BAB IV

METODE PENELITIAN

4.1 Jenis Penelitian

Jenis penelitian ini menggunakan penelitian laboratorium dengan

menggunakan rancangan post test only group design.

KI PI AI

PII Analisa
KII BII
Hasil

KIII PIII CIII

KIV PIV DIII

Keterangan:

S : Sampel

KI : Kontrol I, sel osteoblas dalam chitosan-collagen-carbonate apatite scaffold

pengamatan pada hari ke-3.

KII : Kontrol II, sel osteoblas dalam chitosan-collagen-carbonate apatite scaffold

pengamatan pada hari ke-5

KIII : Kontrol III, sel osteoblas dalam chitosan-collagen-carbonate apatite

scaffold, pengamatan pada hari ke-7

Kiv : Kontrol IV, sel osteoblas dalam chitosan-collagen-carbonate apatite

scaffold, pengamatan pada hari ke-14

1
PI : Perlakuan I, sel osteoblas dalam chitosan-collagen-carbonate apatite scaffold

dengan induksi ALP pengamatan pada hari ke-3

PII : Perlakuan II, sel osteoblas dalam chitosan-collagen-carbonate apatite

scaffold dengan induksi ALP pengamatan pada hari ke-5

PIII : Perlakuan III, sel osteoblas dalam chitosan-collagen-carbonate apatite

scaffold dengan induksi ALP pengamatan pada hari ke-7

PIV : Perlakuan IV, sel osteoblas dalam chitosan-collagen carbonate apatite

scaffold dengan induksi ALP pengamatan pada hari ke-14

AI : Peningkatan sel osteoblas pada PI pengamatan hari ke-3

BII : Peningkatan sel osteoblas pada PII pengamatan hari ke-5

CIII : Peningkatan sel osteoblas pada PIII pengamatan hari ke-7

DIV : Peningkatan sel osteoblas pada PIV pengamatan hari ke-14

4.2 Sampel/Subyek Penelitian

Cara pengambilan subyek penelitian dengan jumlah replikasi ditentukan

dengan perhitungan jenis data yang dikomparasikan adalah data kontinyu dengan

kelompok lebih dari 2, maka besar sampel/subyek penelitian dalam penelitian ini

ditentukan menggunakan rumus (Pudjiraharjo dkk, 1993):

r = 2α2 (Z1-α + Z1-β)2

(μ1 – μ2)2

r = 2(1,37)2 (1,64 + 1,82)2

(28 – 25,87)2

= 31,62 = 6,98 =7

2
 4,58

Keterangan :

 : Standar deviasi control

Z1-α : Nilai distribusi normal baku (table Z = 1,64) pada  = 0,05

Z1-β : Nilai distribusi normal baku (table Z = 1,82) pada  = 0,10

1 : Rata-rata perlakuan 1

2 : Rata-rata perlakuan 2

r : Jumlah replikasi

Berdasarka perhitungan rumus diatas, maka didapatkan jumlah sampel

minimal adalah 7.

4.3 Variabel Penelitian

a. Variabel Terikat

Jumlah sel osteoblas dalam chitosan-collagen-carbonate apatite scaffold yang

diinduksi alkaline phosphatase (ALP).

b. Variabel Terkontrol

a. Jenis chitosan-collagen-carbonate apatite scaffold

b. Media kultur sel osteoblas

c. Variabel Bebas

Waktu pengamatan peningkatan sel osteoblas yang diinduksi alkaline

phosphatase (ALP) pada hari ke-3, 5, 7, dan 14.

4.4 Definisi Operasional variabel

3
 a. Chitosan adalah polisakarida amino (poli-1,4-D-glukosamin) yang berasal dari

kitin yang telah dilakukan deasitilasi yang didapatkan dari cangkang kepiting.

b. Collagen adalah komponen organik yang terdapat pada matriks tulang yang

memiliki sifat yang biokompatibel, biodegradable, dan dapat menstimulasi

proliferasi dan diferensiasi sel sebagai matriks ekstraseluler.

c. Carbonate apatite adalah komponen mineral utama jaringan keras gigi dan

tulang manusia yang memiliki sifat biokompatibel untuk tujuan medis pada

rekayasa jaringan tulang.

d. Sel osteoblas merupakan sel yang berasal dari mesenchymal stem cell yang

immature berbentuk kuboid mononukleat yang pada penelitian ini digunakan

primary cell culture yang berasal dari jaringan yang diekstrak dan diproses

langsung dalam keadaan kultur dengan pewarnaan HE yang akan dihitung

jumlahnya dengan MTT Assay.

e. Alkaline phosphatase (ALP) adalah penanda proses pembentukan tulang dan

enzim sel osteoblas yang membantu proses kalsium terdeposit pada jaringan

tulang.

f. MTT Assay adalah uji yang digunakan untuk menghitung peningkatan sel.

MTT Assay yang digunakan adalah MTT Assay cell counting Kit-8.

g. Waktu pengamatan peningkatan sel osteoblas akibat induksi ALP pada hari ke-

3, 5, 7, dan 14.

4.5 Lokasi dan Waktu Penelitian

4
 a. Pembuatan chitosan-collagen-carbonate apatite scaffold dilakukan di Bank

Jaringan yang berlokasi di Surabaya.

b. Pembuatan kultur sel osteoblas dilakukan di Departemen Biomedik Fakultas

Kedokteran Universitas Brawijaya Malang.

c. Perlakuan penelitian dilakukan di Departemen Biokimia Fakuktas Kedokteran

Universitas Brawijaya Malang.

d. Waktu penelitian: Mei-Oktober 2018

4.6 Alat dan Bahan

4.6.1 Alat Penelitian

a. Beaker glass

b. Pengaduk motor

c. Neraca analitis

d. Gelas ukur

e. Pengaduk kaca

f. Instrumen operasi untuk membedah dan memotong tulang, forceps, gunting

dan scalpel

g. 25- dan 27- gauge needles dan syringes

h. Sterile laminar flow hood

i. Centrifudge

j. 6-well cawan petri (non perlakuan TC)

k. 100 mm cawan petri (non perlakuan TC)

l. Shaker dalam inkubator

5
 m. Homogenizer jaringan (Medimachine (BD Biosciences, San Jose, CA)

dengan stainless steel mincing screen dengan pori-pori berukuran 50 𝜇m)

n. 1 mL syringes

o. Kolagen coated TC treated plates untuk plating sel

4.6.2 Bahan Penelitian

a. Chitosan

b. Collagen

c. Carbonate apatite

d. Alkaline phosphatase (ALP)

e. Asam asetat 0,1 M

f. NaOH 0,1 M

g. Aquades

h. 100% ethanol

i. 70% ethanol

j. Hank’s balanced salt solution (HBSS), kalsium dan magnesium

k. α-minimal essential medium (α-MEM)

l. Heat-inactivated fetal bovine serum (FBS)

m. Penicillin dan streptomycin stock solution (penisilin 10.000 IU/ml dan

streptomisin 10.000 𝜇g/mL)

n. Gentamycin

4.7 Prosedur Penelitian

4.7.1 Pembuatan kultur sel osteoblas (Bakker dan Klein-Nulend, 2012)

6
a. Dua tikus diberikan anestesi (umurnya lebih muda dari 8 minggu) dan tikus

dieuthanasi dengan cervical dislocation. Tikus ditempatkan ke sisi ventral

ventilator kerja dan kepala tikus dibersihkan menggunakan etanol 70%. Lalu

dipilihlah tulang calvaria.

b. Tulang calvaria diletakan ke dalam cawan petri dengan PBS dan jaringan lunak

dipisahkan dari tulang. Jaringan-jaringan dilepaskan dan tulang yang tersisa

dipotong menjadi fragmen kecil 1-2 mm2.

c. Dissociation solution: 12 ml DMEM (mengandung Ca++ ≥ 2 mM) dipersiapkan

dengan konsentrasi akhir 2,7 Unit / ml COLG (Pz Grassmann dari Larutan A)

+ 11,8 Unit / ml COL H (Pz Grassmann dari Larutan B).

d. Potongan tulang diinkubasi selama 30 menit dengan 4 ml dissociation solution

di shaking waterbath pada suhu 37 ° C.

e. Potongan tulang dipindahkan dan dicuci menggunakan 4 ml dissociation

solution, selama 30 menit digestion.

f. Potongan tulang dipindahkan dan dicuci menggunakan 4 ml trypsin (5 mg/ml

in PBS + EDTA 0.2 g/ml). Dan dinkubasi selama 30 menit.

g. Potongan tulang dicuci lagi dengan 4 ml dissociation solution selama 30 menit.

h. Fragmen-fragmen tulang dicuci selama 3 kali dengan DMEM+ 10% FBS dan

bagian-bagian dari tulang dipindahkan pada dish bersih dengan 4 ml dari

complete DMEM dengan ascorbic acid (100 µg/ml).

i. Larutan diaduk sesekali untuk memastikan bahwa potongan-potongan tulang

terdistribusi merata di bagian bawah culture flask. Sel tulang akan mulai

bermigrasi dari potongan tulang setelah 3-5 hari.

7
 j. Setelah sel diinkubasi 11-15 hari dengan larutan trypsin pada suhu 37℃ selama

10 menit, kemudian larutan trypsin dipisahkan dari sel-sel dengan

menggunakan pipet kecil dan potongan tulang dibuang.

k. Sel tulang ditaruh di dalam 24-well plate dan kultur selama 7-10 hari

4.7.2 Pembuatan chitosan-collagen-carbonate apatite scaffold (Kartikasari et al,

2016)

a. Sebanyak 150 mg collagen dilarutkan dalam 3,6 ml asam asetat (CH3COOH)

2% dan diaduk menggunakan magnetic stirrer.

b. 700 mg carbonate apatite dilarutkan dengan 2 ml aquades dan dibiarkan sampai

mengendap. Endapan CA lalu dicampurkan dengan larutan collagen dan

ditambahkan 150 mg chitosan.

c. Larutan kemudian ditambahkan 0,8 ml NaOH 10% sebagai penetral.

d. Gel chitosan-collagen-carbonate apatite diletakkan pada teflon molds dan

dibekukan selama 24 jam pada suhu -80°C.

e. Kemudian freeze-drying dilakukan selama 2x24 jam dan dihasilkan chitosan-

collagen-carbonate apatite scaffold.

4.7.3 Seeding cell osteoblas pada chitosan-collagen-carbonate apatite scaffold

a. Sel osteoblas sebanyak 2 x 106 ditanam pada chitosan-collagen-carbonate

apatite scaffold (sampel).

b. Chitosan-collagen-carbonate apatite scaffold diinduksi alkaline phosphatase

(ALP) sebanyak 20 μL menggunakan pipet.

c. Sampel diinkubasi dalam inkubator selama 3, 5, dan 7 hari.

8
 d. Dilakukan pemeriksaan menggunakan MTT Assay pada hari ke-3, 5, 7, dan

14.

4.8 Analisis Data

Uji normalitas data dilakukan dengan One-simple Kolmogrov-Smirnov Test,

kemudian dilakukan uji homogenitas dengan menggunakan Levene test. Setelah

didapatkan hasil yang homogeny kemudian hasil dianalisis dengan menggunakan uji

statistic Oneway ANOVA. Lalu dilanjutkan dengan uji Post Hoc Tukey antara kelompok

perlakuan waktu pengamatan hari ke-3,5,7, dan 14.

9
 4.9 Alur Penelitian

Pembuatan chitosan-collagen-
Persiapan kultur sel osteoblas
carbonate apatite scaffold

Kontrol: Perlakuan:
Penanaman sel osteoblas 2 Penanaman sel osteoblas 2
x 106 dalam chitosan- x 106 dalam chitosan-
collagen-carbonate apatite collagen-carbonate apatite
scaffold scaffold + 20 μL ALP

7 sampel 7 sampel 7 sampel 7 sampel 7 sampel 7 sampel 7 sampel 7 sampel

KI KII KIII KIV PI PII PIII PIV

Inkubasi

Pemeriksaan 14 Pemeriksaan 14 Pemeriksaan 14 Pemeriksaan 14

sampel pada hari sampel pada hari sampel pada hari sampel pada hari
ke-3 ke-5 ke-7 ke-14

Pengamatan peningkatan jumlah sel osteoblas menggunakan MTT

Assay

Analisis statistik menggunakan

uji ANOVA

10
11