PURIFIKASI PROTEIN REKOMBINAN DARI KLON GEN GAG-CA SEBAGAI

KANDIDAT VAKSIN VIRUS PENYAKIT JEMBRANA

Penyebab penyakit Jembrana adalah suatu Lentivirus, yang disebut virus penyakit
Jembrana atau Jembrana disease virus (JDV) yang merupakan anggota dari famili Retroviridae
(Kertayadnya et al., 1993), dan lebih khusus merupakan anggota sub famili Lentiviridae
(Chadwick et al., 1995a). Gejala klinis yang utama adalah sebagai berikut: demam, lethargy,
anorexia, dan pembengkakan nodus limpha superficial. Penyakit Jembrana menyebabkan
perubahan haemotologis pada sapi yang terinfeksi: leukopenia (sebagai akibat dari limphopenia,
eosinopenia, dan neutropenia), thrombocytopenia, anemia, peningkatan konsentrasi urea dalam
darah, dan penurunan konsentrasi protein plasma. Perubahan patologis juga terjadi, termasuk
kerusakan vaskular, seperti haemorragic, tetapi perubahan yang paling khas ialah
lymphadenopathy dan splenomegaly. Dengan teknik hibridisasi in situ pada binatang percobaan,
pada awalnya, virus penyakit Jembrana ditemukan di banyak sel pada berbagai jaringan, seperti
limpa, nodus limpatikus, paru-paru, sumsum tulang, hati, dan ginjal. al., 1998). Selama kejadian
akut, virus penyakit Jembrana dapat dideteksi pada air liur dan air susu sapi. Penularan terjadi
secara langsung dengan kemungkinan melalui conjunctival, intranasal, dan mulut. Pada
kejadian akut, titer virus sangat tinggi, tetapi menurun setelah 60 hari kejadian, dan virus tidak
lagi dapat dideteksi pada cairan sekresi (Soeharsono et al., 1995).

A. Metode dan Bahan Penelitian

a) Bahan :
1. Escherichia coli BL21
2. IPTG (isopropil- ß-d-thiogalaktopiranosida)
3. Medium 2XYTA
4. Ampicillin (untuk isolasi protein rekombinan)
5. Sodium deodecyl sulfate (SDS)
6. Phosphat buffer saline
7. Larutan destaining
8. Resolving gel 10%
9. Stacking gel 3%
10. Elektrode buffer
11. 4 x laemmli buffer
12. SIGMA marker protein low range(untuk SDS-PAGE)
13. Reduced glutathione
14. Thrombin protease
15. Phosphate buffer saline (untuk pemotongan protein fusi)

b) Alat :
1. Elektrophoresis SDS-PAGE
2. Ependorf PlastibrandR (Brand GmbH,Germany)
3. Tips untuk mikropipet (masing-masing 40-200 µl dan 200-100 µl)
4. Sonikator Labsonic U (B. Bram, USA)
5. Sentrifus Beckman J-6B (Smithkline Beckman Co., USA)
6. Sentrifus Megafuge (Heraeus Sepatech GmbH, Germany)
 7. Freezer –70oC dan –20oC
8. Refrigerator;
9. Spektrofotometer
10. Shaking incubator
11. Waterbath dengan pengatur suhu
12. MicroSpin GST Colums Purification (Amersham Pharmacia Biotech)
13. Laminar air flow.

c) Metode :
1. Isolasi plasmid pGEX-CA dari E.coli DH5a dengan High Pure Plasmid
Isolation Kit (Roche)

Kultur bakteri E.coli DH5a yang mengandung pGEX-CA diambil sebanyak 4

ml untuk diambil peletnya dengan cara sentrifugasi 13.000 rpm selama 10
menit.

sdsdsds
Pelet diresuspensikan dengan 250 µl buffer 1 (0,1 M Rnase A, 50 mM Tris-
HCl dan 10 mM EDTA, pH 8,0), ditambahkan 250 µl buffer 2 (0,2 M NaOH
dan 1% SDS) dan dicampur dengan membolak-balik pada suhu kamar selama
5 menit.

Tambahkan 350 µl buffer 3 (4 M Guanidin hidroklorid dan 0,5 M potassium

asetat, pH 4,2) dicampur dengan membolak-balik, diinkubasi dalam es selama
5 menit. Supernatan diambil dengan cara sentrifugasi 13.000 rpm selama 10
menit. Supernatan yang didapat kemudian dimasukkan dalam 29 column tube
High Pure Isolation Kit (Roche) dan dilanjutkan dengan sentrifugasi 13.000
rpm selama 60 detik.

Tambahkan 700 µl buffer 5 (20 mM NaCl, 2 mM Tris-HCl pH 7,5) dalam

column tube, sentrifugasi 13.000 rpm 60 detik sebanyak 2 kali. Column tube
kemudian dipindahkan ke kolektor tabung bersih dan ditambahkan 50 µl
buffer elusi 6 (10 mM Tris-HCl, pH 8,5).

DNA plasmid dielusi dengan melakukan sentrifugasi 13.000 rpm 60 detik.

Hasil elusi merupakan plasmid DNA yang siap dianalisis ada tidaknya sisipan
gen gag-ca di dalamnya.
2. Isolasi dan Amplifikasi Gen gag-ca dari Plasmid DNA dengan PCR
PCR dilakukan dengan Pure TaqReady to Go PCR kit (Amersham
Bioscience) dengan total volume reaksi sebanyak 25 µl, yang terdiri dari:
2 µl DNA template (konsentrasi 10-20 pg/µl) masing-masing 1 µl forward
primer dan reverse primer (konsentrasi 20 pmol/µl) dan 21 µl aquades
steril. Reaksi PCR dalam mesin thermocycler dilakukan dengan kondisi
sebagai berikut: denaturasi awal pada suhu 940C selama 5 menit, 35 siklus
reaksi terdiri dari: denaturasi (940C, 40 detik), annealing (550C, 40 detik),
ekstensi (720C, 1 menit 30 detik), ekstensi tambahan pada suhu 720C
selama 10 menit. Setelah dilakukan reaksi PCR, sebanyak 6 µl hasil PCR
ditambah 2 µl loading buffer dielektroforesis pada gel agarose 1% selama
60-90 menit (kekuatan listrik dengan tegangan konstan 30 100 Volt).
Selanjutnya, hasil elektroforesis difoto dengan polaroid gel cam
(Polaroid).

3. Kondisi Kultur Bakteri

Klon positif yang digunakan adalah pGEX-CA dalam E.coli BL21.
Media kultur yang digunakan adalah 2XYTA (16 g/l tryptone; 10 g/l yeast
ekstrak; 5 g/l Na Cl; pH 7) yang ditambahkan ampicillin sampai
konsentrasi akhir 100 µg/ml. Untuk induksi sintesis protein digunakan
konsentrasi akhir IPTG 1 mM. Penambahan IPTG dilakukan pada saat OD
600 nm kultur mencapai sekitar 0,6. Suhu inkubasi kultur yang digunakan
adalah 370C dengan penggojogan keras.

4. Isolasi Protein Rekombinan

Starter untuk ekspresi dibuat dengan menginokulasikan klon
pGEXCA pada 5 ml media 2XYTA, ditambah ampicillin 100 µg/ml,
kemudian diinkubasi pada suhu 370C dengan penggojogan keras selama
semalam.
Untuk isolasi dan purifikasi protein, digunakan kondisi kultur dan
induksi IPTG paling optimal sebagai berikut: dari starter pGEX-CA
kemudian diambil 2 ml dan ditambahkan pada 20 ml media 2X YTA yang
mengandung ampicillin 100 µg/ml. Kultur kemudian diinkubasi pada suhu
370C dengan penggojogan keras selama 4 jam. Penambahan IPTG
konsentrasi akhir 1 mM dilakukan pada saat OD600 nm kultur mencapai
0,6 (kira-kira 1 atau 2 jam setelah inokulasi). Pemanenan kultur dilakukan
setelah masa inkubasi selama 4 jam pasca induksi IPTG.

5. Analisis Protein Rekombinan

Hasil inkubasi selama 4 jam setelah induksi IPTG 1mM kemudian diambil 20
ml untuk diambil pelet dengan sentrifugasi 3.000 rpm selama 15 menit pada
suhu 40C. Pelet yang diperoleh dicuci dengan PBS (Phosphat buffer saline)
sebanyak 2 kali.

Pellet diresuspensikan dengan 1 ml PBS, dan kemudian dilakukan sonikasi

pada sampel selama 30 detik sebanyak 4 kali untuk masing-masing sampel.
Dilakukan sentrifugasi 3.000 rpm selama 15 menit pada suhu 40C.
 Sebanyak 20 µl lysate selanjutnya dicampur dengan volume yang setara
dengan 4x Laemmli buffer dan dianalisis dengan SDS-PAGE dan
elektroforesis dijalankan dengan 3,5 volt/cm panjang gel.

Sebanyak 20 µl lysate selanjutnya dicampur dengan volume yang setara

dengan 4x Laemmli buffer dan dianalisis dengan SDS-PAGE dan
elektroforesis dijalankan dengan 3,5 volt/cm panjang gel.

6. Purifikasi Protein
Purifikasi protein yang terdapat dalam lysate menggunakan MicroSpin
GST Colums Purification (Amersham Pharmacia Biotech).

Larutan Glutathione Sepharose 4B MicroSpin dalam kolom dicampur

terlebih dahulu dengan cara memvorteknya. Tutup dilepaskan pada bawah
kolom dan dilakukan sentrifugasi 2.000 rpm selama 1 menit supaya
matriksnya mengendap di bawah kolom.

Supernatan hasil isolasi protein diambil 600 µl untuk dimasukkan dalam

kolom MicroSpin GST. Sesudah dicampurkan dengan Glutathione Sepharose
dari kolom, dilakukan inkubasi pada suhu kamar selama 10 menit untuk
penempelan protein fusi GST. Dilakukan sentrifugasi 2.000 rpm selama 1
menit. Kolom dicuci dengan 600 µl PBS 1X pH 7,3 sebanyak 3 kali dengan
melakukan sentrifugasi 2.000 rpm selama 1 menit.

Kolom kemudian dikeringkan pada kertas tissu bersih dengan

mendiamkannya 5 menit pada suhu ruang. Selanjutnya, ditambahkan 100 µl
buffer elusi (50 mM Tris-HCl, 10 mM glutathione pereduksi, pH 8,0) dan
dilakukan inkubasi pada suhu ruang selama 10 menit, kemudian dilakukan
sentrifugasi 2.000 rpm selama 1 menit.

7. Pengukuran Kadar Protein dengan Biuret Protein Assay

Supernatan protein yang diperoleh diambil 4 µl untuk kemudian
ditambah dengan 796 µl dH2O dan 200 µl larutan Biuret. Dicampur
dengan baik dengan vortex dan langsung dilakukan pengukuran
absorbansi pada OD595 nm.

8. Pemotongan Protein Fusi CA dengan Protease Thrombin

 Protein CA yang diperoleh dari hasil purifikasi dengan
menggunakan kolom MicroSpin merupakan protein yang masih berfusi
dengan GST, sehingga diperlukan pemotongan dengan Thrombin Protease
untuk mendapatkan protein yang murni ialah yang sudah terpisah dengan
GST. Pembuatan larutan thrombin dilakukan dengan melarutkan 500 unit
thrombin dalam 0,5 ml PBS (40C), kemudian digojog sampai terlarut.
Selanjutnya, larutan di-aliquot dan disimpan pada suhu -80oC. Untuk
melakukan pemotongan protein fusi, dipersiapkan campuran 80 µl larutan
thrombin (1 unit/µl) dicampur dengan 920 µl PBS.
Untuk pemotongan protein fusi CA dengan thrombin terlebih
dahulu perlu dilakukan optimasi waktu inkubasi dan unit thrombin yang
dipergunakan. Berdasarkan protokol dari Amersham Pharmacia
disebutkan bahwa waktu inkubasi untuk pemotongan protein fusi
menggunakan thrombin berkisar antara 2- 16 jam, sehingga dilakukan
pemotongan protein fusi CA dengan perlakuan waktu inkubasi 2, 4, 6, 8,
10,12, 14, dan 16 jam. Hasil pemotongan protein fusi dengan variasi
waktu inkubasi ini kemudian dianalisis dengan SDS-PAGE 15% untuk
mengetahui profil protein yang dihasilkan, berdasarkan hasil optimasi
tersebut akan dipilih waktu inkubasi yang optimal.
Untuk unit thrombin yang diperlukan dalam pemotongan protein
fusi CA ini juga dilakukan optimasi waktu inkubasi, dalam optimasi ini
dipergunakan perlakuan unit thrombin 0, 2, 4, 6, 8, dan 10 unit. Hasil
pemotongan protein fusi dengan variasi unit thrombin ini selanjutnya
dianalisis dengan SDS-PAGE 12,5% untuk menentukan unit thrombin
yang memberikan hasil pemotongan yang optimal.

9. Pengukuran Konsentrasi Protein CA dengan Biuret Assay

Supernatan protein hasil pemotongan dengan thrombin (protein
CA murni), diambil 4 µl untuk kemudian ditambah dengan 798 µl dH2O
dan 200 µl larutan Biuret. Dicampur dengan baik dengan vortex dan
langsung dilakukan pengukuran absorbansi pada OD595 nm.

B. Hasil dan Pembahasan

a) Polymerase Chain Reaction (PCR)
PCR dilakukan untuk memastikan bahwa plasmid rekombinan masih
membawa insert gen gag-ca. PCR dilakukan dengan mengacu pada prosedur yang
telah dilakukan sebelumnya (Kusumawati et al., 2002a).
Dari Gambar 1 dapat dijelaskan bahwa hasil PCR dengan templatepGEXCA
menunjukkan gen gag-ca berhasil diisolasi dan diamplifikasi dengan munculnya
pita DNA yang jelas. Forward primer dalam reaksi PCR menempel pada template
DNA, ialah mulai 9 basa di depan ORF gag-ca dalam konstruksi pGEX-CA,
sementara reverse primer menempel mulai 9 basa dibelakang ORF gag-ca di
dalam konstruksi pGEX-CA. Hasil amplifikasi DNA yang diinisiasi oleh
pasangan primer tersebut menghasilkan produk PCR dengan ukuran panjang
sekitar 0,7 kb, meskipun DNA template tampak sebagai band DNA yang tipis
dalam gel agarose 1,5 – 2 %.
b) Isolasi Protein Rekombinan
Protein rekombinan diekspresikan dengan menumbuhkan bakteri
transforman yang mengandung plasmid rekombinan (pGEX-CA) ke dalam
medium 2X YTA. Medium 2X YTA merupakan medium diperkaya yang
mengandung tripton dan ekstrak yeast, sehingga pertumbuhan bakteri transforman
diharapkan lebih maksimal untuk dapat mengekspresikan protein rekombinan.
Dari Gambar 2 dapat dijelaskan bahwa sampel E.coli BL21 pGEX-CA
yang dipisahkan dengan elektroforesis dari lajur 7–9 memperlihatkan adanya
ekspresi yang lebih tinggi pada pita proteinnya bila dibandingkan dengan pita dari
lajur 1 – 3 dan lajur 4 – 6. Hal ini disebabkan karena lajur 7–9 merupakan pGEX-
CA yang diinduksi dengan IPTG sehingga ekspresinya optimal, sementara lajur
4–6 menunjukkan ekspresi yang lebih rendah dibandingkan lajur 7–9 karena tidak
adanya induksi IPTG. Sementara itu, lajur 1–3 menunjukkan ekspresi yang paling
rendah karena hanya berisi E.coli BL21 tanpa plasmid (kontrol). Hasil ini
menunjukkan bahwa protein CA dari virus Jembrana yang berfusi dengan GST
dapat diekspresikan dari pGEX-CA dan diproduksi oleh E.coli BL21.

c) Purifikasi Protein
Purifikasi dilakukan untuk memperoleh protein rekombinan yang akan
digunakan sebagai calon vaksin virus penyakit Jembrana. Purifikasi protein ini
dilakukan dengan cara sebagai berikut : sampel hasil ekspresi konstruksi
pGEXCA sebanyak 600 µl supernatan ekstrak bakteri dimasukkan dalam kolom
MicroSpin GST, kemudian dilakukan pencucian dengan PBS 1x sebanyak 2 kali
dan selanjutnya di-elusi dengan menggunakan reduced glutathione sebanyak 3
kali. Protein dari berbagai tahap purifikasi kemudian dianalisis dengan
elektroforesis SDS-PAGE untuk melihat profil pita proteinnya.
Hasil ini menunjukkan bahwa kolom afinitas Glutathione Sepharose
cukup efisien, baik dalam penyingkiran protein yang tidak berinteraksi maupun
dalam kapasitasnya untuk purifikasi protein rekombinan yang berfusi dengan
GST. Dari proses purifikasi ini dapat disimpulkan bahwa protein CA dapat
diekspresikan dengan efisien dari konstruksi pGEX-CA sebagai protein yang
berfusi dengan GST, dan purifikasinya dapat dilaksanakan dengan baik
menggunakan kolom Glutathione Sepharose 4B (MicroSpin GST).

d) Pengukuran Konsentrasi Protein Fusi

Pengukuran konsentrasi protein fusi CA dilakukan dengan Biuret Protein
Assay, selanjutnya hasil pengukuran OD595nm dihitung dengan menggunakan
kurva standard protein untuk menentukan konsentrasi protein dengan persamaan
fungsi sebagai berikut: y = 0,0465x – 0,0157 (di mana x merupakan konsentrasi
protein; dan y merupakan absorbansi). Dari hasil pengukuran OD595 nm
didapatkan bahwa absorbansi sampel hasil purifikasi dengan MicroSpin GST
adalah 0,056. Dengan demikian, konsentrasi protein fusi CA setelah proses
purifikasi adalah sebesar 1,542 µg/ml.

e) Pemotongan Protein Fusi CA dengan Thrombin Protease

 Pada tahap selanjutnya, protein CA yang berfusi dengan GST kemudian
dilakukan pemotongan dengan Thrombin Protease. Thrombin Protease
merupakan enzim yang bekerja sebagai katalis dalam reaksi pemecahan molekul
protein dengan cara hidrolisis, yaitu memecah ikatan pada rantai peptida. Berat
molekul bovine Thrombin Protease ialah sekitar 37 kDa (Amersham Biosciences,
2002). Tujuan pemotongan protein fusi CA dengan Thrombin Protease adalah
untuk memperoleh protein CA murni yang akan digunakan untuk imunisasi.
Dari Gambar 4 dapat dijelaskan bahwa lajur 1 merupakan protein CA
yang masih berfusi dengan GST dengan estimasi berat molekul sekitar 48 kDa.
Setelah melalui proses pemotongan dengan Thrombin Protease didapatkan protein
CA murni dengan berat molekul sekitar 22 kDa. Dari hasil SDS-PAGE tersebut
juga dapat disimpulkan bahwa variasi waktu inkubasi untuk pemotongan dengan
thrombin menghasilkan band yang diperkirakan mempunyai berat molekul yang
sama. Hal ini dapat diasumsikan bahwa waktu inkubasi tidak berpengaruh
terhadap hasil pemotongan. Bertolak dari hasil tersebut digunakan waktu inkubasi
yang paling singkat, yaitu 2 jam, untuk pemotongan CA dengan Thrombin
Protease. Selanjutnya, unit thrombin yang digunakan untuk pemotongan protein
fusi CA dengan GST perlu dilakukan optimasi, dalam optimasi ini dipergunakan
perlakuan unit thrombin 0, 2, 4, 6, 8, dan 10 unit. Hasil pemotongan dengan
variasi unit thrombin ini selanjutnya dianalisis dengan SDS-PAGE 12,5%.
Berdasarkan hasil SDS-PAGE diketahui bahwa pemotongan CA dengan 6 unit
thrombin memberikan hasil pemotongan yang optimal. Hasil optimasi unit
thrombin untuk pemotongan protein fusi CA dapat dilihat pada gambar 5.

C. Kesimpulan

Berdasarkan penelitian yang telah dilakukan, dapat disimpulkan bahwa Protein

CA murni hasil ekspresi klon gen gag-ca dapat diisolasi melalui purifikasi dengan kolom
afinitas dan pemotongan dengan Thrombin Protease.