BAB 9

Enzim-Enzim Pada Proses Rekombinasi

Analisis genetik telah mengungkap enzim yang berperan pada rekombinasi E.coli.
Dengan skrining Sel F+ E.coli yang sudah mutasi dengan teknik replica plating
memungkinkan orang mengidentifikasi mutan pada cawan yang mulanya tidak
membentuk rekombinan setelah berkonjugasi dengan sel Hfr. Mutan tidak bisa
berekombinasi berkaitan dengan adanya tiga gen, recA, recB, recC.

Enzim – enzim yang dikode gen recA, recB, recC

Protein recA adalah enzim yang berperan pada rekombinasi umum maupun
pada perbaikan DNA. Gen recA+ dibutuhkan untuk rekombinasi pada E.coli. Pada
kondisi in vitro protein yang dimurnikan mengkatalisasi pembentukan struktur
Holliday. Protein recA berikatan pada molekul DNA unting ganda atau tunggal.
Kemudian menggunakan energi yang diperoleh dari hidrolisis ATP untuk membuka
DNA unting ganda, memungkinkan terjadi perpasangan dengan DNA unting tunggal.
Hal ini memungkinkan terjadi sinapsis molekul DNA yang memiliki urutan pasangan
nukleotida yang mirip. Protein recA juga mengkatalisasi transfer unting berikutnya
sehingga terbentuk suatu jembatan silang( struktur Holliday) diikuti migrasi jembatan
silang tadi.
Rekombinasi E.coli berlangsung di plasmid ditunjukkan pada hasil
pemotongan palsmid Col E1 pada tapak restriksi dengan bantuan enzim EcoR1.
Bentukan yang serupa angka delapan sebelum terpotong enzim endonuklease EcoR1,
sama sekali tidak ditemukan pada plasmid E.coli yang memiliki gen recA-. Ini
menunjukkan bahwa bentukan angka delapan merupakan perantara rekombinasi yang
dikatalisasi oleh recA. Bentukan serupa angka delapan sebaliknya ditemukan pada sel
E. Coli yang memiliki gen recB - atau recC -. Jadi disimpulkan bahwa produk kedua
gen tersebut akan bekerja setelah protein recA bekerja. Dalam hal ini recB + dan recC
+
mengkode dua subunit suatu nuklease yang tergantung ATP. Diduga nuklease
berperan sebagai suatu resolvase yang memotong jembatan silang pada struktur
Holliday untuk menyempurnakan proses rekombinasi.
Protein recA juga berperan dalam perbaikan DNA. Protein recA memiliki suatu
aktivitas proteolitik yang distimulasi DNA unting tunggal. Aktivitas ini memotong
dua macam molekul reseptor yaitu profag lamda, yang menyebabkan induksi profag
dan reseptor lain yang dibentuk gen lex A. Represor kedua ini mengatur tingkat ekpresi
gen recA dalam mekanisme perbaikan DNA fungsi survival yang disebut fungsi SOS.
Berkenaan dengan fungsi SOS, dalam keadaan normal represor lexA hanya
mengkondisikan ekpresi gen A pada tingkat rendah dengan begitu dapat menghasilkan
cukup protein recA yang dibutuhkan untuk rekombinasi. Di lain pihak, bilamana sel
terancam mengalami kerusakan DNA, maka aktivasi proteolitik protein recA diaktivasi
menghancurkan represor lexA, menyebabkan induksi gen uvr yang membantu dalam
pemulihan sel.
Jika enzim recB dan recA tidak ada mengakibatkan, hasil rekombinan
berkurang ratusan kali lebih sedikit. Dikatakan pula aktivitas kompleks enzim recBC
dapat membuka lilitan DNA maupun aktivitas nuklease. Selain itu kompleks ini juga
dapat memunculkan DNA unting tunggal yang memiliki ujung bebas yang dapat
mendorong enzim recA melakukan reaksi perpasangan. Enzim reBC dapat membuka
lilitan pada DNA yang memiliki ujung dupleks yang bebas dengan memanfaatkan ATP.
Enzim recBC juga mendorong rekombinasi pada DNA yang memiliki tapak Chi, tapak
tersebut memiliki urutan-urutan
5’-GTCGGTGG-3. DNA yang sedang terbuka lilitanya, aktivitas nuclease enzim
recBC memotong unting tunggal DNA didekat tapak Chi. Terputusnya DNA
menyebabkan DNA tidak melilit kembali pada saat enzim recBC dan terbentuklah
untaian unting tunggal berujung bebas maupun suatu celah yang justru celah dan ujung
bebas recA berikatan dan mulai mendorong terjadinya pertukaran unting DNA dengan
suatu urutan-urutan yang homolog.
E.coli yang normal molekul DNA tidak memiliki ujung-ujung bebas. Tapak-
tapak Chi itu justru berfungsi pada saat konjuasi. Dalam hal ini pada saat konjugasi itu
suatu ujung DNA dimasukan oleh bakteri jantan dan selanjutnya diduga bahwa enzim
recBC kemudian bergerak menyusuri DNA yang diinfeksi dan memotong pada tapak
Chi. Akibat selanjutnya adalah terjadinya rekombinasi antara DNA yang diinjeksi dan
DNA sel resipien.
Satu enzim lain yang ikut berperan pada proses rekombinasi yang homolog
adalah enzim nuclease maupun beberapa protein yang diperlukan dalam sintesis DNA.
Enzim nuclease memotong sambungan Holliday sehingga memisahkan molekul DNA
rekombinan. Contoh protein pada sintesis DNA antara lain protein SSB yang
membantu fungsi protein enzim recA. Demikian pula enzim polymerase DNA yang
mengisi bagian yang hilang akibat DNA rekombinan terpotong dan DNA ligase yang
menutup celah yang tertinggal setelah enzim polymerase DNA bekerja.

Enzim pada Insersi λ kedalam genom E.coli yang terjadi melalui rekombinasi
Fag λ mengkode enzim integrase yang berperan pada saat insersi DNA fag ke
dalam E.coli. Insersi tersebut terjadi melalui rekombinasi pada tapak-tapak spesifik di
kedua genom DNA dan hasil insersi melalui rekombinasi itu adalah terbentuknya satu
molekul sirkuler baru yang lebih besar.
Selain enzim integrasi, genom fag λ ke dalam genom E.coli juga membutuhkan
protein IHF serta ion-ion magnesium. Tapak-tapak spesifik yang menjadi tempat
berlangsungnya rekombinasi dalam rangka insersi itu adalah attP (pada genom fag λ)
dan attB(pada genom E.coli).
Enzim tersebut dapat berperan pada proses penggabungan, yang akhirnya
berakibat terbentuknya dua molekul DNA yang terpisah-pisah. Hal tersebut diuji
dengan dilakukan merancang terlebih dahulu terbentuknya suatu plasmid buatan yang
memiliki tapak spesifik attB maupun attP yang memungkinkan terbentuknya dua
molekul DNA sirkuler yang lebih kecil.
Enzim integrase dapat berperan sebagai enzim topoisomerase. Dalam hal ini
enzim integrase membuat suatu pemutusan, dalam posisi menyamping; jarak antara
kedua tempat yang terpotong adalah sejauh 7 nukleotida. Pemutusan unting DNA itu
terjadi pada tapak attP maupun tapak attB.
 Diketahui pula bahwa baik enzim integrase maupun protein IHF berikatan pada
posisi yang berbeda sepanjang tapak attP. Segmen tapak attP 250 pasang nukleotida
itu melingkari enzim integrase membentuk struktur seperti suatu nukleosom yang
terkondensasi dan nukleus tersebut mengandung delapan monomer integrase sebanyak.
Kajian lain yang terkait dengan laju rekombinasi yang melibatkan tapak attP
dan attB menunjukan jika urutan inti attP dan attB mengalami perubahan maka laju
rekombinasi akan berkurang dan namun jika hanyak perubahan sedikit, maka laju
masih efisien. Enzim integrase membutuhkan suatu homologi urut-urutan pada daerah
inti, seperti halnya suatu urut-urutan khas yang merupakan tempat pengikatannya.
Sudah diketahui juga bahwa bilamana suatu profag λ diinduksi untuk tumbuh,
maka keadaannya yang terintegrasi akan beralih dan peristiwa itu disebut sebagai
eksisi; DNA fag maupun bakteri terlepas dan bebas satu sama lain. Dalam ini profag λ
memulai eksisi dengan cara mengekspresikan suatu protein yang disebut eksinase.
Protein enzim itu memungkinkan enzim integrase mengkatalisasi rekombinasi yang
mengakibatkan tapak-tapak pelekatan hybrid dari profag. Lebih lanjut kompleks
gabungan enzim integrase dan eksionase berikatan erat pada tapak hybrid bakteri
profag; dan keunikan yang berubah ini mendukung kemampuan enzim untuk
melaksanakan reaksi yang sebaliknya (reverse).

Pertanyaan

1. Bagaimana peran gen recA+ pada proses rekombinasi?

Gen recA+ dibutuhkan untuk rekombinasi pada E.coli. Pada kondisi in vitro protein
yang dimurnikan mengkatalisasi pembentukan struktur Holliday. Protein recA
berikatan pada molekul DNA unting ganda atau tunggal. Kemudian menggunakan
energi yang diperoleh dari hidrolisis ATP untuk membuka DNA unting ganda,
memungkinkan terjadi perpasangan dengan DNA unting tunggal. Hal ini
memungkinkan terjadi sinapsis molekul DNA yang memiliki urutan pasangan
nukleotida yang mirip. Protein recA juga mengkatalisasi transfer unting berikutnya
sehingga terbentuk suatu jembatan silang( struktur Holliday) diikuti migrasi
jembatan silang tadi.