Citra R.A.P.P - Fkik

UIN SYARIF HIDAYATULLAH JAKARTA
PREPARASI DAN UJI STABILITAS 177Lu-DOTA-F(ab’)2-

NIMOTUZUMAB SEBAGAI KANDIDAT
RADIOFARMAKA TERAPI KANKER
SKRIPSI
CITRA REZZA AURORA PUTRI PALANGKA

1110102000028
FAKULTAS KEDOKTERAN DAN ILMU KESEHATAN

PROGRAM STUDI FARMASI
JAKARTA
JULI 2014
UIN SYARIF HIDAYATULLAH JAKARTA
PREPARASI DAN UJI STABILITAS 177Lu-DOTA-

F(ab’)2-NIMOTUZUMAB SEBAGAI KANDIDAT
RADIOFARMAKA TERAPI KANKER
SKRIPSI
Diajukan sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Sarjana

Farmasi
CITRA REZZA AURORA PUTRI PALANGKA

1110102000028
FAKULTAS KEDOKTERAN DAN ILMU KESEHATAN

PROGRAM STUDI FARMASI
JAKARTA
JULI 2014
ii
iii
iv
v
ABSTRAK
Nama : Citra Rezza Aurora Putri Palangka

Program Studi : Farmasi
177
Judul Skripsi : Preparasi dan Uji Stabilitas Lu-DOTA-F(ab’)2-
Nimotuzumab Sebagai Kandidat Radiofarmaka Terapi Kanker.
Antibodi monoklonal sudah banyak digunakan untuk terapi kanker salah

satunya adalah nimotuzumab yang merupakan kelompok inhibitor EFGR. Namun
karena berat molekul yang cukup besar berpengaruh negatif terhadap penetrasi,
kecepatan bersirkulasi dan eliminasi oleh sebab itu dalam penelitian ini digunakan
F(ab’)2-nimotuzumab yang difragmentasi untuk penyiapan sediaan 177Lu -DOTA-
F(ab’)2-nimotuzumab. Penyiapan sediaan 177Lu -DOTA-F(ab’)2-nimotuzumab
dilakukan dalam beberapa tahap yaitu fragmentasi nimotuzumab dengan pepsin,
konjugasi dengan p-SCN-Bz-DOTA (F(ab’)2-nimotuzumab : p-SCN-Bz-DOTA
,1:20 dan 1: 50), dan penandaan dengan 177Lu. Hasil penelitian ini diperoleh
kemurnian F(ab’)2- nimotuzumab setelah dimurnikan dengan PD-10 sebesar 89,1
% dengan efisiensi penandaan pada perbandingan F(ab’)2- nimotuzumab dengan
p-SCN-Bz-DOTA 1 : 20 dan 1 : 50 sebesar 4,91 % dan 14,13 %. Kemurnian 177Lu
-DOTA-F(ab’)2-nimotuzumab setelah dimurniakan dengan kolom sephadex G-25
M sebesar 99,9 % dan berdasarkan uji stabilitas dari sediaan177Lu -DOTA-
F(ab’)2- nimotuzumab pada suhu kamar dan 4 0C selama 96 jam menunjukan
sediaan masih stabil.
Kata kunci : 177Lu-DOTA-F(ab’)2-nimotuzumab, Fragmentasi, Nimotuzumab.
vi UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

ABSTRACT
Name : Citra Rezza Aurora Putri Palangka

Program Study : Pharmacy
Tittle : Preparation and stability testing of 177Lu-DOTA-F(ab')2 –
nimotuzumab as a candidate radiophamaceutical for cancer
therapy.
Monoclonal antibodies have been widely used for cancer therapy. One of
them is nimotuzumab which is one of EFGR inhibitor group. However, because
the relatively high molecular weight has negative effect on penetration, circulation
rate and elimination, therefore this study was used the F(ab')2-nimotuzumab for
the preparation of 177Lu-DOTA-F(ab')2-nimotuzumab. The preparation of 177Lu-
DOTA-F(ab')2-nimotuzumab carried out in several stages: fragmentation of
nimotuzumab with pepsin, conjugation with p-SCN-Bz-DOTA (F(ab')2-
nimotuzumab: p-SCN-Bz-DOTA, 1 : 20 and 1: 50), and labeled with 177Lu. The
results of this study showed that the purity of the F(ab')2- nimotuzumab after
purification was 89,1% with labeled efficiency in comparison with F(ab')2 -
nimotuzumab : p-SCN-Bz-DOTA 1 : 20 and 1 : 50 were 4,91% and 14,13%. The
purity of 177Lu-DOTA-F(ab')2-nimotuzumab after purification was 99,9% and
based on stability testing of 177Lu-DOTA-F(ab')2-nimotuzumab at room
temperature and 40C for 96 hours, 177Lu-DOTA-F(ab')2-nimotuzumab still showed
stable.
Keywords :177Lu -DOTA-F(ab’)2-nimotuzumab, Fragmentation, Nimotuzumab.
vii UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

KATA PENGANTAR/UCAPAN TERIMA KASIH
Puji syukur saya panjatkan kepada Tuhan Yang Maha Esa, karena atas
berkat dan rahmat-Nya, saya dapat menyelesaikan skripsi ini. Penulisan skripsi ini
dilakukan dalam rangka memenuhi salah satu syarat untuk mencapai gelar Sarjana
Farmasi pada Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan Universitas Islam Negeri
(UIN) Syarif Hidayatullah Jakarta.
Saya menyadari bahwa, tanpa bantuan dan bimbingan dari berbagai pihak,
dari masa perkuliahan sampai pada penyusunan skripsi ini, sangatlah sulit bagi
saya untuk menyelesaikan skripsi ini. Oleh karena itu, saya mengucapkan terima
kasih kepada :
1) Ibu Dr. Martalena, M.Sc. selaku pembimbing pertama dan Ibu Lina Elfita,
M.Si., Apt. selaku pembimbing kedua, yang memiliki andil besar dalam
proses penelitian dan penyelesaian tugas akhir saya ini, semoga segala
bantuan dan bimbingan ibu mendapat imbalan yang lebih baik di sisi-Nya.
2) Bapak-bapak dan Ibu-ibu karyawan PTRR BATAN yang telah banyak
membantu dalam penelitian saya.
3) Ibu Ofa Suzanti Betha, Msi., Apt selaku Penasehat Akademik yang telah
banyak membantu dalam kelancaran studi.
4) Bapak Prof.(hc) dr MK. Tadjudin, selaku Dekan Fakultas Kedokteran dan
Ilmu Kesehatan Universitas Islam Negeri (UIN) Syarif Hidayatullah
Jakarta.
5) Bapak Drs. Umar, M.sc, Apt selaku ketua Program Studi Farmasi Fakultas
Kedokteran dan Ilmu Kesehatan Universitas Islam Negeri (UIN) Syarif
Hidayatullah Jakarta.
6) Rekan-rekan mahasiswa Program Studi Farmasi Fakultas Kedokteran dan
Ilmu Kesehatan Universitas Islam Negeri (UIN) Syarif Hidayatullah
Jakarta.
7) Kak Titis, Kak Ratna, Kak Rien, Ibu Nilda, dan Kak Diani yang telah
banyak membantu selama penelitian.
viii UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

8) Sahabat dan teman-teman seperjuangan Chaya, Maya, Hani, Niswah, dan
Meta.
9) Sahabat Jejak 22 yang selalu memberikan semangat mencapai titik
tertinggi.
10) Keluarga besar Saidi Karto yang selalu memberi semangat dan doa.
11) Adik-adik saya, Rindie, Dinda, Randu, Vivi, dan Mareta.
Tak lupa kedua orang tua saya, ayahanda Budi Fajar Purwanto dan bunda
tercinta Sri Hartuti atas kasih sayang dan cintanya, semoga segala amalan dan
jerih payah keduanya mendapat balasan yang jauh lebih baik disisi-Nya.
Akhir kata, saya berharap Tuhan Yang Maha Esa berkenan membalas
segala kebaikan semua pihak yang telah membantu. Semoga skripsi ini
membawa manfaat bagi pengembangan ilmu.
Ciputat, Juli 2014
Penulis
ix UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

DAFTAR ISI
Halaman
HALAMAN JUDUL .............................................................................. ii
HALAMAN PERNYATAAN ORISINALITAS .................................. iii
HALAMAN PERSETUJUAN PEMBIMBING .................................. iv
HALAMAN PENGESAHAN ................................................................. v
ABSTRAK ............................................................................................... vi
ABSTRACT ............................................................................................. vii
KATA PENGANTAR ............................................................................. viii
DAFTAR ISI ........................................................................................... x
DAFTAR GAMBAR .............................................................................. xii
DAFTAR TABEL ................................................................................... xiii
DAFTAR LAMPIRAN .......................................................................... xiv
DAFTAR ISTILAH ............................................................................... xv
BAB I PENDAHULUAN .................................................................. 1
1.1 Latar Belakang .............................................................. 1
1.2 Batasan Masalah ........................................................... 4
1.3 Perumusan Masalah ...................................................... 4
1.4 Tujuan Penelitian .......................................................... 4
1.5 Hipotesis ....................................................................... 4
1.6 Manfaat Penelitian ........................................................ 5
BAB II TINJAUAN PUSTAKA ........................................................ 6
2.1 Kanker ............................................................................ 6
2.2 Etiologi Kanker ............................................................. 6
2.3 Antibodi ......................................................................... 8
2.4 Fragmentasi Antibodi Oleh Enzim ................................ 11
2.5 Epidermal Growth Factor Receptor (EGFR) ................. 11
2.6 Radionuklida .................................................................. 14
2.7 Lu-177 ............................................................................ 15
2.8 Nimotuzumab................................................................. 15
2.9 p-SCN-Bz-Dota ............................................................. 16
2.10 Sediaan Radiofarmasi .................................................... 17
2.11 Kromatografi Eksklusi Ukuran atau Size
Exclusion Chromatography (SEC) ................................ 18
2.12 KLT ................................................................................ 19
2.13 SDS-PAGE .................................................................... 19
BAB III METODE PENELITIAN ..................................................... 22
3.1 Lokasi dan Waktu Penelitian ........................................ 22
3.2 Metode Penelitia ............................................................ 22
3.3 Alat dan Bahan
3.3.1 Alat Penelitian .................................................... 22
3.3.2 Bahan Penelitian ................................................. 23
3.4 Fragmentasi Nimotuzumab ............................................ 23
3.4.1 Pemurnian Nimotuzumab .................................... 23
x UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

3.4.2 Fragmentasi Nimotuzumab Menjadi F(ab’)2 ....... 24
3.4.3 Pemurnian F(ab’)2-Nimotuzumab ....................... 24
3.4.4 Analisis F(ab’)2-Nimotuzumab Menggunakan
KCKT .................................................................. 24
3.4.5 Analisis F(ab’)2-Nimotuzumab Menggunakan
SDS-PAGE .......................................................... 25
3.4.6 Pemekatan Protein dengan Protein Filter ............ 25
3.5 Penyiapan 177LuCl3 ........................................................ 25
3.6 Konjugasi p-SCN-Bz-DOTA Pada F(ab’)2 –
Nimotuzumab ................................................................. 25
3.7 Analisis p-SCN-Bz-DOTA-F(ab’)2 -Nimotuzumab
dengan KCKT ................................................................ 26
3.8 Penandaan Immunokonjugat p-SCN-Bz-DOTA-F(ab’)2
Nimotuzumab dengan 177Lu ........................................... 26
3.9 Pemurnian 177Lu-SCN-Bz-DOTA-F(ab’)2-
Nimotuzumab ................................................................. 27
3.10 Uji Stabilitas 177Lu-SCN-Bz-DOTA-F(ab’)2-
Nimotuzumab Pada Suhu Kamar dan Pada 4 0C ........... 27
BAB IV PEMBAHASAN ...................................................................... 28
4.1 Dialisis Nimotuzumab ................................................... 28
4.2 Fragmentasi Nimotuzumab ............................................ 30
4.3 Pemurnian F(ab’)2 -Nimotuzumab ................................. 30
4.4 Analisis Kemurnian F(ab’)2-Nimotuzumab ................... 31
4.5 Konjugasi F(ab’)2-Nimotuzumab dengan p-SCN-Bz-
DOTA ............................................................................ 34
4.6 Penandaan ...................................................................... 36
4.7 Uji stabilitas ................................................................... 41
BAB V KESIMPULAN DAN SARAN............................................... 43
5.1 Kesimpulan .................................................................... 43
5.2 Saran .............................................................................. 43
DAFTAR PUSTAKA ............................................................................. 44
LAMPIRAN ............................................................................................. 49
xi UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

DAFTAR GAMBAR
Halaman
Gambar 2.1. Struktur molekul antibodi ................................................. 8
Gambar 2.2. Murine, chimerized, humanized and human Abs .............. 10
Gambar 2.3. Digesti dari antibodi klas IgG dengan enzim pepsin,
merkaptoetanol, dan enzim papain.................................... 11
Gambar 2.4. Ilustrasi skematik jalur EGFR pengaruh terhadap sel
dan jaringan ....................................................................... 12
Gambar 2.5. Mekanisme kerja obat anti-EGFR pada sel kanker ........... 13
Gambar 2.6. Struktur DOTA (kiri) dan p-SCN-Bz-DOTA ................... 17
Gambar 2.7. Pemisahan 2 ukuran molekul dengan SEC ....................... 18
Gambar 2.8. Pola pemisahan protein dengan SDS-PAGE .................... 20
Gambar 4.1. Kromatogram standar protein ........................................... 28
Gambar 4.2. Kromatogram nimotuzumab ............................................. 29
Gambar 4.3. Cuplikan fraksi-fraksi hasil pemisahan F(ab’)2–
nimotuzumab dan Fc nimotuzumab setelah diberi
pewarna protein ................................................................. 31
Gambar 4.4. Hasil analisis nimotuzumab sebelum dan setelah
fragmentasi ........................................................................ 32
Gambar 4.5. Kromatogram fraksi F(ab’)2-nimotuzumab setelah
dimurnikan......................................................................... 34
Gambar 4.6. Skema reaksi pembentukan imunokonjugat
p-SCN-Bz-DOTA- F(ab’)2-nimotuzumab ........................ 35
Gambar 4.7. Skema reaksi pembentukan radioimunokonjugat
177
Lu-SCN-Bz-DOTA- F(ab’)2-nimotuzumab. ................ 36
Gambar 4.8. Grafik optimasi waktu penandaan SCN-Bz-DOTA-
F(ab’)2-nimotuzumab dengan 177Lu .................................. 38
Gambar 4.9. Radiokromatogaram hasil pemurnian 177 Lu-SCN-Bz-
DOTA- F(ab')2-nimotuzumab ........................................... 40
Gambar 4.10. Radiokromatogram Fraksi 17 dan Fraksi 39 ..................... 41
xii UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

DAFTAR TABEL
Halaman
Tabel 4.1. Komponen standar protein ...................................................... 29

Tabel 4.2. Rf pita-pita standar Vs BM protein – standar. ....................... 32
Tabel 4.3. Hasil analisis nimotuzumab sebelum dan setelah
fragmentasi dengan SDS-PAGE ............................................. 33
Tabel 4.4. Waktu retensi (rt) p-SCN-Bz-DOTA-F(ab’)2-
nimotuzumab dan rt F(ab’)2-nimotuzumab serta
nimotuzumab hasil analisis dengan KCKT ............................. 36
Tabel 4.5. Rf dari komponen-komponen yang terlibat pada proses
penandaan SCN-Bz-DOTA-F(ab’)2-nimotuzumab
dengan 177Lu.beberapa senyawa ............................................. 37
Tabel 4.6. Efisiensi penandaan p-SCN-Bz-DOTA- F(ab’)2–
nimotuzumab dengan 177Lu ..................................................... 39
Tabel 4.7. Persentase kemurnian pada suhu kamar dan suhu 4 0C .......... 42
xiii UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

DAFTAR LAMPIRAN
Halaman
Lampiran 1. Skema Prosedur Penelitian Secara Umum ....................... 49
Lampiran 2. Pembuatan Pereaksi .......................................................... 50
Lampiran 3. Kadar Protein Nimotuzumab Hasil Dialisa..................... 54
Lampiran 4. Gambar Kurva Kalibrasi Kondisi Reduksi ....................... 55
Lampiran 5. Kromatogram Absorbansi Fraksi Hasil Pemurnian
Dengan PD-10 ................................................................... 55
Lampiran 6. Komponen-Komponen yang Terlibat Pada Proses
Penandaan SCN-Bz-DOTA-F(Ab’)2-Nimotuzumab
dengan 177Lu...................................................................... 56
Lampiran 7. Alat Penelitian ................................................................... 57
xiv UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

DAFTAR ISTILAH
APS : Amonium Per Sulfat

BFCA : Bifunctional Chelating Agen
CDR : Complementary Binding Region
EBV : Eipstein Barr virus
EGFR : Epidermal Growth Factor Receptors
Fab : Antigen-Binding Fragment
Fc : Constant Fragment
GFC : Gel-Filtration Chromatography
HAMA : Human Anti-Mouse Antibody
HER : Human Epidermal Growth Factor Receptors
HPLC : High Performance Liquid Chromatography
ITLC-SG : Instan Thin Layer Chromatography – Silica Gel
KCKT : Kromatografi Cair Kinerja Tinggi
KLT : Kromatografi Lapis Tipis
mAb : Monoklonal Antibodi
MAPK : Mitogen-Activated Protein Kinase
NSCLC : Non-Small Cell Lung Cancer
SDS : Sodium Dodecyl Sulfate
SDS-PAGE : Sodium Dodecyl Sulfate Polyacrilamide Gel Electrophoresis
TEMED : Tetrametiletilendiamin
TKIs : Tyrosine Kinase Inhibitor
TLC : Thin Layer Chromatography
VEGF : Vascular Endothelial Growth Factor
2-ME : 2-Mekaptoetanol
xv UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

BAB I
PENDAHULUAN
1.1 Latar Belakang

Kanker merupakan salah satu penyakit tidak menular yang telah
menjadi masalah kesehatan di Indonesia bahkan di dunia. Jumlah
penderita baru diperkirakan 100 penderita dari setiap 100.000 penduduk,
dimana dua per tiga penderita kanker berada di negara berkembang.
Penyakit ini menduduki peringkat ke 6 penyebab terbesar kematian di
Indonesia dengan prevalensi kanker pada masyarakat secara nasional
sebesar 4‰ berdasarkan Riset Kesehatan Dasar (Riskesdas) 2007
(Oemiati, 2011).
Terapi utama untuk kanker berdasarkan pada jenis, lokasi, stadium
kanker, dan kondisi fisik pasien dengan cara operasi atau pembedahan,
radiasi, kemoterapi, immunoterapi, terapi gen atau terapi hormonal. Semua
terapi tersebut memiliki kekurangan dan kelebihan masing-masing. Sesuai
tujuan utama dalam pengembangan terapi kanker adalah untuk merusak
sel kanker namun mempunyai efek minimal pada jaringan sel yang
normal. Dalam beberapa tahun belakangan ini telah mulai banyak
digunakan terapi kanker yang bersifat terarah (targeted therapy) dengan
menggunakan antibodi monoklonal (mAb) (Copper, 1993; Schwartz,
Solin, Olivotto, Ernster, & Pressman, 2000; Tjay & Raharja, 2007; Deter,
2010; Campbell, Rini, Uzzo, & Lane, 2009).
Antibodi monoklonal (mAb) merupakan kelompok medikasi/
farmaka yang sangat penting dalam terapi terarah. Antigen yang menjadi
sasaran mAb dalam terapi kanker adalah antigen yang terekspresikan
secara homogen pada sel kanker namun sedikit terekspresikan pada sel
normal (Widyastuti, 2007).
Epidermal growth factor receptors (EGFR) adalah sekolompok
reseptor yang mengatur diferensasi sel dan poliferasi. Empat jenis reseptor
yang termasuk kelompok EGFR yang telah diidentifikasi adalah human
epidermal growth receptor 1 (HER1/EGFR), HER2, HER3 and HER4.
1 UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

2
HER1/EGFR sementara itu over expressed (diekspresikan secara

berlebih) pada beberapa kanker manusia, termasuk non-small cell lung
cancer (NSCLC), kanker payudara, dan kanker pankreas (Fried &
Hadensenos, 2006; Herbst & Bunn, 2003). Nimotuzumab sebagai inhibitor
EGFR/HER1 mencegah sel kanker menerima pesan yang dibutuhkan sel
untuk tumbuh, berkembang dan menyebar dengan cara menghambat
protein EGFR yang terdapat pada permukaan sel kanker dan dapat
menghambat hasil vascular endothelial growth factor (VEGF) (Reddy &
Couvreur, 2010). Nimotuzumab dilaporkan lebih efektif untuk terapi
kanker over expressed HER-1 jika dikombinasikan dengan regimen yang
mengandung radiasi (Tikhomirov, Garrido, Yang, Sherman, & Perez,
2008).
Radiofarmaka berbasis mAb atau dikenal juga sebagai
radioimmunokonjugat adalah antibodi monoklonal yang ditandai /
dikonjugasikan dengan radionuklida pemancar partikel bermuatan
misalnya beta (β) atau alfa (α) dan juga radionuklida pemancar sinar
gamma () (Reddy, 2010 ; Godewijckstraat, 2012; Acton, 2013;).
Radioimmunoterapi sementara itu (RIT) merupakan terapi kanker terarah
dengan menggunakan radioimmunokonjugat. Pada teknik ini
radioimmunokonjugat akan berkerja secara sinergis dimana antibodi
monoklonal akan membawa radionuklida pada target yang spesifik yang
ada pada permukaan jaringan kanker sedangkan radionuklida akan
mentransfer energi (cross fire) pada sel kanker dimana
radioimmunokonjugat terikat dan juga pada sel kanker yang ada
disekitarnya yang akan menyebabkan hancurnya sel kanker tersebut
(Humani, Ramli, Rustendi, & Subur, 2010; Widyastuti, 2007).
Penggunaan mAb dalam RIT memiliki keterbatasan yang cukup
signifikan salah satunya yaitu berat molekul mAb yang relatif besar
menyebabkan proses akumulasi pada jaringan menjadi lambat dan kecil,
clearance pada darah juga lambat sehingga visualisasi sasaran yang tidak
begitu jelas (Nurlaila, 2007). Keterbatasan mAb karena berat molekulnya
yang besar sementara itu dapat diatasi dengan menggunakan fragmen mAb
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

3
seperti F(ab’)2 hasil fragmentasi mAb utuh dengan menggunakan pepsin

(Hermanson, 1996). Berat molekul F(ab’)2 mAb yang relatif kecil
mempunyai kemampuan penetrasi lebih baik dan cepat, bersirkulasi lebih
cepat, dan eliminasi yang sempurna dimana ikatan dengan hati berkurang.
Penggunaan fragmen F(ab’)2-nimotuzumab dilaporkan tidak
mengguranggi kemampuan / efektifitasnya berikatan secara bivalent
dengan reseptor pada permukaan jaringan kanker dan sebagai penghambat
EGFR.
Salah satu radionuklida yang akhir-akhir ini banyak diteliti /
177
digunakan untuk terapi kanker adalah lutesium-177 (Lu-177 / Lu).
Penggunaan 177Lu secara in vivo perlu memperhatikan sifat Lu yang dalam
keadaan bebas (Lu3+) akan ditangkap secara alami oleh hati, limpa dan
tulang (Palasz & Czekaj, 2000). Oleh sebab itu untuk meminimalkan
177
pelepasan Lu pada organ bukan target, maka dalam penggunaannya
177
secara in vivo Lu digunakan dalam bentuk kompleks logam yang stabil
secara termodinamika dan kinetis yang terkonjugasi pada biomolekul
seperti mAb atau immunoprotein melalui bifunctional chelating agent
(BFCA) (E′ VA TO′ TH., 1994; Gansow, 1991; Kadarisman, Herlina, &
Sriyono, 2011).
Pada penelitian ini akan dilakukan penyiapan kandidat
177
radiofarmaka berbasis fragmen F(ab’)2-nimotuzumab bertanda Lu
dengan menggunakan BFCA p-benzyl isothiocyanate-1,4,7,10-
tetraazacyclododecane-1,4,7,10-tetraacetic acid (p-SCN-Bz-DOTA).
Penyiapan dilakukan dalam beberapa tahap yaitu: 1) Fragmentasi
nimotuzumab dengan pepsin untuk menghasilkan fragmen F(ab’)2-
nimotuzumab; 2) Konjugasi p-SCN-Bz-DOTApada fragmen F(ab’)2-
nimotuzumab; dan 3) Penandaan p-SCN-Bz-DOTA-fragmen-F(ab’)2-
177
nimotuzumab dengan Lu. Radioimmunokonjugat / kandidat
177
radiofarmaka Lu-SCN-Bz-DOTA-fragmen-F(ab’)2-nimotuzumab yang
terbentuk kemudian diuji stabilitasnya pada 4 C dan suhu kamar.

4
1.2 Batasan Masalah

Agar penulisan skripsi ini tidak menyimpang dan mengambang
dari tujuan yang semula direncanakan sehingga mempermudah
mendapatkan data dan informasi yang diperlukan, maka penulis
menetapkan batasan-batasan sebagai berikut:
1. Penandaan F(ab’)2-nimotuzumab dengan 177Lu.
2. Uji kestabilan 177Lu-SCN-Bz-DOTA-fragmen-F(ab’)2-nimotuzumab.
1.3 Perumusan Masalah

1. Bagaimana cara peparasi atau penyiapan kandidat radiofarmaka 177Lu-
SCN-Bz-DOTA- F(ab’)2-nimotuzumab?
2. Bagaimana uji stabilitas sediaan kandidat radiofarmaka 177Lu-SCN-Bz-
DOTA-F(ab’)2-nimotuzumab?
1.4 Tujuan Penelitian

Penelitian ini dilakukan untuk memperoleh kandidat radiofarmaka
177
Lu-SCN-Bz-DOTA-F(ab’)2-nimotuzumab dan mengetahui
kestabilannya.
1.5 Hipotesa
Hipotesis dari penelitian ini adalah :
177
1. Peparasi atau penyiapan kandidat radiofarmaka Lu–SCN-Bz-
DOTA-F(ab’)2-nimotuzumab dapat dilakukan dengan
mengkonjunggasikan p-SCN-Bz-DOTA pada F(ab’)2-nimotuzumab
yang diikuti dengan penandaan p-SCN-Bz-DOTA-F(ab’)2
177
Nimotuzumab dengan Lu.
177
2. Sediaan kandidat radiofarmaka Lu–SCN-Bz-DOTA-F(ab’)2-
177
Nimotuzumab memiliki stabilitas yang baik dilihat dari Lu yang
tidak terlepas dari 177Lu-DOTA-nimotuzumab.

5
1.6 Manfaat Penelitian

1. Untuk memberikan informasi tentang fragmen F(ab’)2-nimotuzumab
yang ditandai dengan 177Lu sebagai kandidat radiofarmaka untuk terapi
kanker over expressed HER-1.
2. Jika dimungkinkan, hasil dari penelitian ini dapat dikembangkan
menjadi radiofarmaka setelah diuji preklinis dan klinis. Sehingga dapat
menambah daftar obat baru sebagai salah satu alternatif terapi kanker
over expressed HER-1 yang lebih efektif.
3. Hasil penelitian ini bisa dipublikasikan pada jurnal ilmiah.

BAB II
TINJAUAN PUSTAKA
2.1 Kanker
Sel abnormal terjadi karena kerusakan gen untuk mengontrol
pertumbuhan, mitosis dan apoptosis sel yang berakumulasi menjadi tumor.
Kerusakan ini bisa disebabkan oleh bawaan atau hereditas yang diturunkan
dari gen ayah atau ibu dan mutasi gen yang disebabkan dari lingkugan
seperti polusi, rokok, zat kimia dan lain-lain. Mutasi gen dapat menekan
terjadinya proses apoptosis sehingga sel kanker tidak mengalami kematian
sel layaknya sel normal. Sel kanker dapat menyebar ke tempat atau organ
tubuh lain melalui aliran darah dan sistem limphatik disebut metastasis dan
juga dapat langsung menginvasi jaringan di sekitarnya (Galsky, 2010).
Tumor atau neoplasma dibagi menjadi dua jenis yaitu benign dan
malignant tumor. Benign tumor merupakan tumor yang tidak
bermetastasis dan menginvasi jaringan di sekitarnya. Sedangkan malignant
tumor yang juga disebut sebagai kanker dapat menginvasi dan
bermetastasi sehingga dalam penangannya tidak bisa hanya dilakukan
operasi (Copper, 1993).
2.2 Etiologi Kanker

Penyebab utama untuk terjadinya kanker pada manusia belum
diketahui. Pada tahun 1775 Persival Pott, menemukan bahwa kanker
scrotum banyak dijumpai pada orang yang bekerja di pabrik yang
memakai cerobong asap. Setelah dipelajari, ternyata hidrokarbon yang
berhasil diisolasi dari batu bara merupakan carcinogenic agent.
Berbagai faktor penyebabnya antara lain :
1. Zat-zat karsinogenik
a. Kimia
Contoh zat kimia yang dihubungkan dengan terjadinya kanker yaitu :
- Benzene : Leukemia akut.

7
- Jelaga batu bara: kanker kulit, laring, dan bronkhus.

b. Fisika
Karsinogenik fisik yang utama adalah radiasi ion.
c. Drug- Induced Cancer
Contoh obat yang dihubungkan dengan terjadinya kanker yaitu:
- Alkilator seperti melphalan dan cyclophosphamide: leukemia dan
kanker kandung kemih.
2. Virus-virus onkogenik
Dua jenis virus yang dikenal dapat menyebabkan keganasan yaitu:
a. RNA virus : leukemia, sarkoma dan urinari papiloma serta kanker
payudara.
b. DNA virus dianggap sebagai penyebab kanker : Eipstein Barr
virus, papilloma virus, Hepatitis B virus. Eipstein Barr virus
(EBV) dianggap sebagai penyebab dari kanker nasofaring.
Hepatitis B virus berhubungan dengan hepatocelluler carcinoma
primer.
3. Faktor herediter
Beberapa kanker diturunkan secara autosomal dominant seperti
neuroblastoma rectum, kanker tiroid dan ada yang diturunkan secara
autosomal recessive seperti xeroderma pigmentosa. Namun sulit
ditentukan apakah kanker terjadi karena faktor herediter sendiri atau
karena kombinasi faktor-faktor lain seperti lingkungan, kebiasaan
hidup dan makanan.
4. Faktor lingkungan
Faktor lingkungan seperti polusi udara, kontaminasi air, proses
makanan termasuk pemakaian nitrat, nitrosamin untuk pengawetan
daging serta sakarin, diduga mempunyai sifat karsinogen yang
potensial.
5. Faktor sosio ekonom
Walaupun belum diketahui dengan pasti, faktor sosial ekonomi
ternyata tampak mempengaruhi insidensi kanker. Kanker gaster dan
cervix dijumpai lebih tinggi pada golongan sosio ekonomi rendah,

8
sekitar tiga sampai empat kali lebih banyak daripada golongan sosio
ekonomi menengah dan tinggi (Pasaribu, 2006).
2.3 Antibodi
Antibodi merupakan protein-protein globular yang dikodekan oleh
gen-gen yang spesifik, dihasilkan oleh sistem imun sebagai respon
terhadap keberadaan antigen. Antibodi ini terdiri dari dua fragmen Fab
(antigen-binding fragment) dengan fragmen Fc (constant fragment).
Sebuah antibodi terususun atas 4 rantai polipeptida yaitu dua rantai berat
(heavy chain) identik dan dua rantai ringan (light chain) identik yang
saling berhubungan dengan ikatan disulfida membentuk molekul
berbentuk Y yang mempunyai area hinge (engsel) fleksibel (Gambar 2.1).
Gambar 2.1. Struktur molekul antibodi.

[Fried & Hadensenos, 2006]
Keterangan :
CL: light chain domain, VH : heavy chain variable domain, CH : heavy chain constant.
Daerah variabel suatu antibodi yang berada pada rantai berat dan
ringan terletak di bagian ujung lengan Y membentuk dua sisi pengikat
(bivalent) antigen dimana berperan dalam spesifitas suatu antibodi
terhadap antigen tertentu. Sedangkan daerah konstan berperan dalam
pembagian kelas antibodi dimana lengan Y dan batang molekul selalu

9
identik pada semua antibodi dari kelas yang sama. Salah satu kelas
antibodi yaitu molekul IgG merupakan antibodi berjumlah 80 - 85% dari
keseluruhan antibodi yang bersirkulasi dan merupakan satu-satunya
antibodi yang dapat menembus plasenta. Molekul IgG berfungsi sebagai
pelindung terhadap mikroorganisme dan toksin yang bersirkulasi,
mengatifasi sistem komplemen, dan meningkatkan keefektifan sel fagosit
(Sloane, 2003).
Kohler dan Milstein menjelaskan cara mengisolasi dan
mengembangkan antibodi monoklonal murni spesifik dalam jumlah
banyak yang didapat dari campuran antibodi hasil respon imun. Tikus
yang telah diimunisasi dengan antigen khusus ke dalam sumsum tulang
akan menghasilkan sel limfosit B yang memiliki masa waktu hidup
terbatas dalam kultur, hal tersebut dapat diatasi dengan cara
menggabungkan dengan sel limfosit B tumor yang abadi. Hasil campuran
hibridoma dipilih hibridoma yang memiliki dua kemampuan yaitu
menghasilkan antibodi khusus dan dapat tumbuh dalam kultur. Hibridoma
yang berasal dari satu limfosit akan menghasilkan satu jenis antibodi yang
akan mengenali satu jenis antigen. Antibodi tersebutlah yang disebut
dengan Antibodi monoklonal (mAb) (Alberts, Johson, Lewis, Raff,
Robert, & Walter, 2002; Abbas & Lichtman, 2005).
Antibodi monoklonal diklasifikasikan menjadi 4 tipe (Gambar 2.2),

yaitu:
1. Antibodi monoklonal Murine

Antibodi monoklonal murine merupakan antibodi murni dari tikus
yang dapat menyembabkan human anti-mouse antibodies HAMA.
HAMA menyebabkan eliminasi terapi antibodi menjadi cepat dan
menimbulkan efek samping serius yang merugikan. Contoh antibodi
ini adalah muromunab.

10
2. Antibodi monoklonal Chimeric

Antibodi monoklonal chimeric adalah antibodi gabungan tikus dan
manusia dimana Fc antibodi manusia dan Fab antibodi monoklonal
tikus dimana hampir 70% human sequences. Contoh antibodi ini
adalah infiliximab.
3. Antibodi monoklonal Humanized

Antibodi monoklonal humanized mengandung 5 - 10% murine
yang cara pembuatannya sama dengan cara membuat antibodi
monoklonal chimerics. Antibodi ini menunjukan sedikit atau tidak ada
respon human immunological yang merugikan. Contoh dari antibodi
golongan ini adalah nimotuzumab.
4. Antibodi monoklonal Fully human

Antibodi monoklonal fully human merupakan antibodi yang
keseluruhannya antibodi manusia. Contoh antibodi ini adalah
adalimumab (Pandit, 2007; T. Smith, 2008).
Gambar 2.2. Murine, chimeric, humanized, dan human Abs.

[Pelat, Thibaut., Avril, Arnaud., Chahboun, Siham., Mathieu, Jacques., & Thullier,
Philippe., 2011]
Empat Tipe Antibodi Monoklonal

11
2.4 Fragmentasi Antibodi Monoklonal Oleh Enzim
Gambar 2.3. Fragmentasi antibodi klas IgG dengan papain,

pepsin, dan merkaptoetanol.
[T. Smith, 2008]
Antibodi monoklonal dapat difragmentasi menjadi beberapa jenis

fragmen dengan menggunakan enzim seperti pepsin dan papain dan juga
dengan merkaptoetanol (Gambar 2.3) memperlihatkan skema fragmentasi.
Enzim pepsin memotong molekul imunoglobulin pada sisi terminal-C
hinge region menghasilkan fragmen F(ab’)2 dan degradasi fragmen Fc.
Sementara itu merkaptoetanol menghasilkan dua heavy chain dan dua light
chain (Hermanson, 1996).
2.5 Epidermal Growth Factor Receptor (EGFR)

Growth factor dan reseptor kinase transmembran berperan penting
dalam proliferasi, survival, adesi, migrasi dan differensiasi. EGFR terdiri
dari empat reseptor transmembran, yaitu: EGFR (HER1/erbB-1), HER2
(erbB-2/neu), HER3 (erbB-3) dan HER4 (erbB-4). EGFR (HER1/erbB-1)
merupakan glikoprotein 170 kDa yang terdiri dari 3 domain fungsional
utama yaitu domain ligan ikatan ekstraseluler, domain transmembran
hidrofilik dan domain tirosin kinase sitoplasmik (Gambar 2.4).

12
Gambar 2.4. Ilustrasi skematik jalur EGFR pengaruh terhadap sel

dan jaringan.
[Santoso & Suharti, 2009]
Keterangan: Lokasi inhibitor EGFR dapat ditempati monoklonal antibodi (Abs) dan
tyrosine kinase inhibitor (TKIs)
EGFR memberikan jalur sinyal transduksi intraseluler seperti

Ras/mitogen-activated protein kinase (MAPK). Ikatan growth factor dan
reseptornya merupakan awal organisasi dan proses biokimia sel. Proses
tersebut adalah aktivasi reseptor, kaskade fosforilasi dengan identifikasi
protein kinase dan pada tingkat nukleus terjadi aktivasi faktor transkripsi.
Interaksi sistem EGFR dan kaskade Ras / kaskade MAPK yang merupakan
salah satu jalur sinyal seluler utama. Respon biologi terhadap sinyal EGFR
adalah pleiotropik, yaitu: mitogenesis, penurunan apoptosis, mempercepat
motilitas sel, sekresi protein dan differensiasi atau dedifferensiasi.
Efek aktivasi EGFR pada sel tumor beragam dan konvergen
sehingga terjadi pertumbuhan sel yang tidak terkontrol, peningkatan
mobilitas, proliferasi sel, invasi, metastasis, penurunan kemampuan
apoptosis serta stimulasi angiogenesis. Pada keadaaan normal EGFR
terekspresi oleh banyak jenis sel seperti epitel dan jaringan mesenkim.
Tetapi terdapat variabilitas rekspresi atau disregulasi EGFR pada
keganasan. Sebagian besar kanker epitel banyak mengekspresikan EGFR

13
dengan kata lain overekspresi. Overekspresi EGFR terjadi pada kanker

kandung kemih, otak, payudara, servik, uterus, kolon, esofagus, glioma,
ovarium, ginjal dan paru non-small-cell. Tumor dengan ekspresi EGFR
cenderung lebih agresif dan invasif (Santoso & Suharti, 2009).
Antibodi monoklonal (mAb) menargetkan komponen ekstraselular
EGFR dan protein sinyal lain dianggap berhubungan dengan
tumorigenesis, seperti ErbB230 dan vascular endothelial growth factor
(VEGF). Antineoplastik berikatan EGFR mAb yang menunjukkan potensi
antikanker termasuk cetuximab, panitumumab, zalutumumab, matuzumab,
necitumumab, dan nimotuzumab. Diyakini agen tersebut bekerja dengan
menempel pada epitop EGFR ekstraseluler dan secara sterik menghambat
protein membentuk konformasi dimerisasi optimal atau alternatif
menghalangi interaksi EGFR (Boland & Bebb, 2009).
Gambar 2.5. Mekanisme kerja obat anti-EGFR pada sel kanker.
[Ciardiello & Tortora, 2008]

14
2.6 Radionuklida
Radionuklida dalam bidang kedokteran sekitar 95% digunakan
untuk diagnosa (Aziz & Suherman, 2013). Namun dengan berkembangnya
penelitian, aplikasi radionuklida dalam terapi mulai berkembang pesat.
Dalam terapi radiasi dikenal dua jenis teknik pemberian radiasi yaitu
teleterapi (radiasi eksternal) yang menggunakan radiasi dari luar tubuh
dan brakiterapi (terapi radiasi jarak singkat) dimana menggunakan sumber
radioaktif yang ditanamkan di dekat kanker dalam tubuh pasien. Sifat
radiasi ionisasi dapat berupa radiasi elektromagnetik (sinar-X dan sinar
gamma) atau partikel (partikel alfa, neutron, meson pi negatif dan ion
berat). Secara klinik, terapi radiasi dengan radiasi elektron dan sinar beta
(elektron dihasilkan selama peluruhan inti) paling bermanfaat. Untuk
terapi secara in vivo, radionuklida yang banyak digunakan adalah
pemancar-β (Sabiston, 1987; Rasjidi, 2009; Venkatesh & Chakraborty,
2005).
Pemilihan suatu radionuklida untuk suatu radiofarmaka sangat
tergantung pada aplikasinya. Radiofarmaka untuk pencitraan digunakan
radionuklida pemancar positron atau gamma dengan waktu paruh (T ½)
minimum. Radiofarmaka untuk terapi sementara itu pencitraan
karakteristik peluruhan, jarak tembus dan energi dari partikel yang
dipancarkan, lokalisasi yang spesifik, mudah diproduksi, farmakokinetik
dan aktivitas jenis yang memadai (Aziz & Suherman, 2013; Leswara,
2007).
Radionuklida untuk penandaan peptida dan antibodi harus
memiliki kemurnian radiokimia dan kemurnian radionuklida yang sangat
tinggi, dimana persyaratan kemurnian radiokimia yang baik biasanya
adalah 95% - 100%. Kemurnian radiokimia ini penting untuk mengetahui
apakah sediaan tersebut berada dalam bentuk senyawa kimia seperti yang
diinginkan atau tidak sehingga dapat memperkecil terjadinya penimbunan
pada organ lain (Nurlaila, 2007).

15
2.7 Lu-177
Salah satu radionuklida golongan lantanida yang saat ini banyak
177
diteliti dan juga digunakan untuk terapi kanker adalah radionuklida Lu.
Studi literatur memperlihatkan saat ini setidaknya tidak kurang dari 30
macam senyawa bertanda 177Lu telah digunakan dan / atau dalam status uji
klinis untuk penanganganan kanker colon, kanker tulang metastasis,
limpoma non-Hodgkin dan kanker paru-paru (Kadarisman, Herlina, &
Sriyono, 2011). Lu-177 mempunyai waktu paruh (T1/2) 6,7 hari dimana
ketika meluruh mengemisikan partikel β- berenergi sedang dengan energi
maksimum sebesar 497 keV (78%) yang ideal untuk terapi tumor jaringan
lunak. Kemampuan penetrasi emisi partikel β- antara 0,04 sampai 1,8 mm
177
sehingga dapat membunuh sekitar 4 sampai 180 sel tumor. Lu juga
memancarkan radiasi γ 208 keV yang memungkin scintigraphy dan
dosimetry. Toksisitas invivo dapat diminimalkan dengan cara
177
meminimalkan pelepasan isotop dengan membuat Lu sebagai kompleks
logam yang stabil secara termodinamika dan kinetis untuk antibodi
monoklonal (mAb) atau immunoprotein dengan bifunctional chelating
agent (Kassis, 2011; Gansow, 1991; Kadarisman, Herlina, & Sriyono,
2011).
.
2.8 Nimotuzumab
Nimotuzumab yang sebelumnya diketahui sebagai hR3 merupakan

anti kanker Humanized antibodi IgG 1 kelompok inhibitor epidermal
growth factor receptor (EGFR) turunan dari plasenta manusia. Senyawa
ini mencegah sel kanker menerima pesan yang dibutuhkan sel untuk
tumbuh, berkembang dan menyebar dengan cara menghambat protein
epidermal growth factor reseptor yang terdapat pada permukaan sel
kanker dan dapat menghambat hasil vascular endothelial growth factor
(VEGF). Penghambatan ikatan ligan dan aktivitas reseptor ini terjadi
karena nimotuzumab menghambat aktivitas protein tirosin kinase dan
berikatan dengan afinitas yang optimal serta spesifisitas tinggi pada daerah

16
ekstraseluler dari EGFR (Reddy & Couvreur, 2010; Godewijckstraat,

2012; Acton, 2013; Humani, Ramli, Rustendi, & Subur, 2010).
Nimotuzumab mengikat reseptor berdasarkan densitas EGFR, tidak
berakumulasi pada permukaan sel pada jaringan yang sehat seperti kulit,
mukosa GI, dan ginjal. Hal ini membuktikan bahwa nimotuzumab
mempunyai aktivitas yang sama dengan antitumor penghambat EGFR lain
tanpa menimbulkan efek samping yang berat terhadap jaringan yang
sehat. Nimotuzumab diharapkan memiliki aktivitas sinergis dengan agen
yang lebih lanjut meningkatkan aktivitas EGFR, seperti radiasi yang
mengandung rejimen (Tikhomirov, Garrido, Yang, Sherman, & Perez,
2008).
Berdasarkan penelitian yang telah dilakukan oleh Martalena et al.,
177
(2012) nimotuzumab yang ditandai dengan Lu lebih banyak membunuh
sel kanker (kanker paru-paru) dari pada nimotuzumab yang tidak ditandai.
Dengan demikian agar efektivitas nimotuzumab meningkat seperti yang
telah dilakukan pada penelitian Martalena et al., nimotuzumab sebaiknya
177
dilabelkan dengan Lu, dimana ketika nimotuzumab mengikat EFGR,
mengemisikan alpha-beta atau emitor-partikel yang diharapkan dapat
menghentikan proliferasi dan metastasis sel kanker dengan mentransfer
energi kepada sel kanker sekitarnya agar sel kanker lisis (Ramli, et al.,
2012).
2.9 p-SCN-Bz-Dota
Bifunctional chelating agent (BFCA) adalah senyawa khelat
asiklik ataupun makrosiklik bifungsi yang mempunyai 2 fungsi yang
berbeda dimana dapat membentuk komplek dengan mengikat logam
177
seperti Lu yang stabil secara termodinamika dan kinetik serta berfungsi
mengikat vektor terarah secara kovalen salah satu contohnya adalah mAb
oleh gugus fungsi yang reaktif (E′ VA TO′ TH., 1994). Salah satu derivat
tetraaza siklododekan tetra asam asetat yang banyak digunakan sebagai
BFCA adalah 2-(4-isothiocyanatobenzyl)-1,4,7,10-tetraazacyclo-

17
dodecane-1,4,7,10- tetraacetic acid (p-SCN-Bz-DOTA) (DOTA, Gambar

2.6) yang mempunyai berat molekul 688 g/mol dan larut baik dalam air
Gambar 2.6. Struktur DOTA (kiri) dan p-SCN-Bz-DOTA(kanan).

[Brechbiel,2008]
Konjugasi mAb dengan p-SCN-Bz-DOTA didasarkan pada

interaksi gugus amino dari mAb yang berikatan dengan gugus tiosianat
dari p-SCN-Bz-DOTA oleh ikatan tiourea. Stabilitas p-SCN-Bz-DOTA
dalam membentuk komplek dengan logam dipengaruhi oleh empat lengan
karboksilat untuk membentuk komplek dan benzil yang terikat ke
kerangka karbon (Patterson, 2013).
2.10 Sediaan Radiofarmasi

Sediaan radiofarmaka menurut Wolf & Tubis (Leswara, 2007)
adalah suatu senyawa radioaktif yang dimaksudkan untuk dimasukkan ke
dalam tubuh manusia, baik untuk tujuan terapi maupun diagnosis serta
mengalami perubahan metabolism di dalam tubuh. Menurut Y. Cohen
sementara itu sediaan radiofarmaka adalah suatu senyawa radioaktif yang
dimasukkan ke dalam tubuh manusia, baik secara oral maupun parenteral,
serta tidak berada dalam wadah tertutup (sealed sources), karena itu akan
ikut mengalami perubahan metabolisme di dalam tubuh.
Sediaan radiofarmaka dapat digolongkan kedalam dua kelompok,
yaitu berupa: a) Isotop perimer (primary radionuclide); b) Senyawa
bertanda (labeled compound). Sediaan radiofarmaka dapat berupa larutan
untuk pemakaian oral, kapsul gelatin untuk pemakaian oral dan larutan

18
injeksi. Ada beberapa persyarat untuk larutan injeksi yang biasanya harus
dipenuhi, seperti sterilitas, isotonisitas, dan bebas pirogen.
Pemeriksaan kemurnian sediaan radiofarmaka terdiri dari :
1. Pemeriksaan fisika, pemeriksaan ini meliputi pengujian
kemurnian radiokimia dan konsentrasi radioaktif.
2. Pemeriksaan kimia, pemeriksaan ini termasuk pengujian
kemurnian radiokimia untuk mengetahui apakah zat aktif yang
telah ditentukan berada pada bentuk kimianya, penentuan pH,
dan penetapan kadar.
3. Pemeriksaan biologi, pemeriksaan biologi meliputi uji
sterilitas, pirogenitas, dan toksisitas.
(Leswara, 2007).
2.11 Kromatografi Eksklusi Ukuran atau Size Exclusion Chromatography

(SEC)
Gambar 2.7. Pemisahan 2 ukuran molekul dengan SEC.

Keterangan :1) campuran sampel sebelum masuk ke kolom; 2) campuran kolom
mulai masuk ke bagian atas koom; 3) pemisahan berdasarkan ukuran; dan 4)
pemisahan sempurna
Kromatografi eksklusi ukuran merupakan pemisahan kromatografi

cair dengan sinonim diantaranya GFC (gel-filtration chromatography),
GPC (gel permeation chromatography) dan kromatografi gel (Wu, 1995).

19
Pemisahan campuran menggunakan GFC (gel-filtration chromatography)

berprinsipkan memisahkan campuran berdasarkan ukuran molekul. Berat
molekul yang kecil akan terjebak masuk kedalam pori-pori gel sedangkan
berat molekul yang besar akan terbawa dengan pelarut menurunin kolom
dan keluar terlebih dahulu (Gambar 2.7). Dengan demikian pemisahan
dapat dilakukan pada molekul-molekul yang mempunyai ukuran yang
berbeda. Contoh GFC yaitu Sephadex G-25 berguna untuk memisahkkan
molekul-molekul dengan berat molekul sekitar 1000 sampai 5000 (Day &
Underwood, 2001).
2.12 Kromatografi kertas atau lapis tipis (KLT)

Kromatografi lapis tipis atau TLC (thin layer chromatography)
dapat disebut juga kromatografi planar merupakan kromatografi berupa
lempeng kaca, plastik, atau alumunium yang dilapisi dengan adsorben
berupa alumina, gel silica, dan selulosa dengan ketebalan adsorben
tersebut sekitar 0,1 mm sampai 0,3 mm. Lempeng yang paling umum
digunakan berukuran 8 x 2 inci (Day, 2001). Jarak yang ditempuh oleh
senyawa dari garis awal (tempat senyawa ditotolkan pada pelat) dibagi
dengan jarak yang ditempuh oleh pelarut disebut ‘nilai Rf’ senyawa
tersebut (Watson, 2005).
2.13 SDS- PAGE

Sodium deodesil sulfat / soduim lauril sulfat (SDS–PAGE) merupakan
metode yang digunakan untuk analisis protein secara kuantitatif dengan
memisahkan protein berdasarkan ukurannya. SDS-PAGE sering
digunakan untuk menentukan berat molekul protein (walaupun tidak
akurat untuk beberapa kasus), memonitoring kemurnian protein, dan
mengidentifikasi protein pada sampel yang komplek.
Kekuatan dari sistem SDS-PAGE tidak hanya dari gel yang
digunakan tapi juga denaturasi oleh SDS. SDS merupakan detergen yang
memberikan muatan negatif sehingga terjadi unfolding membentuk
konfigurasi linier. Banyaknya ikatan molekul SDS sebanding dengan

20
banyaknya asam amino pada protein. Mobilitas protein yang terdenaturasi

oleh SDS berbanding terbalik dengan log berat molekulnya dimana protein
yang besar bermigrasi lebih lama dibanding protein yang kecil.
Gambar 2.8. Pola pemisahan protein dengan SDS-PAGE.

[Walker & Rapley, 2008]
Keterangan : Protein terdiri dari subunit 50 dan 30 kDa yang terikat oleh
jembatan sulfida akan bermigrasi menjadi 80 kDa pada kondisi dibawah nonreducing (-
ME; tidak terdapat 2-mercaptoetanol) dan terlihat dua pita (50 dan 30 kDa) pada kondisi
dibawah reducing.
SDS-PAGE pada kondisi reduksi menggunakan agen pereduksi

ikatan disulfida seperti 2-mekaptoetanol (2-ME). Dua kegunaan 2-ME
yaitu: a) Sebagai pereduksi ikatan kovalen yang mungkin ada antar protein
multimerik komplek b) Pereduksi ikatan kovalen yang ada dalam protein
dimana meningkatkan resolusi dan memungkinkan keakuratan dari massa
molekul. Perbandingan protein terisolasi pada reduksi dan non reduksi
SDS-PAGE memudahkan penentuan apakah protein mungkin berikatan
secara kovalen dengan protein lain dalam sel.
Identifikasi protein pada gel menggunakan pewarna untuk

memvisualisasikan pita atau spot pada gel. Pewarna yang sering dipakai
salah satu contohnya yaitu Commassie Briliant Blue sebagai pewarna yang
dapat berikatan dengan protein. Protein diwarnai pada gel PAGE dengan

21
pelarut metanol atau asam asetat. Pewarnaan Commassie Briliant Blue

mempunyai batas deteksi 0,3 µg sampai 1 µg protein pada pita
menunjukan tidak begitu sensitif sehingga penggunaan perwarna ini untuk
protein yang komplek dan banyak pada gel (Corley, 2005).

BAB III
METODOLOGI PENELITIAN
3.1. Lokasi dan Waktu Penelitian

Penelitian dilaksanakan dari bulan Februari hingga Juni 2014 di
Laboratorium Pusat Teknologi Radioisotop dan Radiofarma (PTRR),
Badan Tenaga Nuklir Nasional (BATAN), Gd. 11, Kawasan PUSPIPTEK,
Serpong, Kota Tangerang Selatan.
3.2. Metode Penelitian

Penelitian ini dilakukan secara eksperimental. Metodologi
penelitian meliputi fragmentasi antibodi monoklonal nimotuzumab,
pengikatan bifunctional chelating agent (BFCA) p-benzyl isothiocyanate-
1,4,7,10-tetraazacyclododecane-1,4,7,10-tetraacetic acid (p-SCN-Bz-
DOTA) pada fragmen F(ab’)2-nimotuzumab, penandaan p-SCN-Bz-
177
DOTA-fragmen F(ab’)2-nimotuzumab dengan Lu yang kemudian
177
diikuti dengan pemurnian dan uji stabilitas Lu-p-SCN-Bz-DOTA-
fragmen F(ab’)2 -nimotuzumab.
3.3. Alat dan Bahan

3.3.1 Alat
Magnetic stirer (Labcompanion), Kromatografi Cair Kinerja
Tinggi (KCKT) (Shimadzu VP Series Means) yang terdiri dari system
controller (SCL-10A vp), HPLC pump (LC-10AD vp), solvent selector
(FCV 10AL vp), detektor UV-Vis (SPD-10A vp),dan size exclusion
column (SEC, Aglient Bio SEC-3, 7,8 x 300 mm), thermomixer
(Eppendrof), termometer, water bath, Mini-PROTEAN Tetra Cell
Electrophoresis (Bio-Rad), Scanner (HP Photosmart C4780), orbital
shaker (Fisher Scientific), plate reader (Biotek), mikropipet, labu ukur,
bakker glass, statif, kolom (10 x 1,2 cm) (Bio-Rad), neraca analitik
(Satorius, BSA3235-CW, max. 320 g), neraca analitik (Denver, 210 g-

23
0,001 g), spatula, batang pengaduk, pipet tetes, sentrifus (Hettich EBA 8
S) dose calibrator, rotor, dan sentrifus berpendingin (Alegra 64 R).
3.3.2 Bahan
Nimotuzumab (Innogene, Kalbe Tech), HCl, NaOH, Lu-177
(177LuCl3) diperoleh dengan cara mengirradiasi 176
Lu (176Lu2O3,
pengkayaan 39,60%, Isoflex,) di RSG-GAS yang kemudian diproses di
laboratorium PTRR, bovine serum albumin (BSA, Sigma), resin penukar
ion Chelex 100 (Bio-Rad), NaCl, asam asetat glasial, natrium asetat,
dipotasium hidrogen fosfat, metanol, potasium dihidrogen fosfat, sodium
dodecyl sulfat (SDS) 10%, pewarna protein (Bio-Rad), p-SCN-Bz-DOTA,
larutan pewarna Coomasie Blue G-250 (Bio-Rad), pepsin serbuk (Sigma),
Trizma base, air bebas ion (hambatan 18,2 MegaOhm), EDTA (E.Merck),
N,N,N’N’-tetramethylenthylenediamine (TEMED), ammonium peroxide
disulfate (APS), amonium asetat, protein filter (10.000 MWCO, 5ml, Viva
Science), bromophenol blue, β-merkaptoetanol, gliserol, phosphate
buffered salin (PBS), Mini-PROTEAN TGX 4-20% (Bio-Rad), N’N’-bis-
methylene-acrylamide, celex (Bio-Rad), akrilamid, Sephadex G-25, PD-10
dan glisin.
3.4 Fragmentasi Nimotuzumab

3.4.1 Pemurnian Nimotuzumab
Nimotuzumab dimurnikan dari zat tambahan lainnya dengan cara
dialisis. Sejumlah nimotuzumab (12,5 mg, 2,5 mL) dimasukkan kedalam
kaset dialisis (20 KD MWCO) dan kemudian didialisis dalam 0,02 M
dapar asetat pH 4,5 pada suhu 4 0C selama 72 jam dengan penggantian
dapar setiap 24 jam. Nimotuzumab hasil dialisis diukur konsentrasinya
menggunakan spektofotometri UV-Vis dan dianalisis lebih lanjut dengan
KCKT (Humani, Ramli, Rustendi, & Subur, 2010).

24
3.4.2 Fragmentasi Nimotuzumab Menjadi F(ab’)2

0,625 mg pepsin (3200 U/mg) ditambahkan ke dalam 2,5 mL
larutan nimotuzumab (5mg/mL) dengan perbandingan 1:4 (mg/mL).
Campuran diinkubasi dengan Thermomixer pada 300 rpm selama 14 jam
pada suhu 37 0C. Proses fragmentasi kemudian dihentikan dengan
penambahan 3,75 mL tris-HCl pH 8,0. Campuran siap untuk proses
pemurnian (Haryuni, et al., 2014).
3.4.3 Pemurnian F(ab’)2-Nimotuzumab

Fragment F(ab’)2-nimotuzumab dipisahkan dari fragmen Fc
dengan menggunakan kolom PD-10 di pre-blocked dengan bovine serum
albumin dan pre-equilibrated dengan dapar fosfat 0,01 M pH 7,4.
Sejumlah (0,5 µL) campuran hasil fragmentasi dimasukan ke bagian atas
kolom yang diikuti dengan proses fraksinasi dengan eluen dapar fosfat
0,01 M pH 7,4. Eluat kemudian ditampung dalam tabung mikro (20
tabung, 0,25 mL/ tabung). Sejumlah cuplikan (10 µL) kemudian diambil
dari setiap fraksi dan dimasukkan kedalam 96 micro well. Ke dalam setiap
cuplikan ini kemudian ditambahkan 90 µL pewarna protein (BioRad, ¼
v/v dalam H2O) yang dilanjutkan dengan pengamatan perubahan warna /
absorbansi untuk melihat keberadaan protein hasil fraksinasi. Fraksi-fraksi
yang memberikan warna biru / absorbansi kemudian dianalisis lebih lanjut
dengan KCKT dan SDS-PAGE (non-pereduksi dan pereduksi) (Haryuni,
et al., 2014).
3.4.4 Analisis F(ab’)2-Nimotuzumab Menggunakan KCKT

Analisis F(ab’)2-nimotuzumab menggunakan perangkat KCKT
(Shimadzu) yang dilengkapi dengan size exclusion column (SEC, Bio-SEC
S250,7,7 x 300 mm) dan detektor UV-Vis (280 nm). Kolom kemudian
dielusi secara isokratik dengan 0,01 M PBS pH 7,4 (laju alir 1mL/menit)
(Hermanto, Haryuni, Ramli, Mutalib, & Hudiyono, 2012).

25
3.4.5 Analisis F(ab’)2-Nimotuzumab Menggunakan SDS-PAGE

Analisis F(ab’)2-nimotuzumab dengan SDS-PAGE dilakukan
dengan menggunakan perangkat Mini-PROTEAN Tetra Cell
Electrophoresis (Bio Rad). Elektroforesis dilakukan selama 60 menit
dengan tegangan 150 volt. Penanda yang digunakan adalah standar protein
dengan rentang berat molekul antara 7,1 sampai 209 kDa. Coomasie
briliant blue 0,1 % sebagai pewarna protein. Pencucian menggunakan
stained gel campuran metanol : larutan asam asetat (40% : 7,5%)
(Hermanto, Haryuni, Ramli, Mutalib, & Hudiyono, 2012).
3.4.6 Pemekatan Protein dengan Protein Filter

F(ab’)2-nimotuzumab dipekatkan dengan protein filter (MWCO
10.000) yang telah dijenuhkan dengan 10µL BSA 2,5% yang kemudian
dikondisikan dengan fosfat (K2HPO4) 0,1 pH 7,4. Sejumlah F(ab’)2
Nimotuzumab (2 mL) dimasukan kedalam protein filter (MWCO 10.000)
yang kemudian disentrifuse pada 2.500 rpm selama 1 jam sampai volume
menjadi 1 mL (Haryuni, et al., 2014).
3.5 Penyiapan 177LuCl3

177 177
LuCl3 disiapkan dengan cara mengiradiasi 0,4 mg Lu
(176LuO3, pengkayaan 39,60%, di RSG-GAS selama 4 hari). Target yang
telah diiradiasi kemudiaan dipindahkan kedalam gelas beaker dan
kemudian diikuti dengan penambahan 2 mL HCl 6M. Campuran kemudian
didiamkan selama 30 menit sebelum penambahan 2 mL H2O2. Campuran
reaksi kemudian dipanaskan dengan pengadukan sampai kering. Garam
Lu-177 yang terbentuk kemudian dilarutkan dengan 3 mL HCl 0,025 M
(Humani, Ramli, Rustendi, & Subur, 2010).
3.6 Konjugasi p-SCN-Bz-DOTA pada F(ab’)2-Nimotuzumab

Kedalam sejumlah (1,27 x 10-5mmol) F(ab’)2-nimotuzumab
ditambahkan larutan p-SCN-Bz-DOTA (2,545 x 10-4 mmol, dalam 1 mL
dapar fosfat pH 8,5). Campuran kemudian diatur pHnya menjadi 8,5

26
dengan penambahan 0,1 M NaOH. Campuran kemudian diinkubasi pada

4 0C seharian. Immunokonjugat p-SCN-Bz-DOTA- F(ab’)2-nimotuzumab
yang terbentuk kemudian dimurnikan dari hasil samping reaksi dengan
cara dialisis menggunakan kaset dialisa (20 KD MWCO) (Vera, Eigner,
Henke, Lebeda, Melichar, & Beran, 2012).
3.7 Analisis p-SCN-Bz-DOTA-F(ab’)2-Nimotuzumab dengan KCKT

Analisis p-SCN-Bz-DOTA-F(ab’)2-nimotuzumab menggunakan
perangkat KCKT (Shimadzu) yang dilengkapi dengan size exclusion
column (SEC, Bio-SEC S250,7,7 x 300 mm) dan detektor UV-vis (280
nm). Kolom kemudian dielusi secara isokratik dengan PBS 0,01M pH 7,4
(laju alir 0,8 mL/menit) (Hermanto, Haryuni, Ramli, Mutalib, &
Hudiyono, 2012).
3.8 Penandaan p-SCN-Bz-DOTA-F(ab’)2-Nimotuzumab dengan 177Lu

Kedalam sejumlah p-SCN-Bz-DOTA-F(ab’)2-nimotuzumab
177
ditambahkan sejumlah LuCl3 (1/3, v/v ammonium asetat 0,25 M pH 7,0).
Campuran reaksi kemudian diatur pH nya sampai menjadi 6,5 dengan
penambahan larutan HCl 0,01 M atau 0,01 M NaOH yang dilanjutkan
dengan proses inkubasi pada suhu 37 0C selama 1 jam. Pada akhir reaksi
sejumlah larutan EDTA 0,01 M pH 6,0 ditambahkan secara berlebih
(perbandingan mol EDTA : 177Lu = 20 : 1) yang dilanjutkan dengan proses
inkubasi pada 37 0C selama 5 menit. Sejumlah cuplikan (5µL) kemudian
diambil dan dianalisis untuk menentukan persentase penandaan dengan
menggunakan kromatografi lapis tipis (KLT) dengan fase diam strip
ITLC-SG (1 x 10 cm) dan fase gerak berupa larutan salin (NaCl 0,9%).
Persentase penandaan dihitung berdasarkan total cacah yang
berada dibawah puncak radioimmunokonjugat dibandingkan terhadap
cacah total yang diaplikasikan pada strip KLT (Humani, Ramli, Rustendi,
& Subur, 2010).

27
3.9 Pemurnian 177Lu-SCN-Bz-DOTA-F(ab’)2-Nimotuzumab

177
Pemurnian Lu-SCN-Bz-DOTA-F(ab’)2-nimotuzumab dilakukan
dengan menggunakan kolom Sephadex G-25 Medium (1,2 x 10 cm) yang
sudah dijenuhkan dengan 2 mL larutan BSA 10%. Campuran hasil
penandaan (4.7) dimasukan pada bagian atas kolom dan kolom kemudian
dielusi dengan dapar pospat 0,01 M, pH 7,4 dengan kecepatan alir 1 mL/
menit. Eluat kemudian ditampung dalam tabung mikro (50 tabung, 0,5 mL
tabung). Setiap fraksi eluat kemudian diukur radioaktifitasnya dengan
Dose Calibrator. Fraksi yang menunjukan adanya radioaktifitas kemudian
dianalisis dengan sistim KLT [(fase diam strip ITLC-SG,1 x 10 cm) dan
fase gerak berupa fase gerak berupa larutan salin (NaCl 0,9%)]. Fraksi-
177
fraksi yang mengandung Lu- p-SCN-Bz-F(ab’)2-nimotuzumab dengan
kemurnian ~ 99,9% dikumpulkan dan siap digunakan untuk uji lebih lanjut
(Humani, Ramli, Rustendi, & Subur, 2010).
177
3.10 Uji Stabilitas Lu-SCN-Bz-DOTA-F(ab’)2-Nimotuzumab Pada Suhu
Kamar dan Pada 4 0C.
177
Sejumlah Lu-SCN-Bz-DOTA-F(ab’)2-nimotuzumab (100 μL)
disimpan pada suhu kamar dan pada suhu 4 0C. Secara berkala sejumlah
cuplikan diambil dan kemudian dianalisis kemurnian radiokimianya
dengan sistim KLT (fase diam strip ITLC-SG, 1 x 10 cm) dan fase gerak
berupa larutan salin (NaCl 0,9%) (Humani, Ramli, Rustendi, & Subur,
2010).

BAB IV
HASIL DAN PEMBAHASAN
4.1 Dialisis Nimotuzumab

Sediaan nimotuzumab seperti yang tertera pada brosurnya
mengandung bahan utama nimotuzumab dan bahan pendukung lainnya
seperti dibasik sodium pospat (Na2HPO4), monobasik sodium pospat
(NaH2PO4), sodium klorida (NaCl), dan polisorbat 80 (Haryuni, 2013).
Dialisis dimaksudkan untuk memurnikan dan mengkondisikan
nimotuzumab dalam larutan dapar yang diinginkan. Pada penelitian ini
sediaan nimotuzumab didialisis menggunakan kaset dialisis (20 KD
MWCO) dalam 0,02 M dapar asetat pH 4,5 pada suhu 4 0C selama 72 jam
dengan penggantian dapar setiap 24 jam. Sediaan nimotuzumab yang telah
di dialisis selanjutnya dianalisis dengan KCKT.
KCKT yang dilengkapi dengan kolom eksklusi ukuran dan
detektor uv digunakan untuk menentukan kemurnian dan waktu retensi (rt)
nimotuzumab sebelum dan sesudah dialisis serta setelah proses
fragmentasi. Penentuan kemurnian nimotuzumab dilakukan dengan
membandingkan persentase area puncak nimotuzumab terhadap total area
puncak-puncak kromatogram cuplikan. Penentuan rt yang merupakan
fungsi berat molekul (BM) dilakukan dengan membandingkan terhadap rt
protein standar dengan BM antara 670000 – 1350 Dalton.
Respon Alat (mV)
Waktu Retensi (menit)
Gambar 4.1. Kromatogram standar protein.

29
Tabel 4.1. Komponen standar protein

Berat Retention
Protein Molekul Time
(Dalton) (menit)
Thyroglobuin 670000 5,187
γ-globulin 158000 5,637
ovalbumin 44000 6,497
myoglobin 17000 7,563
vitamin B12 1350 10,233
Gambar 4.1 dan Tabel 4.1 berturut-turut memperlihatkan

kromatogram standar protein dan komponen, BM dan rt standard protein,
sedangkan kromatogram nimotuzumab sebelum dan sesudah dialisis dapat
dilihat pada Gambar 4.2.
Respon Alat (mV)
A Waktu Retensi (menit)

Respon Alat (mV)

B
Respon Alat (mV)
C Waktu Retensi (menit)
Gambar 4.2. Kromatogram nimotuzumab.

Keterangan : (A) nimotuzumab sebelum dialisis, (B) nimotuzumab sesudah dialisis dan
(C) kondisi kolom SEC (Aglient Bio SEC-3) yang diinjeksikan blanko (air).

30
Nimotuzumab sebelum dan sesudah dialisis memberikan puncak

dengan rt berturut-turut pada 5,743 dan 5,737 menit. Puncak nimotuzumab
dengan rt tersebut jika dibandingkan rt standar protein (Tabel 4.1) maka
BM nimotuzumab diperkirakan sekitar 150.000 Da. Kemurnian
nimotuzumab sebelum dan setelah didialisis berdasarkan persentase luas
puncak berurut-turut adalah 96,6% dan 100%.
4.2 Fragmentasi Nimotuzumab

Fragmentasi antibodi monoklonal atau imunoglobulin seperti
nimotuzumab menjadi F(ab’)2 dapat dilakukan dengan menginkubasi
antibodi monoklonal atau imunoglobulin dengan pepsin, dimana pepsin
memotong molekul antibodi monoklonal atau imunoglobulin pada sisi
terminal-C hinge region untuk menghasilkan fragmen F(ab’)2 dan
degradasi fragmen Fc (Hermanson, 1996).
Fragmentasi nimotuzumab untuk mendapatkan fragmen F(ab’)2
menggunakaan pepsin dilakukan selama 14 jam pada suhu 37 0C (Haryuni,
et al., 2014). Proses fragmentasi kemudian dihentikan dengan tris HCl 10
mM pH 8 untuk inaktivasi pepsin. Hasil fragmentasi nimotuzumab dengan
pepsin berupa F(ab')2 dan Fc kemudian dicuplik dan dianalisis dengan
SDS-PAGE dan KCKT untuk melihat profil nimotuzumab sebelum dan
sesudah fragmentasi. Fragmen F(ab’)2-niomotuzumab kemudian
dimurnikan dengan kolom PD-10 (Sephadex G-25 M).
4.3 Pemurnian F(ab’)2-Nimotuzumab

Pemurnian F(ab’)2-nimotuzumab dari Fc nimotuzumab dilakukan
dengan kolom PD-10 yang merupakan kolom kromatografi eksklusi
ukuran. Pada proses pemisahan dengan kolom kromatografi eksklusi
ukuran, molekul dengan BM yang besar akan terbawa dengan eluen
melewati sela-sela gel sehingga keluar terlebih dahulu dari kolom,
sedangkan molekul dengan BM yang kecil akan terjebak masuk kedalam
pori-pori gel sehingga keluar lebih belakangan (Day & Underwood, 2001).
Berdasarkan prinsip tersebut F(ab’)2-nimotuzumab akan turun terlebih

31
dahulu dibanding Fc nimotuzumab. Gambar 4.4. memperlihatkan cuplikan

fraksi-fraksi hasil pemisahan F(ab’)2-nimotuzumab dari Fc nimotuzumab
dengan kolom PD-10 yang telah diberi pewarna protein.
Gambar 4.3. Cuplikan fraksi-fraksi hasil pemisahan F(ab’)2 -

nimotuzumab dan Fc nimotuzumab setelah diberi pewarna protein.
Gambar 4.3. diatas memperlihatkan bahwa hanya fraksi 13, 14, dan
15 memberikan memberikan warna biru yang mengindikasikan keberdaan
protein. Fraksi-fraksi ini kemudian dianalisis lebih lanjut dengan KCKT
dan SDS-PAGE.
4.4 Analisis Kemurnian F(ab’)2-Nimotuzumab

SDS-PAGE merupakan metode yang digunakan untuk analisis
protein secara kuantitatif dengan memisahkan protein berdasarkan BM
nya. SDS-PAGE sering digunakan untuk menentukan BM protein
(walaupun tidak akurat untuk beberapa kasus), memonitoring kemurnian
protein, dan mengidentifikasi protein pada sampel yang kompleks (Corley,
2005).
Gambar 4.4 memperlihatkan hasil analisis nimotuzumab sebelum
dan setelah fragmentasi, standar protein dalam kondisi reduksi (4.4.a) dan
non reduksi (4.4.b) dengan SDS-PAGE. Penentuan BM nimotuzumab
sebelum dan setelah fragmentasi dengan SDS-PAGE dilakukan dengan
membandingkan nilai Rf pita nimotuzumab (nilai Rf ini sebanding dengan
BM) sebelum dan sesudah difragmentasi pada kondisi reduksi dengan β-
merkaptoetanol dan kondisi non reduksi dengan nilai Rf pita-pita standar
protein pada kondisi yang sama. Tabel 4.2 memperlihatkan Rf pita-pita
standar dan BM protein - standar.

32
(c)
Gambar 4.4. Hasil analisis nimotuzumab sebelum dan setelah

fragmentasi, serta fraksi hasil pemurnian dengan SDS-PAGE.
Keterangan : (a) Reduksi dengan β-merkaptoetanol; (b) Non reduksi; S :
Standar protein; N : Nimotuzumab; F : Nimotuzumab setelah fragmentasi (Fraksi
No. 13; 14 dan 15); (c) Perbesaran pita F.
Tabel 4.2. Rf pita-pita standar Vs BM protein –standar.
BM Log
No. Protein Rf
(KDa) BM
1 Myosin 250 2,398 0,194805
2 Β-Galaktosidase 150 2,176 0,305195
3 Phosphorylase b 100 2 0,396104
4 BSA 75 1,875 0,467532
5 Ovalbumin 50 1,699 0,584416
6 Carbonic
anhydrase 37 1,568 0,662338
7 Soybean trypsin
inhibitor 25 1,398 0,785714
8 Lysozyme 20 1,301 0,844156
9 Aprotinin 15 1,176 0,922078
10 Insulin 10 1 1
Persamaan y = -1.659x + 2.682

33
Berdasarkan Tabel 4.2 kemudian disiapkan kurva kalibrasi standar

potein (BM vs Rf) yang persamaannya adalah y = -1.659x + 2.682.
Berdasarkan persamaan kurva kalibrasi standar protein, berat molekul dari
2 pita nimotuzumab dan 2 pita dari nimotuzumab setelah fragmentasi
(heavy chain Fab, dan campuran dari light chain Fab dan fragmen Fc)
pada kondisi reduksi berturut-turut adalah 49.08 kDa; 22.19 kDa; 21.65
kDa; dan 22.75 kDa. Hasil tersebut tidak jauh berbeda dengan berat
molekul heavy chain Fab, dan campuran dari light chain Fab dan fragmen
Fc dari F(ab’)2-trastuzumab yang telah dilaporkan Hermanto et al., yaitu
sebesar 23 kDa dan 22 kDa.
Tabel 4.3. Hasil analisis nimotuzumab sebelum dan setelah fragmentasi

dengan SDS-PAGE
Reduksi Non reduksi

No Protein Berat Molekul Berat Molekul
Rf(cm) (kDa) Rf(cm) (kDa)
mAb 0,597 49,08
1 0,306 149,40
nimotuzumab 0,805 22,19
heavy chain
0,799 21,65 - -
2 Fab
lightchain
Fab dan 0,812 22,75 - -
3 fragmen Fc
4 F(ab')2 - - 0,395 106,34
tidak
5 - -
diketahui 0,5 71,2
Sedangkan pada kondisi non reduksi, berat molekul yang

diperoleh untuk nimotuzumab, dan 2 pita nimotuzumab setelah
fragmentasi (F(ab')2-nimotuzumab dan protein yang tidak diketahui)
berturut-turut adalah 149,40 kDa; 106,34 kDa; dan 71,20 kDa.
Dibandingkan dengan literatur, berat molekul nimotuzumab, F(ab’)2, dan
protein yang tidak diketahui pada kondisi non reduksi tidak jauh berbeda
pula dengan yang telah dilaporkan oleh Xiques et.al., yaitu sebesar 153,44

34
kDa ;110,49 kDa; dan 72,44 kDa. Hasil analisa berat molekul terangkum
pada Tabel 4.3.
Berdasarkan hasil analisa SDS-PAGE pada kedua kondisi yaitu
reduksi dan non reduksi menunjukan bahwa nimotuzumab telah
terfragmen sempurna.
Kromatogram hasil analisis kemurnian F(ab')2-nimotuzumab yang
dimurnikan dengan kolom PD-10 dengan menggunakan KCKT yang
dilengkapi dilengkapi dengan kolom eksklusi ukuran ditampilkan pada
Gambar 4.5.
Respon Alat (mV)
Gambar 4.5. Kromatogram F(ab’)2-nimotuzumab setelah

dimurnikan dengan kolom PD-10.
Kromatogram pada Gambar 4.5 memperlihatkan dua puncak

dengan rt berurut-turut 6,037 dan 7,423 menit. Puncak pertama dengan rt
menit dapat dipastikan adalah F(ab’)2-nimotuzumab karena rt nya lebih
besar dari rt γ-globulin (5,637 menit, BM 158000 Dalton) dan lebih kecil
dari rt ovalbumin (6,497 menit, BM 44000). Puncak kedua dengan rt 7,423
menit sedikit lebih besar dari rt myoglobin (7,563 meit, BM 17000
Dalton) sementara itu adalah pengotor. Berdasarkan luas puncak
kromatogram hasil analisa KCKT F(ab’)2-nimotuzumab yang telah
dimurnikan dengan kolom PD-10 menunjukan kemurnian sebesar 89,1%.
4.5 Konjugasi F(ab’)2-Nimotuzumab dengan p-SCN-Bz-DOTA

Proses konjugasi F(ab’)2-nimotuzumab dengan p-SCN-Bz-DOTA
melibatkan pembentukan ikatan tiourea antara gugus –NH2 dari F(ab’)2-
nimotuzumab dengan gugus tiosianat dari p-SCN-Bz-DOTA (Patterson,

35
2013). Skema reaksi konjugasi antara F(ab’)2-nimotuzumab dengan p-

SCN-Bz-DOTA ditampilkan pada Gambar 4.6.
Konjugat yang terbentuk didialisis menggunakan kaset dialisa

dengan MWCO 20 kDa di dalam dapar amonium asetat untuk
memurnikan dari p-SCN-Bz-DOTA yang tidak terikat dan
mengkondisikan dalam dapar yang sesuai untuk penandaan.
Imunokonjugat
p-SCN-Bz-DOTA F(ab’)2-nimotuzumab p-SCN-Bz-DOTA-
F(ab’)2-nimotuzumab
Gambar 4.6. Skema reaksi konjugasi antara F(ab’)2-nimotuzumab dengan

p-SCN-Bz-DOTA.
Dalam penelitian ini dilakukan dengan perbandingan mol F(ab’)2 -

nimotuzumab terhadap p-SCN-Bz-DOTA yaitu 1 : 20 dan 1 : 50. Konjugat
p-SCN-Bz-DOT-F(ab’)2-nimotuzumab yang terbentuk kemudian didialisis
menggunakan kaset dialisis dengan MWCO 20 KDalton di dalam dapar
amonium asetat untuk memurnikan dari p-SCN-Bz-DOTA yang tidak
terikat dan mengkondisikan dalam dapar yang sesuai untuk penandaan.
Konjugat kemudian dianalisis menggunakan KCKT yang dilengkapi
dengan kolom eksklusi ukuran dan detektor UV dan dielusi dengan eluen
PBS 0,01M dan kecepatan alir 0,8 mL/menit. Tabel 4.4 memperlihatkan rt
p-SCN-Bz-DOTA-F(ab’)2-nimotuzumab dan rt F(ab’)2-nimotuzumab
serta nimotuzumab sebagai pembanding.
Pada Tabel 4.4 dapat dilihat rt puncak p-SCN-Bz-DOTA-F(ab’)2 -

nimotuzumab sedikit lebih kecil dibandingkan dengan F(ab’)2-
nimotuzumab yang mengindikasikan telah terjadi konjugasi p-SCN-Bz-
DOTA pada F(ab’)2-nimotuzumab sehingga BM menjadi sedikit lebih
besar dibandingkan F(ab’)2-nimotuzumab.

36
Tabel 4.4. Waktu retensi (rt) p-SCN-Bz-DOTA-F(ab’)2-nimotuzumab dan

rt F(ab’)2-nimotuzumab serta nimotuzumabhasil analisis dengan KCKT.
Waktu retensi
Senyawa
(rt) (menit)
Nimotuzumab 6,98
F(ab')2nimotuzumab 7,60
p-SCN-Bz-DOTA-F(ab’)2-nimotuzumab 7,26
Catatan:
Kolom: eksklusi ukuran (SEC-18 Agilent), laju alir 0,8 mL/menit.
4.6 Penandaan
177
Pembentukan radioimmunokonjugat Lu-SCN-Bz-DOTA-
F(ab’)2-nimotuzumab dilakukan dengan menambah sejumlah larutan
177
LuCl3 kedalam SCN-Bz-DOTA-F(ab’)2-nimotuzumab yang diikuti
177
dengan pengaturan pH dan pemanasan. Skema reaksi pembentuan Lu-
SCN-Bz-DOTA-F(ab’)2-nimotuzumab ditunjukan pada Gambar 4.7.
+
Imunokonjugat Radioimunokonjugat
p-SCN-Bz-DOTA- 177
Lu-SCN-Bz-
F(ab’)2-nimotuzumab DOTA-F(ab’)2-
nimotuzumab
Gambar 4.7. Skema reaksi pembentukan radioimunokonjugat

177
Lu-SCN-Bz-DOTA- F(ab’)2-nimotuzumab.
177
Radioimmunokonjugat atau Lu-SCN-Bz-DOTA-F(ab’)2-
nimotuzumab yang terbentuk seperti senyawa radiofarmaka yang lain
harus memenuhi beberapa persyaratan yang salah satunya adalah
kemurnian radiokimia. Kemurnian radiokimia yang tinggi (95% - 100%),
dimaksudkan untuk mencegah atau memperkecil terjadinya penimbunan
pada organ bukan target (Nurlaila, 2007).

37
Kemurnian radiokimia pada penelitian ini dilakukan dengan

mengacu pada sistim KLT pada penandaan antibodi monoklonal dengan
177
Lu yang dilaporkan oleh Humani et al., (2010) yaitu menggunakan
sistim KLT dengan fasa diam ITLC-SG dan fasa gerak larutan salin.
Humani et al., melaporkan bahwa antibodi monoklonal bertanda 177Lu dan
177
Lu bebas (177Lu yang tidak terikat pada antibodi monoklonal)
memberikan retardation factor (Rf) yang sama (0) pada KLT dengan fasa
diam ITLC-SG dan fasa gerak larutan salin. Pada pengujian radiokimia
177
antibodi monoklonal bertanda Lu oleh sebab itu selalu ditambahkan
177 177
EDTA untuk mengikat Lu bebas yang akan membentuk Lu-EDTA
dengan Rf = 1. Tabel 4.5 memperlihatkan Rf dari komponen-komponen
yang terlibat pada proses penandaan SCN-Bz-DOTA-F(ab’)2-
177
nimotuzumab dengan Lu yang diuji dengan menggunakan sistim KLT
dengan fasa diam ITLC-SG dan fasa gerak larutan salin.
Tabel 4.5. Rf dari komponen-komponen yang terlibat pada proses

penandaan SCN-Bz-DOTA-F(ab’)2-nimotuzumab dengan 177Lu.
Komponen Rf
177
Lu 0
177
Lu + EDTA 1
177
Lu + F(ab’)2-nimotuzumab + EDTA 1
Nimotuzumab 0
177
Lu + SCN-Bz-DOTA-F(ab’)2-nimotuzumab + EDTA 0
(setelah dimurnikan)
Catatan: Sistim KLT dengan fasa diam ITLC-SG dan fasa gerak larutan salin (NaCl
0,9%).
Berdasarkan Tabel 4.5 dapat dilihat bahwa kemurnian radiokimia

177
SCN-Bz-DOTA-F(ab’)2-nimotuzumab bertanda Lu dapat ditentukan
dengan sistim KLT dengan fasa diam ITLC-SG dan fasa gerak larutan
177
salin, dimana SCN-Bz-DOTA-F(ab’)2-nimotuzumab bertanda Lu
177
memberikan Rf = 0 sedangkan Lu bebas yang tidak terikat dengan
SCN-Bz-DOTA-F(ab’)2-nimotuzumab tetapi terikat pada EDTA (177Lu-

38
EDTA) memberikan Rf = 1. Tabel 4.5 juga memperlihatkan bahwa tidak

177
ada Lu yang terikat pada F(ab’)2-nimotuzumab yang tidak mempunyai
ligand DOTA.
177
Penandaan SCN-Bz-DOTA-F(ab’)2-nimotuzumab dengan Lu
dilakukan dengan rasio mol SCN-Bz-DOTA-F(ab’)2 nimotuzumab 1 : 1
terhadap 177Lu, dan pada akhir reaksi ditambahkan EDTA berlebih dengan
177
rasio mol 20 : 1 terhadap Lu. Langkah pertama dalam proses
177
penandaan yaitu menambahkan sejumlah Lu kedalam amonium asetat
0,25 M yang kemudian dimasukan dalam tabung reaksi yang berisi larutan
SCN-Bz-DOTA-F(ab’)2-nimotuzumab, yang kemudian dikuti dengan
pengaturan pH, pemanasan pada 37 0C. Pada akhir reaksi kemudian
ditambahkan EDTA secara berlebih. Efisiensi penandaan kemudian
ditentukan dengan pengujian sejumlah cuplikan dengan menggunakan
sistim KLT dengan fasa diam ITLC-SG dan fasa gerak larutan salin.
Gambar 4.8 memperlihatkan efisiensi penandaan SCN-Bz-DOTA-F(ab’)2
177
-nimotuzumab dengan Lu terhadap lama waktu penandaan pada suhu
37 0C.
Gambar 4.8. Grafik optimasi waktu penandaan SCN-Bz-DOTA-

F(ab’)2-nimotuzumab dengan177Lu.
Pada Gambar 4.8 dapat dilihat bahwa lama waktu penandaan yang
optimum adalah 45 menit, karena tidak ada lagi peningkatan efisiensi
penandaan setelah pemanasan selama 45 menit..

39
Pada penelitian ini ada batch konjugat SCN-Bz-DOTA-F(ab’)2-

nimotuzumab yang berhasil disiapkan. Batch pertama disiapkan dengan
rasio mol p-SCN-Bz-DOTA 20 : 1 terhadap F(ab’)2-nimotuzumab dan
batch kedua dengan rasio mol p-SCN-Bz-DOTA 50 : 1 terhadap F(ab’)2-
nimotuzumab. Efisiensi penandaan kedua batch SCN-Bz-DOTA-F(ab’)2-
nimotuzumab tersebut dengan 177Lu diperlihatkan pada Tabel 4.6.
Table 4.6. Efisiensi penandaan p-SCN-Bz-DOTA-F(ab’)2-

nimotuzumabdengan 177Lu.
Ratio mol: Efisiensi
p-SCN-Bz- F(ab’)2 penandaan
p-SCN-Bz-
DOTA nimotuzumab
DOTA-
F(ab’)2 20 1 4,91%
nimotuzumab 50 1 14,13%
Efisiensi penandaan p-SCN-Bz-DOTA-F(ab’)2-nimotuzumab

177
dengan Lu seperti terlihat pada Tabel 4.6 meningkat dari 4,91% (rasio
mol F(ab’)2-nimotuzumab dengan p-SCN-Bz-DOTA 1 : 20) menjadi
14,13% (rasio mol F(ab’)2-nimotuzumab dengan p-SCN-Bz-DOTA 1 :
50). Peningkatan efisiensi penandaan ini diperkirakan karena
meningkatnya jumlah DOTA yang terikat pada F(ab’)2-nimotuzumab
177 177
sehingga pada saat ditandai dengan Lu jumlah Lu yang terikat pada
p-SCN-Bz-DOTA-F(ab’)2-nimotuzumab juga akan meningkat.
Sesuai dengan persyaratan kemurnian radiokimia suatu

radioimunokonjugat yang akan digunakan harus memiliki kemurnian
radiokimia 95% - 100% oleh sebab itu perlu dimurnikan lebih lanjut.
Pemurnian 177Lu-p-SCN-Bz-DOTA-F(ab’)2-nimotuzumab dari 177Lu bebas
177
dalam bentuk Lu-EDTA dilakukan dengan melewatkan campuran pada
kolom Sephadex G-25M yang kemudian dielusi dengan eluent dapar
pospat 0,01 M pH 7,4. Sejumlah fraksi (0,5 mL/fraksi, sebanyak 50 fraksi)
ditampung. Setiap fraksi kemudian diukur aktifitasnya dengan dose
calibrator. Gambar 4.9 memperlihatkan radiokromatogram hasil
pemurnian 177Lu-p-SCN-Bz-DOTA-F(ab’)2-nimotuzumab.

40
Gambar 4.9. Radiokromatogram hasil pemurnian 177Lu-SCN-Bz-DOTA-

F(ab’)2-nimotuzumab.
Sesuai dengan prinsip kromatografi eksklusi ukuran molekul

dengan BM yang besar akan keluar terlebih dahulu diikuti oleh molekul
dengan BM yang lebih kecil. Berdasarkan radiokromatogram pada
177
Gambar 4.9 dapat diperkirakan bahwa puncak pertama adalah Lu-p-
177
SCN-Bz-DOTA-F(ab’)2-nimotuzumab sedangkan puncak ke dua Lu
177
bebas dalam bentuk Lu-EDTA. Gambar 4.10a dan 4.10b berikut
memperlihat radiokromatogram fraksi yang diambil puncak pertama
(Fraksi 17) dan puncak kedua (Fraksi 39).
a)

41
b)
Gambar 4.10. Radiokromatogram (a) Fraksi 17 dan (b) Fraksi 39.
Berdasarkan radiokromatogram fraksi 17 memberikan Rf = 0 yang

177
mengindikasikan keberadaan Lu-p-SCN-Bz-DOTA-F(ab’)2-
nimotuzumab dengan kemurnian radiokimia 99,9%. Fraksi 39 sementara
177
itu memberikan Rf = 1 yang mengindikasikan keberadaan Lu bebas
177
dalam bentuk Lu-EDTA.
4.7 Uji Stabilitas

Sediaan radiofarmaka sama halnya dengan sediaan obat yang
lainnya harus cukup stabil dalam penyimpanan. Uji stabilitas penyimpanan
dilakukan pada dua kondisi yaitu pada suhu kamar dan suhu 40C dalam
177
beberapa waktu. Kestabilan Lu-SCN-Bz-DOTA-F(ab’)2-nimotuzumab
diuji dengan ITLC-SG dengan fasa gerak larutan salin utuk mengetahui
kemurnian radiokimia. Syarat kemurnian radiokimia dari sediaan
radiofarmaka harus memiliki kemurnian 95% - 100% (Nurlaila, 2007).
Berdasarkan tabel 4.7 hasil uji stabilitas yang telah dilakukan pada
177
0, 24, 48, 72, dan 96 jam menunjukan bahwa Lu-SCN-Bz-DOTA-
F(ab’)2-nimotuzumab yang disimpan pada suhu kamar dan 40 C masih
stabil karena kemurniannya diatas 95 % yaitu berkisar antara 98,9% -
99,9%.

42
Tabel 4.7. Persentase kemurnian pada suhu kamar dan 4 0C.
Jam Suhu kamar 4 0C

0 99,9 ± 0,02% 99,9 ± 0,02%
24 99,9 ± 0,23% 99,5 ± 0,26%
48 99,6 ± 0,26% 99,9 ± 0,25%
72 99,8 ± 0,06% 98,5 ± 1,28%
96 99,6 ± 2,05% 98,9 ± 2,42%

BAB V
KESIMPULAN DAN SARAN
5.1 Kesimpulan
177
Preparasi Lu-SCN-Bz-DOTA-F(ab’)2-nimotuzumab sebagai
kandidat radiofarmaka telah berhasil dilakukan walaupun efisiensi
177
penandaan masih kecil. Penyiapan Lu-SCN-Bz-DOTA-F(ab’)2-
nimotuzumab diawali dengan proses fragmentasi nimotuzumab dengan
pepsin menjadi F(ab’)2-nimotuzumab selama 14 jam yang kemudian
dimurnikan dengan kolom PD-10. Fraksi yang megandung F(ab’)2-
nimotuzumab dikonjugasi dengan p-SCN-Bz-DOTA untuk membentuk
konjugat p-SCN-Bz-DOTA-F(ab’)2-nimotuzumab. Konjugat kemudian
177
ditandai dengan Lu selama 1 jam pada suhu 370C dilanjutkan dengan
177
pemurnian dengan kolom sephadex G25 M. Kemurnian radiokimia Lu-
SCN-Bz-DOTA-F(ab’)2-nimotuzumab yang berhasil diperoleh pada
177
penelitian adalah sebesar 99,9%. Uji stabilitas Lu-SCN-Bz-DOTA-
F(ab’)2-nimotuzumab pada suhu 4 0C dan suhu kamar selama 96 jam
177
menunjukan Lu-SCN-Bz-DOTA-F(ab’)2-nimotuzumab stabil dengan
kemurnian radiokimia berkisar 98,9% - 99,9%.
5.2 Saran
Pada penelitian lebih lanjut disarankan melakukan optimasi kondisi

177
penandaan SCN-Bz-DOTA-F(ab’)2-nimotuzumab Lu agar didapatkan
177
efisiensi penandaaan tinggi. Karakterisasi jumlah ligan dan Lu yang
terikat pada F(ab’)2-nimotuzumab serta melihat stabilitas F(ab’)2-
nimotuzumab juga disarankan untuk dilakukan.

Daftar Pustaka
Abbas, A. K., & Lichtman, A. H. (2005). Antibodies and antigens. Philadelphia:

Elsevier Saunders.
Acton, Q. A. (2013). Pancreatic Cancer : New Insights for the Healthcare

Professional. Atlanta Georgia: Scholarly Editions.
Alberts, B., Johson, A., Lewis, J., Raff, M., Robert, K., & Walter, P. (2002).
Molecular biology of the cell. New York: Garland Science.
Aziz, A., & Suherman, N. (2013). Karateristik Fisiko-Kimia Sediaan Radioisotop

175
YbCl3 Hasil Iradiasi Bahan Sasaran 174Yb Diperkaya 98,4%. J. Iptek
Nuklir Ganendra, 16, 48-58.
Boland, W. K., & Bebb, G. (2009). Nimotuzumab: a novel anti-EFGR

monoklonal antibody that retains anti-EFGR activity while minimizing
skin toxicity. Expert.opin.bio.ther , 9.
Brechbiel. (2008, Mei 6). Backbone-Substituted Bifunctional Dota Ligands,

Complexes and Compositions Thereof, And Methods Of Using Same.
Campbell, S. C., Rini, B. I., Uzzo, R. G., & Lane, B. (2009). 100 Questions &
Answers About Kidney Cancer. Canada: Jones and Bartlett Publishers.
Ciardiello, F., & Tortora, G. (2008, Maret 13). EGFR Antagonists in Cancer
Treatment . N Engl J Med , 1160-1174.
Copper, G. (1993). The Cancer Book. UK: Jones and Bartlleth Publisher.
Corley, R. B. (2005). A Guide to Methods in the Biomedical Sciences. Boston:

Springer Science.
Day, R., & Underwood, A. (2001). Analisis Kimia Kualitatif edisi keenam.
Jakarta: Erlangga.
Deter, L. L. (2010). Medication Administration. USA: Delmar, Cengange

Learning.

45
E′ VA TO′ TH., B. E. (1994). Kinetics of formation and dissociation of lathanide

(III)–DOTA complexes. Inorg.Chem. , 4070-4076.
Fried, G. H., & Hadensenos, G. J. (2006). Schaum's Outlines of Theory and

Problems of BIOLOGY Second Edition. Jakarta: Penerbit Erlangga.
Galsky, M. D. (2010). Everything You Need to Know about Cancer in Languange

You Can Actually Understand. USA: Jones and Bartlett. 4-9.
Gansow. (1991). Int. J. Rad.Appl. Instrum. [B]. Nucl.Med Biol , 369-381.
Godewijckstraat, V. (2012). Phase II study of nimotuzumab, a humanized

monoclonal anti-epidermal growth factor receptor (EFGR) antibody, in
patien with locally advanced or metastatic pancreatic cancer,
investigational new drugs. springer Netherlands.
Haryuni, R. D. (2012). Fragmentasi Nimotuzumab untuk Preparasi 125I-F(ab’)2-

Nimotuzumab Sebagai Radiofarmaka Terapi Kanker. Depok: Fakultas
Farmasi Universitas Indonesia.
Haryuni, R. D., Bahtiar, A., Soenarjo, S., Harahap, Y., Mutalib, A., Ramli, M., et
al. (2014). Fragmentation of Nimotuzumab for Preparation of 125 I-
F(ab')2-Nimotuzumab-NLS Radiopharmaceutical for Cancer Therapy.
Atom Indonesia.
Herbst, R., & Bunn, P. J. (2003). Targeting HER1:Oncogenic overexpression in

multiple tumor types. Clin Cancer Res , 5813-5824.
Hermanson, G. T. (1996). Bioconjugate Techniques. Academic Press.
Hermanto, S., Haryuni, R. D., Ramli, M., Mutalib, A., & Hudiyono, S. (2012).
Preparation of F(ab')2 transtuzumab fragment for Radioimmunoconjugate
synthesis of 177Lu-DOTA-F (ab')2-transtuzumab. IOSR Journal of
Pharmacy , 12-18.
Humani, T. S., Ramli, M., Rustendi, C. T., & Subur, M. (2010). Peparasi dan Uji
Stabilitas 177-Lu-Dota-Nimotuzumab Sebagai Radiofarmaka Terapi

46
Kanker. Seminar Nasional VI SDM Teknologi Nuklir. Yogyakarta.663-

669.
Kadarisman, S. S., Herlina, & Sriyono. (2011). Pemisahan Radioisotop Medis Lu-
177 Dari Matrik Yb-Lu Paska Iradiasi Melalui Resin Penukar Ion degan
Eluen alfa-HIBA dan Larutan HNO3.
Kassis, A. I. (2011). Therapeutic Rations of Targeted Radionuclides.

Philadelphia: LIPPINCOTT WILLIAMS & WILKINS,a WOLTERS
KLUWER business.
King, D. J. (1998). Applications and Engineering Of Monoclonal Antibodies.

CRC Press.
Leswara, N. D. (2007). Buku Ajar Radiofarmasi. Jakarta: EGC.
Limantara, L., & Heriyanto. (2011). Optimasi Proses Ekstraksi Fukosantin

Rumput Laut Coklat Padina Australis Hauck Meggunakan Pelarut Organik
Polar. Ilmu Kelautan , 86-94.
Nurlaila, Z. (2007). Radiofarmaka Peptida untuk Diagnosis dan Terapi . Maj

Kedokt Indon.Volum: 57. Nomor: 8. 265-273 .
Oemiati, R. (2011). Prevalensi Tumor dan Beberapa Faktor yang Mempengaruhi

di Indonesia. Bul. Penelit. Kesehat, 39, 190-204.
Palasz, A., & Czekaj, P. (2000). Toxicological and cytophysiological aspects of

lanthanides action. Acta Biochimica Polonica.1107-1114 .
Pandit, N. K. (2007). Introduction to The Pharmaceutical Sciences. USA:

Lippincott Williams & Wilkins.
Pasaribu, E. T. (2006). Epidemiologi dan Etiologi Kanker. Majalah Kedokteran

Nusantara, 39, 266-269.
Patterson, C. (2013). Development of a New Positron Emission Tomography

Tracer for Targeting Tumor Angiogenesis : Synthesis, Small Animal
Imaging, and Radiation Dosimetry. Molecules , 5594-5610.

47
Ramli, M., Hidayat, B., Rustendi, C. T., Subur, M., Ardiyanto, C. N., Karyadi, et
177
al. (2012). In Vitro and In Vivo Testing of Lu-DOTA-Nimotuzumab, a
Potential Radioimmunotherapeutical Agent of Cancers. ITB J., 333-345.
Rasjidi, I. (2009). Epidemiologi Kanker Serviks. Indonesian Journal of Cancer ,

103-108.
Reddy, L. H., & Couvreur, p. (2010). Macromoncular anticancer trapeutics. New

Jarsey: Human Press. 425.
Sabiston, D. C. (1987). Sabiston's Essentials Of Surgery. (J. Oswari, Ed.) Jakarta:

EGC.
Santoso, & Suharti. (2009). Epidermal growth factor receptor (EFGR) sebagai
sasaran terai kanker kolorektal. Cermin Dua Kedokteran, 36, 5-12.
Schwartz, G. F., Solin, L. J., Olivotto, I. A., Ernster, V. L., & Pressman, P. I.
(2000). Consensus conference on the treatment on in situ ductal carcinoma
of the breast. Cancer , 946-954.
Sloane, E. (2003). Anatomi dan Fisiologi untuk Pemula. Jakarta: EGC.
T. Smith, B. (2008). Concepts in Immunology and Immunotherapeutics fourth

edition. american society of health-system pharmacists. 29-30.
Tikhomirov, I. A., Garrido, G., Yang, E., Sherman, I., & Perez, R. (2008).
Bivalent Binding Properties of Epidermal Growth Factor Receptor
(EGFR) Targeted Monoclonal Antibodies : factors Contributing ti
Difference in Observed Clinical Profiles.
Tjay, T. H., & Raharja, K. (2007). OBAT-OBAT PENTING Khasiat, Penggunaan,

dan Efek Samping. Jakarta: PT Elex Media Komputindo.
Venkatesh, M., & Chakraborty, S. (2005, November 14-18). Production of

Therapeutic Radionuclides in Medium Flux Research Reactors.
Proceedings of International Symposium, International Atomic Energy
Agency , 285-299.

48
Vera, D. R., Eigner, S., Henke, K. E., Lebeda, O., Melichar, F., & Beran, M.
177
(2012). Preparasi and preclinical evaluation of Lu-nimotuzumab
targeting epidermal growth factor receptor overexpressing tumors. Nuclear
Medicine and Biology , 3-13.
Watson, D. (2005). Pharmaceutical Analysis. UK: Elsevier Limited.
Widyastuti. (2007). Radiofarmaka Berbasis Antibodi. Jurnal Radioisotop dan

Radiofarmaka , 37-46.
Walker, J. M., & Rapley, R. (2008). Molecular Biomethods Handbook. New

Jarsey: Humana Press.
Wu, C.-S. (1995). Handbook of Size Exclution Chromatography. USA: Marcel

Dekker,Inc.
Xiques, A. (2010). Local Production of 90Y And 188Re Radionuclides and

Development of Radiopharmaceuticals for Therapy, “REPORT on the 2nd
Research Coordination Meet". REPORT on the 2nd Research
Coordination Meet on 'The Development of Therapeutic'. 41-54.www-
pub.iaea.org/MTCD/publications/PDF/trs470_web.pdf.

49
Lampiran 1. Skema Prosedur Penelitian Secara Umum
Sediaan injeksi
nimotuzumab
Pemurnian dengan kaset dialisa
Zat tambahan Nimotuzumab
Fragmentasi dengan pepsin
Kolom dengan PD-10
F(ab’)2-nimotuzumab Fragmen Fc
Analisa dengan KCKT dan SDS-PAGE

Konjugasi p-SCN-Bz-DOTA pada F(ab’)2-nimotuzumab
Immunokonjugat DOTA- F(ab’)2 -nimotuzumab
Pemurnian dengan kaset dialisa
Penandaan dengan 177Lu dan analisa persen penandaan
dengan KLT
Kolom dengan Sephadex G-25 M
177 177
Lu-DOTA-F(ab’)2-nimotuzumab Lu bebas
Pengukuran radioaktivitas dengan Dose Calibrator
Uji stabilitas
Suhu 4 0C Suhu Kamar
Gambar 2. Bagan Kerangka Konsep Penelitian.

50
Lampiran 2. Pembuatan Pereaksi
a. Dapar asetat 0,02 M pH 4,5

Ditimbang natrium asetat 1,31 g dan ambil asam asetat 1,74 mL.
Keduanya dicampur dan ditambahkan 1 L air kemudian diaduk dengan
magnetik stirer. Cek pH larutan jika tepat pH 4,5 genapkan air hingga
2 L.
b. Dapar fosfat 0,1 M pH 7,4

Ditimbang 1,07 g natrium dihidrogen fosfat monobasik dan 2,18 g
dinatrium hidrogen fosfat dibasik. Campuran dilarutkan dalam 1 L air
kemudian diaduk dengan magnetik stirer. Cek pH larutan jika tepat pH
7,4 genapkan air hingga 2 L.
c. Tris HCl 10 mM pH 8
Ditimbang 60,60 mg trizma base, kemudian larutkan dalam 40 mL
air. Diaduk menggunakan magnetik stirer, pH diatur menjadi 8,0
dengan penambahan HCl 1 M. Larutan dimasukan dalam labu ukur 50
mL, kemudian ditambahkan air hingga volume tepat 50 mL.
d. HCl 1 M
Diambil 4,9 mL HCl 32 % kemudian dimasukan dalam gelas ukur
yang telah diisi air 25 mL. HCl dimasukan perlahan melewati dinding
gelas ukur dan selanjutnya digenapkan air menjadi 50 mL.
e. HCl 6 N
Diambil 11,8 mL HCl 32 % kemudian dimasukan dalam gelas ukur
yang telah diisi air 5 mL. HCl dimasukan perlahan melewati dinding
gelas ukur dan selanjutnya digenapkan air menjadi 20 mL.

51
f. Tris HCl 0,5 M pH 6,8 (dapar stacking)

Ditimbang 3 g trizma base, kemudian larutkan dalam 40 mL air.
Diaduk menggunakan magnetik stirer, pH diatur menjadi 6,8 dengan
penambahan HCl 6 N. Larutan dimasukan dalam labu ukur 50 mL,
kemudian ditambahkan air hingga volume tepat 50 mL.
g. Tris HCl 1,5 M pH 8,8 (dapar resolving)

Ditimbang 18,15 g trizma base, kemudian larutkan dalam 75 mL
air. Diaduk menggunakan magnetik stirer, pH diatur menjadi 8,8
dengan penambahan HCl 6 N. Larutan dimasukan dalam labu ukur 100
mL, kemudian ditambahkan air hingga volume tepat 100 mL.
h. SDS 10%
Ditimbang 1 g SDS kemudian tambahkan 8 mL air. Diaduk dengan
magnetik stirer hingga larut. Kemudian larutan dimasukkan ke dalam
gelas ukur, ditambahkan air hingga volume mencapai 10 mL.
i. Larutan stok akrilamid / Bis 30%

Ditimbang 292 g akrilamid dan 0,8 g N’N’-bis-methylene-
acrylamide, dilarutkan dalam 100 mL air, kemudian disaring dan
disimpan pada suhu 4 0C. dihindarkan dari cahaya dan maksimum
penyimpanan 30 hari.
j. Larutan dapar running 10x

Ditimbang 15,5 g trizma base, 72 g glisin, dan 5 g SDS. Dilarutkan
dan ditambahkan air 500 mL air.
k. Larutan dapar sampel

Diambil 3,55 mL air; 1,25 mL dapar stacking; 2,5mL gliserol; 2
mL 10% SDS; dan 0,2 mL 0,5% bromophenol blue. Semua larutan
diaduk dengan magnetik stirer. Sebelum digunakan, 50 µL β-
merkaptoetanol ditambahkan ke dalam 950 µL larutan stok.

52
l. NaOH 1 M
Ditimbang 8 g NaOH dan dilarutkan dalam 150 ml air sampai
larut. Larutan dimasukkan dalam labu ukur dan digenapkan volumnya
menjadi 200 mL.
m. Bromophenol blue 0,5%

Ditimbang 5 mg bromophenol blue kemudian dilarutkan dalam 1
mL. Catatan : dibuat segar saat ingin digunakan.
n. Larutan APS 10%

Ditimbang 100 mg APS kemudian dilarutkan dalam 1 mL. Catatan
: dibuat segar saat ingin digunakan.
o. Larutan resolving gel 12%

Diambil 3,4 mL air; 4 mL akrilamid/ bis 30%; 2,5 mL dapar
resolving; dan 0,1 mL SDS 10%. Semua larutan dicampur hingga
homogen. Sebelum larutan dimasukkan ke dalam cetakan gel
elektroforesis, ditambahkan 200 µL APS 10% dan 10 µL TEMED.
p. Larutan stacking gel 4%

Diambil 6,1 mL air; 1,3 mL akrilamid/ bis 30%; 2,5 mL dapar
resolving; dan 0,1 mL SDS 10%. Semua larutan dicampur hingga
homogen. Sebelum larutan dimasukkan ke dalam cetakan gel
elektroforesis, ditambahkan 200 µL APS 10% dan 10 µL TEMED.
q. Larutan staining
Ditimbang 500 mg coomassie brilliant blue kemudian dilarutkan
dalam 250 mL metanol. Setelah larut, tambahkan campuran tersebut
dengan 35 mL asam asetat glasial dan 215 mL air.

53
r. Larutan destaining
Diambil 40 mL methanol dan 7,5 mL asam asetat kedalam gelas
ukur kemudian genapkan hingga volume menjadi 100 mL.

54
Lampiran 3. Kadar Protein Nimotuzumab Hasil Dialisa.
Rata-rata
Rata-rata
Konsentrasi Absorban absorban -
absorban
Blanko
Blanko 0,16 0,163 0,1615
Standar Protein
0,05 0,165 0,165 0,165 0,0035
0,1 0,204 0,207 0,2055 0,044
0,25 0,327 0,313 0,32 0,1585
0,5 0,477 0,444 0,4605 0,299

Sampel 10x
0,446 0,448 0,447 0,2855
pengenceran
y = 0,6537x - 0,0208
0,2855 = 0,6537x - 0,0208
X =
X = 0,468564 mg/mL
[sampel] = 10 x 0,4678564 mg/mL
= 4,68564 mg/mL
= 5 mg/mL

55
Lampiran 4. Gambar Kurva Kalibrasi SDS-PAGE Kondisi Reduksi.
Lampiran 5. Kromatogram Absorbansi Fraksi Hasil Pemurnian Fragmen

Nimotuzumab dengan PD-10.

56
Lampiran 6. Kromatogram dan Gambar Hasil KLT Komponen-Komponen yang

Terlibat Pada Proses Penandaan SCN-Bz-DOTA-F(Ab’)2-
Nimotuzumab dengan 177Lu.

57
F(ab’)2-nimotuzumab
Lampiran 7. Alat Penelitian.
Kaset dialisa Termomixer Plate reader KCKT
Protein Filter KLT Kolom Kolom

Sephadex PD-10
ᵧ- Counter Dose
Calibrator

Citra R.A.P.P - Fkik

Diunggah oleh

Informasi Dokumen

Judul Asli

Hak Cipta

Format Tersedia

Bagikan dokumen Ini

Bagikan atau Tanam Dokumen

Opsi Berbagi

Apakah menurut Anda dokumen ini bermanfaat?

Apakah konten ini tidak pantas?

Hak Cipta:

Format Tersedia

Citra R.A.P.P - Fkik

Diunggah oleh

Hak Cipta:

Format Tersedia

UIN SYARIF HIDAYATULLAH JAKARTA

PREPARASI DAN UJI STABILITAS 177Lu-DOTA-F(ab’)2-

CITRA REZZA AURORA PUTRI PALANGKA

FAKULTAS KEDOKTERAN DAN ILMU KESEHATAN

PREPARASI DAN UJI STABILITAS 177Lu-DOTA-

Diajukan sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Sarjana

CITRA REZZA AURORA PUTRI PALANGKA

FAKULTAS KEDOKTERAN DAN ILMU KESEHATAN

Nama : Citra Rezza Aurora Putri Palangka

Antibodi monoklonal sudah banyak digunakan untuk terapi kanker salah

Kata kunci : 177Lu-DOTA-F(ab’)2-nimotuzumab, Fragmentasi, Nimotuzumab.

vi UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

Name : Citra Rezza Aurora Putri Palangka

Keywords :177Lu -DOTA-F(ab’)2-nimotuzumab, Fragmentation, Nimotuzumab.

vii UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

viii UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

Ciputat, Juli 2014

ix UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

x UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

xi UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

xii UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

Tabel 4.1. Komponen standar protein ...................................................... 29

xiii UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

xiv UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

APS : Amonium Per Sulfat

xv UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

1.1 Latar Belakang

1 UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

HER1/EGFR sementara itu over expressed (diekspresikan secara

UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

seperti F(ab’)2 hasil fragmentasi mAb utuh dengan menggunakan pepsin

UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

1.2 Batasan Masalah

1.3 Perumusan Masalah

1.4 Tujuan Penelitian

UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

1.6 Manfaat Penelitian

UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

2.2 Etiologi Kanker

6 UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

- Jelaga batu bara: kanker kulit, laring, dan bronkhus.

UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

Gambar 2.1. Struktur molekul antibodi.

UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

Antibodi monoklonal diklasifikasikan menjadi 4 tipe (Gambar 2.2),

1. Antibodi monoklonal Murine

UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

2. Antibodi monoklonal Chimeric

3. Antibodi monoklonal Humanized

4. Antibodi monoklonal Fully human

Gambar 2.2. Murine, chimeric, humanized, dan human Abs.

UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

2.4 Fragmentasi Antibodi Monoklonal Oleh Enzim

Gambar 2.3. Fragmentasi antibodi klas IgG dengan papain,

[T. Smith, 2008]

Antibodi monoklonal dapat difragmentasi menjadi beberapa jenis

2.5 Epidermal Growth Factor Receptor (EGFR)

UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

Gambar 2.4. Ilustrasi skematik jalur EGFR pengaruh terhadap sel

EGFR memberikan jalur sinyal transduksi intraseluler seperti

UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

dengan kata lain overekspresi. Overekspresi EGFR terjadi pada kanker

Gambar 2.5. Mekanisme kerja obat anti-EGFR pada sel kanker.