MIKROBIOLOGI

I. JUDUL : PEMBUATAN NATA

II. TUJUAN
1. Mengetahui cara pembuatan nata dari berbagai substrat
2. Mengukur tebal nata pada berbagai macam substrat
3. Membandingkan tebal nata pada berbagai macam substrat

III. DASAR TEORI

Nata merupakan makanan pencuci mulut (desert). Nata adalah makanan yang
banyak mengandung serat, mengandung selulosa kadar tinggi yang bermanfaat bagi
kesehatan dalam membantupencernaan.

Kadungan kalori yang rendah pada Nata merupakan pertimbangan yang tepat
produk Nata sebagai makan diet. Dari segi penampilannya makanan ini memiliki nilai
estetika yang tinggi, penampilan warna putih agak bening, tekstur kenyal, aroma segar.
Dengan penampilan tersebut maka nata sebagai makanan desert memiliki daya tarik
yang tinggi. Dari segi ekonomi produksi nata menjanjikan nilai tambah. Pembuatan
nata yang diperkaya dengan vitamin dan mineral akan mempertinggi nilai gizi dari
produk ini.

Nata dibentuk oleh spesies bakteri asam asetat pada permukaan cairan yang
mengandung gula, sari buah, atau ekstrak tanaman lain. Beberapa spesies yang
termasuk bakteri asam asetat dapat membentuk selulosa, namun selama ini yang paling
banyak dipelajari adalah Acetobacter xylinum. Bakteri Acetobacter xylinum termasuk
genus Acetobacter. Bakteri Acetobacter xylinum bersifat Gram negatip, aerob,
berbentuk batang pendek atau kokus.

Pemanfaatan limbah pengolahan kelapa berupa air kelapa merupakan cara

mengoptimalkan pemanfaatan buah kelapa. Limbah air kelapa cukup baik digunakan
untuk substrat pembuatan Nata de Coco. Dalam air kelapa terdapat berbagai nutrisi
yang bisa dimanfaatkan bakteri penghasil Nata de Coco. Nutrisi yang terkandung
dalam air kelapa antara lain : gula sukrosa 1,28%, sumber mineral yang beragam antara
lain Mg2+ 3,54 gr/l, serta adanya faktor pendukung pertumbuhan (growth promoting
factor) merupakan senyawa yang mampu meningkatkan pertumbuhan bakteri
penghasil nata (Acetobacter xylinum).

Adanya gula sukrosa dalam air kelapa akan dimanfaatkan oleh Acetobacter
xylinum sebagai sumber energi, maupun sumber karbon untuk membentuk senyawa
metabolit diantaranya adalah selulosa yang membentuk Nata. Senyawa peningkat
pertumbuhan mikroba (growth promoting factor) akan meningkatkan pertumbuhan
mikroba, sedangkan adanya mineral dalam substrat akan membantu meningkatkan
aktifitas enzim kinase dalam metabolisme di dalam sel Acetobacter xylinum untuk
menghasilkan selulosa.

Pemeliharaan Kultur Murni Acetobacter xylinum

Biakan atau kultur murni Acetobacter xylinum yang diperoleh ditumbuhkan

pada media Hassid Barker. Koleksi kultur dapat dalam bentuk kering beku dalam
ampul, maupun dalam bentuk goresan dalam agar miring (slant agar). Koleksi kultur
dalam bentuk kering beku dalam ampul dapat bertahan hidup bertahun-tahun tanpa
peremajaan. Sedangkan koleksi kultur dalam agar miring perlu peremajaan setiap 2-3
bulan. Kebanyakan koleksi kultur pemeliharaannya dengan cara peremajaan dilakukan
pada media agar miring.

Pemeliharaan koleksi kultur yang dimiliki dapat dilakukan dengan cara:

pembuatan media Hassid Barker Agar (HBA) dalam tabung reaksi dan peremajaan
kultur setiap 2-3 bulan. Komposisi media HBA adalah sebagai berikut: sukrosa 10%,
(NH4)2SO4 0,6 g/L, K2HPO4 5,0 g/L, ekstrak khamir 2,5 g/L 2 % asam asetat glasial,
agar difco 15 g/L . Media HBA dimasukkan kedalam tabung reaksi dan disterilkan
dalam autoclave 121 oC, 2 atm, selama 15 menit. Media dalam tabung reaksi masih
panas diletakkan mring hingga membeku untuk menghasilkan media agar miring.
Peremajaan dapat dilakukan dengan cara menggoreskan 1 ose kultur kedalam media
agar miring yang telah dipersiapkan. Kutur baru diinkubasi pada suhu kamar, selama
2-3 hari. Kultur akan tumbuh pada media HBA miring dengan bentuk sesuai alur
goresan. Kultur yang terlah diremajakan siap untuk kultur kerja, dan sebagian disimpan
untuk kultur simpan atau kultur stok (Stock Culture).

Penyiapan Starter

Starter adalah bibit Acetobacter xylinum yang telah ditumbuhkan dalam

substrat pertumbuhan kultur tersebut sehingga populasi bakteri Acetobacter xylinum
mencapai karapatan optimal untuk proses pembuatan nata, yaitu 1 x 109 sel/ml.
Biasanya kerapatan ini akan dicapai pada pertumbuhan kultur tersebut dalam susbtrat
selama 48 jam (2 hari).

Penyiapan starter adalah sebagai berikut: substrat disterilkan dengan

outoclave atau dengan cara didihkan selama 15 menit. Setelah dingin kira-kira suhu 40
oC, sebanyak 300 ml dimasukkan ke dalam botol steril volume 500 ml. Substrat dalam
botol steril diinokulasi (ditanami bibit bakteri Acetobacter xylinum) sebanyak 2 ose
(kira-kira 2 pentol korek api), bibit Acetobacter xylinum. Substrat digojog, sebaiknya
menggunakan shaker dengan kecepatan 140 rpm ( secara manual digojog setiap 2-4
jam ). Starter ditumbuhkan selama 2 hari, pada suhu kamar.

Fermentasi

Fermentasi adalah suatu proses pengubahan senyawa yang terkandung di

dalam substrat oleh mikroba (kulture) misalkan senyawa gula menjadi bentuk lain
(misalkan selulosa / Nata ), baik merupakan proses pemecahan maupun proses
pembentukan dalam situasi aerob maupun anaerob. Jadi proses fermentasi bisa terjadi
proses katabolisme maupun proses anabolisme.

Fermentasi substrat air kelapa yang telah dipersiapkan sebelumnya

prosesnya sebagai berikut; substrat air kelapa disterilkan dengan menggunakan
outoclave atau dengan cara didihkan selama 15 menit. Substrat didinginkan hingga
suhu 40oC. Substrat dimasukkan pada nampan atau baskom steril dengan permukaan
yang lebar, dengan kedalaman substrat kira-kira 5 cm. Substrat diinokulasi dengan
menggunakan starter atau bibit sebanyak 10 % (v/v). Substrat kemudian diaduk rata,
ditutup dengan menggunakan kain kasa. Nampan diinkubasi atau diperam dengan cara
diletakan pada tempat yang bersih, terhindar dari debu, ditutup dengan menggunakan
kain bersih untuk menghindari terjadinya kontaminasi. Inkubasi dilakukan selama 10
– 15 hari, pada suhu kamar. Pada tahap fermentasi ini tidak boleh digojok. Pada umur
10-15 hari nata dapat dipanen.

IV. ALAT DAN BAHAN

A. Alat B. Bahan

1. Kompor 1. Gula pasir

2. Panic + tutup 2. Urea
3. Pengaduk 3. Substrat buah
4. Toples + tutup 4. Air
5. Saringan 5. Karet gelang
6. Wadah 6. Kertas label
7. Blender 7. Asam cuka
8. Pisau 8. Ekstrak tauge
9. Gelas ukur
10. Selotipe besar
V. Cara Kerja
1. Substrat buah masing-masing bahan dikupas, dibersihkan, dipotong-potong dan
dimasukkan dalam blender lalu dihaluskan kemudian ditambahkan sedikit air agar cepat
halus.
2. Substrat disaring sehingga diperoleh substrat yang tidak berampas.
3. Substrat masing-masing bahan diambil 500 ml dimasukkan ke dalam panci kemudian
direbus dan ditambahkan 50 gr gula pasir 50 ml sari tauge.
4. Substrat yang telah mendidih dituang dalam wadah.
5. Setelah dingin ditambahkan cuka 15 ml dan ditambahkan 50 ml Acetobacter xilinum sambil
diaduk-aduk.
6. Memasukkan campuran tersebut ke dalam toples dan ditutup rapat dengan penutup dan
selotip.
7. Disimpan + 1 bulan pada suhu 20-25◦C.
8. Setelah 1 bulan diamati dan diukur tebal nata yang terbentuk
 MIKROBIOLOGI

I. JUDUL : HIDROLISIS PATI DAN SKIM

II. TUJUAN

1. Mengetahui indeks amilolitik pada media agar + pati dan indeks proteolitik pada media agar
+ skim Bacillus sp dan E. coli

2. Membandingkan kemampuan Bacillus sp dan E. coli dalam menghidrolisis pati dan skim

3. Membuktikan bahwa bakteri mampu menghidrolisis pati dan skim

III. DASAR TEORI

Dalam kehidupan, jasad diperlukan dalam bahan kimia organic, dan anorganik dimana
bahan tersebut digunakan sel unit kegiatan metabolisme. Faktor pertumbuhan adalah senyawa
organic yang diperlukan dalam pertumbuhan yang dapat disintesis sendiri yang diperlukan dalam
jumlah yang sedikit dan tidak dapat masuk ke dalam sel melalui membran sehingga polimer
tersebut harus diperoleh secara sederhana. Proses tersebut dinamakan hidrolisis dan memerlukan
co-enzym seperti a. Pati (amylase), b. Lignin (ligase), c. Protein (protease), d. Lipid (lipase) (Volk
dan Wellew. 1993: 113).

Ratna (1990: 20) menyatakan bahwa bakteri biasanya memperoleh energy dari oksidasi
kimia. Sebagian besar bakteri memperoleh bahan-bahan karbon, nitrogen, ion organic, dan lain-
lain berasal dari bahan anorganik yang kemudian dirombaknya dan digunakan seperlunya.
Peristiwa ini melalui 3 tahapan:

a. Perombakan bahan yang mengandung protein, karbohidrat dan lipid

b. Penyerapan bentuk material tersebut yang secara sederhana

c. Sintesis protein, karbohidrat dan lipid dalam sel

Substansi penghambat pertumbuhan ada yang merupakan bahan asli atau dapat pula
ditambahkan substansi asli yang dikandung bahan makanan, antaraa lain lachinin dan susu mentah
lysesin pada putih telur dan bakteri yang mampu merusak bahan makanan dengan cara
mengeluarkan enzim-enzim yang dimiliki jasad renik.

Penambahan substansi asli yang terkandung pada bahan makanan mengakibatkan

terbentuknya zona bening dan zona koloni sehingga indeks amilolitik dan indeks proteolitik dapat
diketahui dengan rumus :

𝑫𝒊𝒂𝒎𝒆𝒕𝒆𝒓 𝒛𝒐𝒏𝒂 𝒃𝒆𝒏𝒊𝒏𝒈

𝑰𝒏𝒅𝒆𝒌𝒔 𝑨𝒎𝒊𝒍𝒐𝒍𝒊𝒕𝒊𝒌 (𝑰𝑨) =
𝑫𝒊𝒂𝒎𝒆𝒕𝒆𝒓 𝒛𝒐𝒏𝒂 𝒌𝒐𝒍𝒐𝒏𝒊

𝑫𝒊𝒂𝒎𝒆𝒕𝒆𝒓 𝒛𝒐𝒏𝒂 𝒃𝒆𝒏𝒊𝒏𝒈

𝑰𝒏𝒅𝒆𝒌𝒔 𝑷𝒓𝒐𝒕𝒆𝒐𝒍𝒊𝒕𝒊𝒌 (𝑰𝑷) =
𝑫𝒊𝒂𝒎𝒆𝒕𝒆𝒓 𝒛𝒐𝒏𝒂 𝒌𝒐𝒍𝒐𝒏𝒊
Hidrolisis adalah proses penguraian molekul dengan penambahan air. Beberapa
mikroorganisme dapat menyesuaikan diri dengan lingkungannya yang kaya akan molekul
kompleks dengan cara mensekresikan enzim yang disebut co-enzim.
a. Hidrolisis Pati
Salah satu polisakarida yang dapat dihidrolisis oleh mikroorganismne adalah
pati.Hidrolisis pati memiliki hasil akhir berupa dekstrin. Terjadinya hidrolisis pati disebabkan oleh
adanya enzim amylase pada mikroorganisme. Akan tetapi, tidak semua mikroorganisme memiliki
amylase. Dengan demikian, hidrolisis ini dapat sebagai karakteristik dan dapat dipakai dlam
identifikasi (Slamet. 2000: 15)
Ratna (1999: 143) menambahkan bahwa larutan iodine garam adalah indicator pati. Bila
medium yang yang mengandung patidiberi larutan iodine, maka tempet-tempat yang
mengandungpati akan terlihat jernih.
b. Hidrolisis Kasein (Protein)
Kasein adalah protein pokok pada suatu susu yang merupakan suspense koloid yang
menyebabkan susu terlihat putih mengkilap.
Hans(1999:20) menambahkan bahwa pengukuran terhadap garis tengah, lebar akan
diperoleh volume. Volume atau berat jenis jasad renik digunakan dalam proses industry. Selain itu
jasad renik tadi dipakai pula untuk medianya.
IV. ALAT DAN BAHAN
1. ALAT
No Nama Jumlah

1. Cawan petri 4 buah

2. Bunsen 1 buah

3. Jarum Ose 1 buah

4. Penggaris 1 buah

5. Spidol 1 buah

2. BAHAN
No Nama Jumlah

1. Media NA+ Pati 2 buah

2. Media NA+Skim 2 buah

3. Biakan Bakteri E. coli 1 buah

4. Biakan Bakteri Bacillus sp 1 buah

5. Alkohol secukupnya

6. Kertas Label secukupnya

7. Korek api secukupnya

8. Kertas buram 4 buah

V. CARA KERJA
1. Menyiapkan alat dan bahan yang akan digunakan
2. Menyemprotkan alcohol 70% pada tangan praktikan dan meja praktikum agar berada dalam
kondisi steril.
3. Menyalakan api Bunsen dan menjaga kondisi ruangan.
4. Mengambil cawan petri yang berisi media dan membaginya menjadi 4 kuadran
5. Melakukan inokulasi bakteri biakan di setiap kuadran dengan metode titik dengan benar dan
steril.
5. Membungkus cawan petri dengan kertas buram dengan posisi terbalik.
6. Menyimpan petri di ruangan yang steril pada suhu ruang.
7. Setelah 2 hari, melihat perkembangannya dan dihitung diameter zona bening dan zona koloni
bakteri pada tiap kuadran untuk mendapatkan indeks proteolitik dan amilolitik selama 3 hari
berturut-turut.
8. Mencatat dalam data pengamatan.
 LAPORAN RESMI PRAKTIKUM

MIKROBIOLOGI

I. JUDUL : PEWARNAAN PADA SEL BAKTERI

II. TUJUAN
Untuk mengamati morfologi bakteri melalui pewarnaan sederhana dan pewarnaan gram.

III. DASAR TEORI

Bakteri merupakan organism yang sangat kecil (berukuran mikroskopis). Bakteri rata-rata
berukuran lebar 0,5-1 mikron dan panjang hingga 10 mikron (1 mikron = 10-3). Hal ini berarti
bahwa jasad renik sangat tipis sehingga dapat tembus cahaya. Akibatnya pada mikroskop tidak
tampak jelas dan sukar untuk melihat bagian-bagiannya. Untuk melihat bakteri dengan jelas,
permukaan selnya perlu diisi dengan warna, pewarnaan ini disebut dengan pewarnaan bakteri.

Pewarnaan bakteri sudah dilakukan sejak permulaan berkembangnya mikrobiologi di

pertengahan abad ke-19 oleh Louis Pasteur dan Robert Koch. Terdapat dua macam zat warna yang
sering dipakai, yaitu:

1. Zat warna yang bersifat asam; komponen warnanya adalah anion, biasanya dalam bentuk
garam natrium.
2. Zat warna yang bersifat alkalis; dengan komponen warna kation, biasanya dalam bentuk
klorida.
Untuk mendapatkan hasil pengewarnaan yang lebih baik, tidak jarang diperlukan bahan
penolong, yang biasanya disebut pemantek (mordant). Bahan yang sering digunakan sebagai
pemantek diantaranya: ammonium oksalat, fenol, asam tanat, garam alumunium, besi, timah,
krom, dll.

Pewarnaan Sederhana

Tujuan pengewarnaan ini adalah untuk membedakan bakteri dari benda-benda mati lain yang
bukan bakteri dan untuk melihat bentuk dan ukurannya. Larutan warna hanya terdiri dari satu
bahan warna yang dilarutkan dalam suatu pelarut. Bahan yang banyak dipakai untuk keperluan ini
adalah karbol fuksin, Kristal violet dan methylen Blue.
Pengewarnaan diferensial

Untuk pewarnaan ini digunakan lebih dari satu macam bahan warna. Dengan cara ini bahan-
bahan warna yang dipakai ada kalanya terpisah atau tercampur dan digunakan dalam satu larutan.
Dua macam pengecatan yang terpenting dari golongan ini adalah pewarnaan gram dan pewarnaan
tahan asam.

Pewarnaan Gram

Pewarnaan gram pertama kali dikemukakan oleh Christian Gram (1884). Dengan
pewarnaan ini goresan tipis bakteri mula-mula dilapisi dengan larutan zat warna karbol
gentinviolet (karbol kristal violet, karbol metal violet) dan didiamkan beberapa saat, kemudian
disiram dengan larutan iodium dan dibiarkan terendam dalam waktu yang agak lama. Sampai
tingkat pewarnaan ini selesai, semua sel bakteri akan berwarna ungu.

Selajutnya preparat didekolorisasi dengan alcohol atau campuran alcohol atau aseton sampai
semua zat warna tampak launtur dari film bakteri. Setelah dicuci dengan air, preparat diberi warna
kontras (counterstain) seperti safranin atau karbolfuksin encer, air fuksin, atau pironin B.

Diantara bermacam-macam bakteri yang diwarnai, ada yang dapat menahan warna ungu
(metil violet, Kristal violet, gentian violet) dalam selnya meskipun telah didekolorisasi dengan
alcohol atau aseton. Bakteri yang memberi reaksi demikian dinamakan Bakteri Gram Positif.
Sebaliknya bakteri yang tidak dapat menahan zat warna setelah didekolorisasi dengan alcohol akan
kembali menjadi tidak berwarna dan bila diberikan pengecatan dengan dengan zat warna kontras
akan berwarna sesuai dengan zat warna kontras. Bakteri yang memperlihatkan reaksi semacam ini
dinamakan bakteri gram negatif. Atas dasar pewarnaan Gram ini dunia bakteri dibagi dalam dua
golongan besar, yaitu bakteri gram posistif dan bakteri gram negatif (Koes Irianto, 2006).
VI. ALAT DAN BAHAN

Pewarnaan Sederhana
Alat Jumlah Bahan Jumlah

1. Object Glass 1 buah 1. Sampel bakteri Secukupnya

2. Ose 1 buah 2. Methylene Blue Secukupnya
3. Bunsen 1 buah 3. Kapas Secukupnya
4. Korek api 4. Air
1 buah Secukupnya
5. Spidol Marker 5. spirtus
6. Rak pengecatan 1 buah Secukupnya
1 buah Secukupnya

Pewarnaan Gram
Alat Jumlah Bahan Jumlah

1. Object Glass 1 buah 1. Sampel bakteri Secukupnya

2. Ose 1 buah 2. Larutan Gentian Secukupnya
3. Bunsen 1 buah Violet Secukupnya
4. Korek api 3. Larutan iodium
1 buah Secukupnya
5. Spidol Marker 4. Alkohol
6. Rak pengecatan 1 buah 5. Safranin Secukupnya
1 buah 6. Kapas Secukupnya
7. Air Secukupnya
8. spirtus Secukupnya
Secukupnya

V. CARA KERJA
a. Pembuatan Preparat
1. Kaca objek (object glass) dibersihkan, sehingga bebas lemak.
2. Pada bagian ujung kaca objek diberi tanda, sebaiknya di sebelah permukaan yang tidak
dicat.
3. Dengan ose dibuat goresan tipis dari biakan bakteri pada permukaan yang telah
dibersihkan.
4. Goresan dikeringkan di udara atau dengan hawa hangat dari api gas.
5. Fiksasi dilakukan dengan cara menyentuhkan permukaan kaca objek tiga kali berturu-
turut pada ujung api Bunsen.
6. Setelah didinginkan preparat sudah siap untuk dicat.
b. Pewarnaan preparat
1. Pewarnaan Sederhana
 Genangi preparat yang sudah jadi dengan larutan zat warna (methylene blue) selama 5
menit
 Cuci dengan air mengalir, keringkan
 Periksa dibawah mikroskop

2. Pewarnaan Gram
 Genangi preparat yang sudah jadi dengan larutan zat warna gentian violet selama 2-5
menit
 Buang sisa cat
 Genangi preparat dengan dengan larutan iodium selama 30 detik sampai 1 menit
 Buang sisa cat
 Decolorisasi preparat dengan alkohol atau aseton sampai warna ungu pada preparat
memudar
 Cuci dengan air mengalir
 Genangi preparat dengan larutan safranin selama 2-5 menit
 Cuci dengan air mengalir, keringkan
 Amati di bawah mikroskop