3.

1 Prosedur Kerja

Adapun prosedur kerja dari praktikum Mikrobiologi Pangan Ikani ini

adalah sebagai berikut :
1. Mengambil sampel ikan asin sebanyak 1 kg yang dibeli di pasar Baruga,
Kendari.
2. Membawa sampel ikan asin ke Balai Karantina Ikan dan Pengawasan Mutu
(BKIPM) Kota Kendari untuk menguji mikroba patogen (Salmonella sp. dan
Escherichia coli) pada ikan asin.
3. Menimbang sampel ikan asin sebesar 25 gram sebanyak dua kali untuk
mikroba patogen (Salmonella sp. dan Escherichia coli). Kemudian
memasukkan sampel yang selesai ditimbang kedalam plastik steril dan
membuat tanda dengan menulis nama bakteri Salmonella sp. dan Escherichia
coli. Selanjutnya melakukan pengujian bakteri Escherichia coli dan Salmonella
sp.
4. Prosedur pengujian bakteri Escherichia coli, yaitu sebagai berikut:
a) Menghomogenkan sampel ikan asin dalam plastik steril selama 2 menit dengan
menambahkan larutan Butterfield’s Phosephate (BFP) sebanyak 225 ml.
Kemudian memasukkan kedalam alat stomacher selama 140 detik.
b) Melakukan pengujian pertama yaitu menentukan APM (Angka Paling
Memungkinkan), kemudian menyediakan rak tabung reaksi dan tabung reaksi
sebanyak 9 buah dengan kode (10-11, 10-12, 10-13, 10-21, 10-22, 10-23, 10-31, 10-32,
10-33).
c) Menyalakan bunsen dan menyediakan micropippet, memasukkan sampel ikan
pindang yang selesai dihomogenkan kedalam tabung reaksi menggunakan alat
micropippet 1 ml dan setiap tabung reaksi harus melakukan pembakaran
dengan bunsen diujung bibir tabung reaksi pada saat mau membuka dan
menutup tabung reaksi dan menaruh didalam rak tabung reaksi. Didalam
tabung reaksi sudah berisi 10 ml LTB dari tabung durham. Mengulangi
langkah yang sama dengan semua kode sampel yang ditentukan.
d) Membawa sampel yang diberi kode kedalam alat inkubator, kemudian
menginkubasi sampel ikan asin kering yang telah diberi kode selama 24 jam.
e) Membaca sampel untuk uji APM, kode sampel yang positif tercemar bakteri
kemudian melakukan uji lanjut dimedia yang selektif yaitu media EC Broth.
f) Menanamkan EC Broth sebanyak 1 mL untuk kode sampel ikan asin kering
yang positif Escherichia coli ditandai dengan kekeruhan dan terdapat gas
dalam tabung durham.
g) Menginkubasi kode sampel yang positif dengan media EC Broth selama 48
jam dengan menggunakan waterbath sirkulasi.
h) Melakukan penggoresan ke L-EMB agar menggunakan jarum ose, setelah itu
menginkubasi selama 24 jam pada suhu 35oC.
i) Mengambil 1 koloni yang terpisah dari cawan L-EMB dan menggoreskan
kemedia PCA miring dengan menggunakan jarum ose. Kemudian
menginkubasi selama 24 jam dan melihat hasilnya.
5. Prosedur pengujian bakteri Salmonella sp. yaitu sebagai berikut:
a) Pra pengkayakan
- Menghomogenkan contoh selama 2 menit untuk dianalisa. Secara aseptis,
pindahkan larutan contoh dalam wadah steril yang sesuai dan biarkan dalam
suhu ruang selama 60 menit dengan wadah tertutup. Kocok perlahan dan bila
perlu tentukan pH sampai (6,8 + 0,2). Kocok rata dan kendurkan tutup wadah
secukupnya. Inkubasi 24 jam + 2 jam pada suhu 35℃ + 1℃. Lanjtkan
pengujian sesuai dengan prosedur.
b) Pengkayakan
- Mengencangkan tutup wadah dan kocok perlahan contoh yang diinkubasi.
Untuk produk perikanan dengan tingkat kontaminasi tinggi, pindahkan 0,1 ml
larutan contoh ke dalam 10 ml Rappaport-Vessiliadis (RV) medium dan 1 ml
ke dalam 10 ml Tetrathionate Broth (TTB). Untuk jenis produk perikanan lain,
pindahkan 1 ml larutan contoh ke dalam masing-masing 10 ml SCB dan 10 ml
TTB.
- Menginnkubasi media pengkayakan sebagai berikut :
 Untuk produk perikanan dengan tingkat kontaminasi tinggi, inkubasi RV
medium selama 24 jam + 2 jam pada suhu 42℃ + 0,2℃ (water bath). Inkubasi
TTB selama 24 jam + 2 jam pada suhu 43℃ = 0,2℃ (water bath). Untuk jenis
produk perikanan lain, inkubasi TTB dan SCB selama 24 jam + 2 jam pada
suhu 35℃ + 1℃.
c) Isolasi Salmonella sp.
- Mengocok tabung (dengan vortex) dan dengan menggunakan jarum loop (3
mm) gores TTB yang diinkubasi ke dalam media HE, XLD, dan BSA. Siapkan
BSA sehari sebelum digunakan dan simpan di tempat gelap pada suhu ruang.
- Menggoreskan ke dalam media yang sama dari RV Broth atau SCB.
- Menginkubasi cawan BSA, HE, dan XLD selama 24 jam pada suhu 35℃ +
1℃.
- Mengamati kemungkinan adanya koloni salmonelia
- Mengamati morfologi koloni salmonelia yang khas (typical)
Mengambil 2 atau lebih koloni Salmonella sp. dari masing-masing media agar
selektif setelah 24 jam + 2 jam inkubasi. Koloni-koloni Salmonella sp. yang
khas (typical) adalah sebagai berikut :
- HE agar, koloni = hijau kebiruan sampai biru dengan atau tanpa inti hitam.
Umunya kultur salmonella membentuk koloni besar, inti hitam mengkilat atau
hampir selutuh koloni terlihat berwarna hitam.
- XLD agar, koloni merah jambu (pink) dengan atau tanpa inti hitam. Umunya
kultur Salmonella sp. membentuk koloni besar, inti hitam mengkilat atau
hampir selutuh koloni terlihat berwarna hitam.
- BSA. Koloni coklat, abu-abu atau hitam, kadang-kadang metalik. Biasanya
media di sekitar koloni pada awalnya berwarna coklat, kemudian berubah
menjadi hitam (halo effect) dengan makin lamanya waktu inkubasi. Apabila
koloni yang khas (typical) tumbuh pada BSA setelah 24 jam + 2 jam inkubasi,
ambil 2 koloni atau lebih. Inkubaskan kembali media BSA selama 24 jam + 2
jam. Setelah 48 jam + 2 jam, ambil 2 koloni atau lebih yang khas (typical) yang
tumbuh pada media BSA. Pengambilan ini dilakukan hanya bila koloni yang
tumbuh pada media BSA yang diinkubasi selama 24 jam + 2 jam memberikan
 reaksi yang tidak sesuai pada TSA dan LIA, yang menjadikan kultur ini
dinyatakan sebagai bukan Salmonella sp.
- Melakukan uji biokimia dan serologi terhadap :
- Tiga kultur presumtif-positif TSI dari 1 set media selektif (HE, XLD, dan
BSA) yang digoreskan dari SCB (atau RV Broth untuk produk perikanan
dengan tingkat kontaminasi tinggi) jika ada, dan tiga kultur presumtif-positif
TSI dari media selektif yang digoreskan dari TTB jika ada.
- Jika 3 kultur presumtif-positif TSI tidak teriosolasi dari 1 set media selektif, uji
kultur presumtif TSI yang lain. Uji sedikitnya 6 kultur TSI untuk setiap contoh
yang dianalisa.