuji seperti yang dijelaskan dalam IITA. Kurva kalibrasi ditetapkan
setidaknya sekali setiap hari. Untuk sampel, 0,1 ml kloramin T ditambahkan dan kocok.
Setelah 5 menit, pereaksi warna 0,6 ml (asam isonicotinic / pereaksi asam barbiturat)
ditambahkan dan dicampur dengan baik. Absorbansi diukur secara spektrofotometri
setelah 20 menit pada 600 nm. Analisis duplikat untuk sampel dan solusi standar
dilakukan.

Perhitungan konten sianida

Total sianida, sianida bebas dan konten HCN dari sampel dihitung sebagai
setara HCN mg / kg dwt menggunakan formula di bawah ini.

berat sampel (g)+media ekstraksi (mL)

Faktor ekstraksi = berat sampel (g)

absorbansi sampel−Y−intersep standar

Konten sianida (mg / l) = slop standar

Konten sianida (mg / kg fwt) = sampel faktor pengenceran × faktor ekstraksi × larutan
sampel konten sianida

konten sianida (mg/kgfwt x 100)

Konten sianida (mg / kg dwt) = berat sampel kering

Glikosida sianogenik dihitung sebagai (sianida total dikurangi sianida bebas)

dan sianohidrin sebagai (sianida bebas dikurangi HCN).

Analisis Data
Data tentang kadar glikosida sianogenik ditentukan, dihitung dan dicatat dalam mg
/ kg berat badan baru. Tingkat komputasi glikosida sianogenik dalam daun, batang dan
bagian akar yang berbeda dari jenis liar dan singkong transgenik dianalisis dengan uji-
t siswa yang tidak berpasangan pada tingkat kepercayaan 95% (P <0,05). Perangkat
lunak statistik Minitab (versi 2012) digunakan untuk analisis data.
Figure 2: Flow sheet of the assay procedure to determine cyanogenic compounds [13,14].

Figure 3: Calibration curves using linamarin (n=2), cyanohydrin (n=6) and

HCN (n=4).
4. Hasil dan Pembahasan

Penentuan kandungan senyawa sianogen dalam akar dan daun singkong

Kedua jenis singkong liar dan transgenik Kenya dianalisis untuk mengetahui
kandungan senyawa sianogenik linamarin, sianohidrin dan asam hidrosianat (HCN).
Di semua jalur transgenik, ada penurunan yang luar biasa dalam kadar senyawa
sianogenik dibandingkan dengan rekan tipe liar mereka. Jenis liar Kibanda meno
memiliki kadar linamarin dan asam hidrosianat tertinggi, sedangkan jenis liar Serere
memiliki kadar sianohidrin tertinggi. Tipe liar dari model kultivar TMS 60444
memiliki tingkat terendah dari semua senyawa sianogenik yang ditentukan dalam
penelitian ini.
Kadar linamarin pada genotipe tipe liar lebih tinggi dari 10 mg / kg fwt, yang
merupakan level maksimum yang direkomendasikan linamarin oleh FAO. Dalam
semua genotipe transgenik, kadar linamarin berkurang ke tingkat di bawah FAO
maksimum yang direkomendasikan linamarin.

Penentuan distribusi total kandungan sianida dalam akar singkong

Secara umum, bagian yang lebih dekat ke korteks akar dan lebih dekat ke ujung
akar basal mengandung lebih banyak sianida daripada bagian di dekat pusat akar.
Untuk tipe liar dari model kultivar TMS 60444, total kandungan sianida berkisar dari
73 mg / kg fwt untuk bagian cakram pusat dari akar hingga 286 mg / kg fwt untuk
korteks akar. Di sisi lain untuk garis transgenik TMS 60444, total kandungan sianida
berkisar dari 14 mg / kg fwt untuk ujung akar basal hingga 55 mg / kg fwt untuk
wilayah kortikal akar. Akar jenis liar Adhiambo lera memiliki kadar sianida total.
Gambar 4: Kandungan Linamarin dari ekstrak asam fosfat dari akar singkong
segar. * P <0,05 untuk jenis transgenik versus liar; Kadar linamarin maksimum Gambar 6: Kandungan HCN dari ekstrak asam fosfat dari akar
yang disarankan adalah 10 mg / Kg fwt singkong segar. * P <0,05 untuk jenis transgenik versus liar.

Gambar 5: Kandungan sianohidrin dari ekstrak asam fosfat dari akar Gambar 8: Kandungan sianohidrin dari ekstrak asam fosfat
singkong segar. * P <0,05 untuk jenis transgenik versus liar. dari daun singkong yang baru ditumbuk. * P <0,05 untuk
jenis transgenik versus liar.

Gambar 7: Kandungan Linamarin dari ekstrak asam fosfat dari

daun singkong segar. * P <0,05 untuk jenis transgenik versus liar.
 Mulai dari 69 mg / kg fwt untuk disk pusat akar hingga 289 mg / kg fwt untuk
korteks akar. Total kadar sianida dalam akar relatif transgeniknya berkisar dari 17 mg
/ kg fwt untuk ujung akar basal hingga 62 mg / kg fwt untuk korteks akar. Ada
perbedaan nyata yang nyata dalam kadar sianida total antara garis tipe transgenik dan
liar (P <0,05).
Tingkat sianogenik dari kultivar singkong berkisar dari 10 mg / kg fwt hingga 500
mg / kg fwt . Total kandungan sianida di akar jenis singkong transgenik liar yang
digunakan dalam penelitian ini tidak melampaui batas yang direkomendasikan
Organisasi Kesehatan Dunia yaitu 10 mg/kg singkong segar.

Distribusi sianida total dalam akar singkong yang dievaluasi dalam penelitian ini
berbeda di antara genotipe yang diteliti. Hal ini dapat dijelaskan oleh fakta bahwa
tingkat ekspresi gen CYP79D1 / D2 bervariasi di antara genotipe singkong. Ini
menyiratkan bahwa beberapa genotipe singkong lebih sianogen daripada yang lain.

5. Kesimpulan

Distribusi sianida total dalam akar singkong yang dievaluasi dalam penelitian ini
berbeda di antara genotipe yang diteliti. Hal ini dapat dijelaskan oleh fakta bahwa
tingkat ekspresi gen CYP79D1 / D2 bervariasi di antara genotipe singkong. Ini
menyiratkan bahwa beberapa genotipe singkong lebih sianogen daripada yang lain.
Tingkat sianogenik dari kultivar singkong berkisar dari 10 mg / kg fwt hingga 500
mg / kg fwt . Total kandungan sianida di akar jenis singkong transgenik liar yang
digunakan dalam penelitian ini tidak melampaui batas yang direkomendasikan
Organisasi Kesehatan Dunia yaitu 10 mg/kg singkong segar.

6. Daftar Pustaka
Diero M. Ngugi, dkk. ( 2015 ). Determination Of Cynogenic Compounds Content In
Transgenic Acynogenic Kieyan Cassava ( Monihot Esculenta Crantz) Genotypes :
Linting Molecular Analysis To Biochemical. Analytical & Bionalytical Tiechniques
Volume 6: 1-7.