UJI AKTIVITAS REDUKSI STRES OKSIDATIF EKSTRAK ETANOL BUAH

PARE (Momordica charantia, L) DAN PROFIL PERBAIKAN DIAMATER SEL

ISLET BETA PANKREAS TIKUS DIABETES MELLITUS YANG DIINDUKSI
ALOKSAN

Dahlia Andayani1 dan Ika Andhyka1

1
Jurusan Ilmu Farmasi, Universitas Nahdlatul Wathan, Mataram, Indonesia

Abstrak Buah pare dikenal masyarakat sebagai obat tradisional diabetes mellitus dan sebagai
antioksidan. Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui aktivitas ekstrak etanol buah pare (Momordica
charantia, L) dalam meningkatkan enzim antioksidan dan memperbaiki sel islet beta pankreas tikus
yang diinduksi aloksan.
Penelitian ini menggunakan sampel dari buah pare yang berasal dari Mataram Pulau Lombok dengan
rancangan penelitian pre and post test control group design. 25 ekor tikus jantan dikelompokkan
menjadi 5 kelompok perlakuan, yaitu kelompok tikus normal, dan tikus DM yang terdiri dari kontrol
negatif hanya diberikan pakan dan cmc 1%, kontrol positif diberikan pakan dan obat glibenklamid
dosis 0,1 mg/kg BB, perlakuan 1 diberikan pakan standar dan ekstrak etanol buah pare dosis 100
mg/kg BB dan perlakuan 2 diberikan dosis 200 mg/kg BB. Pada hari ke 30 setelah perlakuan tikus
dikorbankan untuk analisis kadar MDA (malondialdehid) dalam hati dan histopatologi pankreas.
Data hasil penelitian menunjukkan kadar MDA tikus Normal sebesar 4,05 nmol/gr, kontrol negatif
meningkat menjadi 14,8 nmol/gr sedangkan pada kelompok EeTP dosis 1 dan 2 yaitu 7,77 nmol/gr dan
3,32 nmol/gr. Penurunan kadar MDA terjadi karena aktivitas EeTP mengurangi stres oksidatif. Hasil
uji histopatologi pankreas menunjukkan diamater sel islet EeTP dosis 1 dan 2 yang lebih besar
dibandingkan dengan kontrol negatif. Uji korelasi antara diameter sel islet dangan kadar MDA tidak
menunjukkan adanya hubungan. Dapat disimpulkan bahwa EeTP dapat mengurangi stres oksidatif dan
memperbaiki sel islet beta pankreas pada tikus DM yang diinduksi aloksan karena ada kandungan
flavonoid.

1. PENDAHULUAN dalam ekstrak air buah pare kandungan fenol

Manfaat buah pare sebagai obat diabetes lebih tinggi dari pada flavonoid (Rezaeizadeh

atau obat hipoglikemi sudah banyak dibuktikan et al., 2011).

melalui penelitian ilmiah (Ayoub et al., 2013). Beberapa senyawa yang memiliki

Wu dan Ng (2007) melaporkan aktivitas aktivitas hipoglikemi dari buah pare sudah

antioksidan dan penangkap radikal poten dari diidentifikasi diantaranya: glikosida steroid

berbagai ekstrak buah pare, yang berkorelasi (karantin), p-insulin atau v-insulin) yang

dengan kandungan total flavonoidnya. Ekstrak memiliki aktivitas insulinomimetik dan

etanol dan air buah pare mengandung fenol dan alkaloid yang terkonsentrasi pada buah dari

flavonoid. Kedua senyawa ini dilaporkan tanaman (Kumar et al., 2010). Buah pare yang

memiliki aktivitas sebagai antioksidan dan diberikan dengan dosis 200mg/kg BB pada
tikus DM mampu memperbaiki dan
11
meregenerasi sel beta pankreas sehingga spuit oral, alat alat gelas, sentrifuge,
meningkatkan pelepasan insulin (Ayoub et al., spektrofotometer uv vis, mikroskop,sterling
2013). bedweel, mikropipet,alat untuk preparasi
Ekstrak buah pare juga dilaporkan jaringan dan lain-lain.
mempunyai efek khemoprotektif pada berbagai 2.2 Bahan
organ serta meningkatkan aktivitas berbagai Buah pare yang sudah dikeringkan, etanol
enzim antioksidan seperti superoxide 70%, aloksan, larutan saline, CMC 1%, EDTA,
dismutase (SOD), catalase (CAT) dan inhibitor protease, buffer fosfat, pereaksi untuk
glutathione peroxidase (GPx)(Semiz & Sen, uji GPX: xanthine (0,1 mmol),xanthine oxidase
2007), Selain itu juga teramati adanya ,BSA (50 mg), diethylenetriaminepentaacetic
penurunan kadar malondialdehid (MDA) pada acid (1 mmol), nitroblue tetrazolium (NBT, 25
plasma dan pankreas. Hal ini menunjukkan µmol), sodium carbonate (40 mmol, pH 10,2),
bahwa ekstrak air buah pare mampu menekan garam diNa-bathocuproine-disulphonic acid
stres oksidatif yang diinduksi diabetes melalui (250 µmol), CuCl2, glutathione 60 mmol, 0,1 ml
aktivitas antioksidan dan pengangkapan radikal glutathione reductase 30 unit/ml, 0.1 ml
bebas (Rezaeizadeh et al., 2011). Na2EDTA 15 mmol, 0,1 ml NADPH,H2O2.
penelitian yang mengkaji bagaimana A. Penyiapan simplisia dan serbuk buah
korelasi antara aktivitas antioksidan dan pare
perbaikan diameter sel islet beta pankreas Buah pare yang masih segar dibersihkan,
ekstrak etanol buah pare belum pernah dipotong kecil lalu dikeringkan dengan oven
dilaporkan, sehingga perlu dilakukan penelitian pada suhu 50 derajat celsius selama beberapa
untuk menganalisa bagaimana korelasi antara hari sampai buah pare kering. Simplisia kering
aktivitas antioksidan dalam mereduksi stres dihancurkan dengan mortir dan disaring dengan
oksidatif dengan profil perbaikan diameter sel kasa saringan ukuran mesh 40. Kemudian
islet beta pankreas ekstrak etanol buah pare dilakukan penetapan kadar air atau susut
pada tikus yang diinduksi DM. pengeringan yang dinyatakan sebagai
persentase (%).
2. METODE PENELITIAN B. Pembuatan ekstrak etanol buah pare

2.1 Alat Ditimbang 1000 gram serbuk kering buah

Alat yang akan digunakan dalam pare kemudian dimaserasi dengan 2,5 liter

penelitian ini adalah peralatan maserasi yang pelarut etanol 96% selama 24 jam dengan

terdiri dari botol maserasi, beaker glass, kain sesekali diaduk. Ekstrak etanol yang diperoleh

flanel, corong gelas, oven, timbangan listrik, kemudian diuapkan dengan evaporator

labu takar, batang pengaduk, alat bedah, lancet, bertekanan sampai diperoleh ekstrak kental.
12
Kadar ekstrak dinyatakan dalam % (g/g), berat ditandai hiperglikemi dan konsentrasi glukosa
ekstrak kental (g) dibagi dengan berat kering 200 mg/dl (T1).
simplisia (g). 2.3 Preparasi supernatan dan jaringan
C. Penyiapan hewan uji Tikus dianestesi dengan eter darah
Dua puluh lima ekor tikus jantan galur dikumpulkan dalam tabung EDTA melalui
Wistar (Rattus norvegicus) jantan umur 16 cardiac puncture. Pankreas diambil,
minggu berat antara 150-200 gram, dipelihara dibersihkan, dikeringkan dan diproses untuk uji
dengan kondisi kandang yang terjaga yaitu biokimia. Sebagian jaringan dipotong untuk uji
temperatur suhu 21 °C kelembapan 55% dan histopatologi, sisanya dihomogenkan dalam
diberi pakan standar berupa pellet dan air ad buffer posfat 50 mM (pH 7,4) yang
libitum. Setelah diadaptasi secara acak tikus mengandung inhibitor protease, 0,2 µM PMSF
dikelompokkan menjadi 5 kelompok Setelah dan 1 mM EDTA pada suhu 4 °C selama 30
diadaptasi secara acak tikus dikelompokkan detik (2¬15 detik dengan 15 detik interval
menjadi 3 kelompok, setiap kelompok terdiri pendinginan). Homogenat disaring dan filtrate
dari 6 ekor tikus dan akan mendapat perlakuan disentrifuse pada 1088 g (pada rmax 108 mm)
yang berbeda seperti terlihat pada tabel 2.1. selama 5 menit dalamkondisi dingin.
Supernatan yang dihasilkan digunakan untuk
Tabel 2.1. Kelompok perlakuan pengukuran aktivitas enzim antioksidan.
Kelompok
Perlakuan E. Pengukuran kadar MDA
hewan uji
I Normal + CMC 1% Preparasi sampel dari organ hati
II DM + CMC 1%
III DM + glibenklamid dilakukan mengikuti Singh et al. (2002).
IV DM + perlakuan ekstrak dosis 100 Sebanyak 0,5 ml supernatan hati ditambah 2,0
mg/kg bb
V DM + perlakuan ekstrak dosis 200 ml HCl dingin (0,25 N) yang mengandung 15
mg/kg bb
% TCA, 0,38 % TBA dan 0,5% BHT.

D. Induksi DM dengan aloksan Campuran dipanaskan 80⁰ C selama satu jam.

Semua kelompok ditimbang dan Setelah dingin, campuran disentrifuse pada

diadaptasi selama satu minggu, kemudian 3500 rpm selama 10 menit. Absorbansi

diukur kadar glukosa darah awal (T0). supernatan diukur pada 532 nm. Sebagai

Kelompok tikus DM (II-V) diinduksi dengan larutan standar digunakan tetratoksipropana

aloksan dosis 150 mg/kg BB dalam larutan (TEP).

saline 0,15 M secara intraperitoneal (Tripathi & F. Uji Histopatologi

Chandra, 2009). Setelah 4 hari injeksi aloksan, Sampel jaringan pankreas yang telah

tikus dipastikan telah mengalami DM dengan difiksasi dalam larutan Boin 10% digunakan
untuk pengujian mikroskopis berdasarkan
13
prosedur rutin laboratorium. Pengujian debu, jamur dan mencegah terjadinya
histopatologi dilakukan dengan pewarnaan perubahan enzimatis yang disebabkan sinar
hematoxiline, pada ketebalan 5-μm dengan matahari. Persentase hasil pengeringan buah
analisis morfometrik kemudian dihitung jumlah pare segar sebesar 6,66%.
sel islet tiap cm2 (Tatar et al., 2012). 3.1 Maserasi 1000 gram simplisa kering
menggunakan etanol 96% selama 24 jam
3. HASIL PENELITIAN menghasilkan ekstrak 74,35 gram berwarna

G. Penyiapan simplisia dan serbuk buah kuning kecoklatan dengan viskositas yang

pare tinggi (kental). Dari rendemen ekstrak dan

Buah pare yang digunakan dalam susut pengeringan dapat dihitung dosis

penelitian ini diperoleh dari pasar tradisional konversi pare jika digunakan pada manusia.

Kebon Roek, Ampenan Mataram. Jumlah Persen rendemen ekstrak 7,4.

sampel basah yang digunakan sebanyak 15 kg. 3.2 Identifikasi flavonoid

Buah pare segar banyak mengandung air, untuk Identifikasi flavonoid menggunakan rutin

mempercepat proses pengeringan dilakukan (kuersetin 3-rutinosida) sebagai pembanding

dengan memperkecil ukuran sampel dengan karena senyawa ini merupakan golongan

diparut. Semakin kecil ukuran sampel maka glikosida flavonol dan paling sering ditemukan

luas permukaan yang kontak dengan panas pada identifikasi flavonoid dalam tumbuhan

semakin besar sehingga memudahkan yang tersebar luas pada pigmen tumbuhan.

terjadinya penguapan air dan proses Pada pengamatan visibel seperti ditunjukkan

pengeringan menjadi lebih cepat. Proses pada Gambar 3.1, bercak terlihat berwarna

pengeringan menggunakan oven suhu 50⁰ kuning dengan deteksi sitroborat baik pada

dilakukan untuk menghindari terjadinya sampel maupun pembanding, hal ini

kontaminasi pada simplisia seperti kotoran, menunjukkan bahwa sampel mengandung

flavonoid.

UV 254 nm UV 366 nm Visibel

14
 p s p s p s

Gambar 3.1. Kromatogram identifikasi flavonoid ekstrak etanol buah pare dengan menggunakan fase gerak: asam
asetat: n-butanol:air (4:5:1), fase diam: Silica Gel 60 F254, Pembanding: rutin (P) sampel: ekstrak
etanol pare (S), deteksi: sitroborat

3.3 Hasil Perhitungan Rata-Rata Kadar Glukosa Darah

Tabel 3.1. Rata-rata kadar glukosa darah tikus

Rata –rata kadar glukosa darah (mg/dL)±SD

Hari ke- Hari ke- Hari ke- Hari ke- Hari ke- Hari ke-
Kelompok 0 (T0) 4(T1) 11(T2) 18(T3) 25(T4) 32(T5)
I 79,6±3,3 80,1±3,6 80,8±3,7 81,6±3,2 82,3±3,3 83,0±3,9
II 75,5±1,6 242,8±2,7 243,4±3,0 245,2±3,4 246,6±2,6 248,0±2,6
III 73,3±2,2 242,8±2,91 195,7±2,5 178,4±2,4 135,3±4,3 120,8±2,2
IV 74,3±2,2 248,7±2,8 215,7±2,8 198,5±10,0 190,8±2,2 168,±1,8
V 74,5±5,4 250,7±5,1 198,8±3,6 188,9±1,6 166,3±2,1 147,5±3,5
Keterangan:
I = kelompok Normal
II = kelompok Kontrol negatif
III = kelompok Kontrol positif
IV = kelompok Ekstrak etanol buah pare dosis 100 mg/kg BB
V = kelompok Ekstrak etanol buah pare dosis 200 mg/kg BB

3.4 Hasil Pengukuran Aktivitas Enzim MDA

Keterangan:
Kemampuan ekstrak etanol buah pare
I = Kelompok normal
meningkatkan aktivitas enzim antioksidan
II = Kelompok kontrol negatif
dievaluasi dengan mengukur kadar enzim III = Kelompok kontrol positif (glibenklamid)
MDA pada homogenat hati tikus yang telah IV = Kelompok ekstrak MC dosis 100 mg/kg BB
diberi perlakuan ekstrak selama 4 minggu. V = Kelompok ekstrak MC dosis200 mg/kg BB

Hasil pengukuran aktivitas MDA (Tabel 3.2).

3.5 Hasil Histopatologi Jaringan Pankreas
Tabel 3.2 Rata –rata hasil pengukuran aktivitas Aktivitas ekstrak etanol buah pare
enzim MDA pada hati tikus melindungi dan memperbaiki sel slet beta
Kelompok MDA (nmol/mg) pankreas yang rusak karena stres oksidatif
I 4,05
dievaluasi dengan mengukur diameter sel islet
II 14,8
III 12,22 beta pankreas. Sel islet beta pankreas yang
IV 7,77 rusak ditandai dengan terjadinya nekrosis pada
V 3,32
sel, hiposelularitas, densitas, kekompakan dan

15
diameter mengecil (Ayoub et al., 2013). Salah ukur dengan soft ware Optilab dari hasil foto
satu parameter yang digunakan pada penelitian jaringan pankreas. Berikut hasil uji
ini adalah ukuran diameter sel islet yang di histopatologi jaringan pankreas (Tabel 3.3).

Tabel 3.3 Hasil histopatologi jaringan sel islet beta pankreas pada tikus yang telah diberi
perlakuan selama 4 minggu, pengecetan Hematoxaline (100x)
Kelompok Hasil histopatologi jaringan pankreas tikus Keterangan
Normal Diameter sel islet
berkisar antara
100-200µm,
terdiri dari inti sel
(bintik hitam)
yang dihubungkan
dengan pembuluh
darah kapiler
(warna putih). Sel
beta sebagian
besar terdapat
pada bagian
sentral, sedangkan
sel alfa pada
perifer.
Kontrol Diameter sel islet
negatif pankreas
mengecil, terjadi
nekrosis pada sel
beta yang ditandai
dengan inti sel
pada sentral yang
tidak terlihat jelas.

16
 Kontrol Diameter sel islet
positif pankreas
membesar tetapi
inti sel tidak
terlalu jelas.

Dosis Diameter sel islet

ekstrak lebih besar dari
etanol pare kontrol negatif
100mg/kg dengan inti sel
BB sudah terlihat,
mulai terjadi
perbaikan

Dosis Diameter sel islet

ekstrak pankreas lebih
etanol pare besar dengan inti
200mg/kg sel yang terlihat
BB lebih jelas
kompak, tersebar
baik pada sentral
maupun perifer.

Tabel 3.4 Rata-rata diameter sel islet Keterangan:

Kelompo Diameter sel islet rata- I = Kelompok normal
Rata-rata
k rata(µm) II = Kelompok kontrol negatif
I 203,8 ± 60,1 196,3 ± 47,5 200,0 III = Kelompok kontrol positif (glibenklamid)
II 77,7 ± 16,5 89,2 ± 42,5 83,2*
IV = Kelompok ekstrak MC dosis 100 mg/kg BB
III 131,4 ± 56,3 157,3 ± 48,0 144,3
V = Kelompok ekstrak MC dosis200
IV 149,3 ± 37,8 130,0 ± 23,7 139,6*
V 219,7 ± 41,2 183,2 ± 66,5 201,4* mg/kg BB
* signifikan p<0,05 ekstrak dibandingkan dengan kontrol
negatif

17
4. PEMBAHASAN flavonoid (Rezaaezadeh et al., 2011). Hasil

Dari data hasil penelitian ini identifikasi secara kualitatif menunjukkan

glibenklamid menunjukkan aktivitas bahwa dalam ekstrak etanol buah pare

antihiperglikemi yang paling besar mulai dari mengandung flavonoid ditunjukkan pada

minggu pertama sampai minggu ke empat, gambar 3.1. Peningkatan aktivitas enzim

kemudian ekstrak etanol buah pare dosis 200 antioksidan dapat dikaitkan dengan kandungan

mg/kg BB dan dosis 100 mg/kg BB memiliki flavonoid yang terdapat pada buah pare. Peran

aktivitas yang paling rendah. Hal ini karena antioksidan pada DM dapat menekan apoptosis

glibenklamid merupakan senyawa murni yang sel beta yang diinduksi stres oksidatif tanpa

telah terbukti efektivitasnya dan berpotensi mengubah tingkat proliferasinya (Monroy &

menyebabkan hipoglikemi, sedangkan ekstrak Mejia, 2013). Antioksidan juga meningkatkan

etanol buah pare masih berupa ekstrak dengan ekspresi PDx-1 yang berpengaruh pada sel

banyak campuran senyawa kimia di dalamnya. HIT-15T pada sel islet beta sehingga

Efektifitas antihiperglikemi ekstrak meningkatkan proliferasi sel yang rusak

etanol buah pare juga dapat dilihat dari maupun yang normal. PDx-1 adalah faktor

penurunan kadar glukosa darah. Penurunan transkripsi gen spesifik pada sel beta yang

kadar glukosa diperoleh dari selisih kadar berperan penting memelihara fungsi normal sel

glukosa awal DM dengan kadar glukosa pada beta (Puddu et al., 2013).

hari pengukuran (T1-Tn). Kemampuan ekstrak Mengecilnya diameter sel islet langerhans

etanol buah pare menurunkan kadar glukosa pada kelompok II dipengaruhi tiga faktor,

darah dibandingkan dengan kontrol positif yang pertama yaitu rusaknya sel beta pankreas

karena sama-sama memiliki efek karena toksisitas aloksan sehingga sel

antihiperglikemi mengalami nekrosis dan hiposelularitas

Pada kelompok kontrol negatif, (Corrado et al., 2013) kedua karena

hiperglikemi kronis menginduksi terbentuknya hiperglikemia kronis menyebabkan stres

ROS secara non enzimatis melalui autooksidasi oksidatif yang tidak diimbangi dengan

glukosa menyebabkan terjadinya stres oksidatif peningkatan enzim SOD dan GPx sebagai

akibatnya akan menekan aktivitas enzim mekanisme pertahanan, ketiga karena produksi

antioksidan. Stres oksidatif pada kelompok ini ROS yang berlebihan akan menekan pankreas

ditandai dengan meningkatnya kadar MDA deudenal homeobox factor -1 (PDx-1) yaitu

seperti terlihat pada tabel 2. (Monroy & Mejia, gen pengkode trankripsi spesifik yang

2013). berfungsi menjaga fungsi normal sel islet

Senyawa yang diduga memiliki sehingga menghambat proliferasi sel islet yang

aktivitas antioksidan pada buah pare adalah normal maupun yang rusak (Kanneto, 1999).
18
Pada kontrol positif rata-rata diameter sel islet diameter sel islet akan mengecil karena
lebih besar dibanding kontrol negatif yaitu kerusakan pada membran sel (Erijuwa et al.,
148,2 µm. Hal ini akan meningkatkan jumlah 2010).
insulin yang dilepaskan dari sel islet beta
pankreas sehingga dapat menurunkan kadar 5. KESIMPULAN
glukosa Dari data hasil penelitian ini, maka buah
Pada kelompok ekstrak etanol buah pare pare sebagai obat tradisional DM terbukti
terlihat diameter sel islet bertambah besar secara ilmiah mempunyai aktivitas
sesuai dengan kenaikan dosis. Hasil uji statistik antihiperglikemia pada tikus yang diinduksi
dosis 200 mg/kg BB ekstrak etanol buah pare DM, dengan dosis 200mg/kg BB dapat
meningkatkan susunan sel islet beta dengan meningkatkan aktivitas enzim antioksidan
diameter yang lebih besar dibanding dengan sebagai mekanisme pertahanan yang bisa
kontrol negatif (p<0,05). Sedangkan dosis 100 melindungi dan memperbaiki sel islet beta
mg/kg BB pertambahan diameter sel islet pankreas yang rusak.
berbeda tidak bermakna dengan kelompok II
(p>0,05). Hasil ini sesuai dengan hasil
penelitian Ayoub et al. (2013) histologi DAFTAR PUSTAKA
susunan sel islet meningkat dengan Ayoub M et al., 2013, Evaluation of
peningkatan dosis, dosis 200 mg/kg BB hypoglycemic effect of Momordica
memperbaiki sel islet mulai dari hari ke-15 charantia L. extract in distilled water
sampai hari ke-45, terjadi peningkatan jumlah in Streptozotocin-Diabetic rats, Braz
dan kekompakan sel islet, seluralitas tinggi dan J Vet Pathol. 6(2):56 – 64.
jumlah insulin lebih besar dibanding dosis 100 Corrado, 2013, Optimization and
mg/kgBB. characterization of a bioartificial
Hasil uji korelasi diameter sel islet pancreas, Journal of undergraduated
dengan kadar MDA menunjukkan ada korelasi reasearch,14:3
yang berbanding terbalik dan tidak signifikan Erejuwa O et al., 2010, Antioxidant protective
p>0,05. Korelasi ini dikaitkan dengan kadar effect of Glibenclamide and
MDA sebagai tanda tingginya peroksidasi lipid, Metformin in combination with
menghasilkan hidroperoksida yang dapat honey in pancreas of Streptozotocin
mengubah fluiditas membran sel dan merusak induced Diabetic rats, Int. J. Mol.
membran sel dengan mengubah aktivitas enzim Sci. 11:2056-2066.
dan reseptor yang terikat pada membran
sehingga semakin besar kadar MDA maka
19
Kaneto H., 1999, Beneficial effects of aqueous extract from Momordica
antioxidants in diabetes, Diabetes. charantia fruit in a type II diabetic
2398-2405. rat model, J. of Medicinal Plants
Monroy ML., Mejia CF., 2013, Oxidative stress Research, Vol. 5(14), 2990-3001.
in Diabetes Mellitus and the role of Semiz A, Sen A., 2007, Antioxidant and
vitamins with antioxidant actions, chemoprotective properties of
Mexico Ntech, 9: 210-215).. Momordica charantia L. (bitter
Puddu A. et al., 2013, Update on the protective melon) fruit extract, African J. of
molecular pathways improving Biotechnology, Vol. 6 (3):273-277.
pancreatic beta-cell dysfunction. Wu S., Ng L., 2007, Antioxidant and free
Hindawi Publishing Corporation radical scavenging activities of wild
Mediators of Inflammation Volume. bitter melon (Momordica charantia
Rezaeizadeh A., Abdollahi M., Zuki Z., Goh Linn. var. abbreviata Ser.) in Taiwan,
MY., Noordin M., 2011, Antioxidant LWT, 41:323–330.
and antihyperglycaemic effects of an

20