KATA PENGANTAR

Puji syukur kami ucapkan kepada Allah SWT bahwa karena-Nya penyusunan
makalah laporan praktikum kimia IIIA ini dilancarkan hingga selesai. Makalah
berikut berjudul ‘Isolasi, Penentuan Kadar Protein, dan Uji Aktivitas Enzim
Protease dari Getah Pepaya (Cariya papaya)’.

Ucapan terima kasih penulis ucapkan kepada asisten praktikum dan teman-teman
yang telah banyak membantu sehingga laporan praktikum ini dapat terselesaikan.
Kami menyadari masih banyak kekurangan dalam makalah berikut maka kritik dan
saran pembaca sangat dibutuhkan dalam makalah ini. Semoga makalah yang kami
susun ini dapat memberikan banyak manfaat serta menambah pengetahuan terutama
dalam hal isolasi, penentuan kadar protein dan penentuan aktivitas enzim protease.

Jatinangor, November 2019

Penyusun

1
 DAFTAR ISI

KATA PENGANTAR .................................................................................................. 1

BAB I ............................................................................................................................ 5

PENDAHULUAN ........................................................................................................ 5

1.1. Latar Belakang ............................................................................................... 5

1.2. Identifikasi Masalah ....................................................................................... 6

1.3. Tujuan Pecobaan ............................................................................................ 6

1.4. Manfaat Pecobaan .......................................................................................... 7

1.5. Metodologi Percobaan .................................................................................... 7

1.6. Waktu dan Tempat Percobaan ........................................................................ 7

BAB II ........................................................................................................................... 8

TINJAUAN PUSTAKA ............................................................................................... 8

2.1. Teori Dasar ..................................................................................................... 8

BAB III ....................................................................................................................... 13

BAHAN DAN METODE PERCOBAAN .................................................................. 13

3.1 . Alat ............................................................................................................. 13

3.2 . Bahan .......................................................................................................... 13

3.2.1 Bahan Praktikum......................................................................................... 13

3.2.2 Bahan Kimia ............................................................................................... 13

3.3. Metode Penelitian ......................................................................................... 13

3.3.1 Isolasi Enzim Protease ................................................................................ 13

3.3.2 Pemurnian Enzim dengan Kromatografi Kolom Filtrasi Gel ..................... 14

2
 3.3.3 Penentuan Aktivitas Enzim ......................................................................... 14

3.3.4 Pembuatan Kurva Baku .............................................................................. 15

3.3.5 Penentuan Kadar Protein Sampel ............................................................... 15

3.4. Diagram Alir Prosedur ................................................................................. 16

3.4.1 Isolasi Protein ........................................................................................ 16

3.4.2. Pemurnian dengan Kromatografi Filtrasi Gel ....................................... 17

3.4.3. Penentuan Aktivitas Enzim ................................................................... 18

3.4.4. Pembuatan Kurva Baku......................................................................... 19

3.4.5. Penentuan Kadar Protein (sampel) ........................................................ 20

BAB IV ....................................................................................................................... 21

HASIL DAN PEMBAHASAN ................................................................................... 21

4.1. Tabel Pengamatan ........................................................................................... 21

4.1.1. Tabel Zat Perlakuan Hasil.......................................................................... 21

4.1.2. Tabel Data Absorbansi Pemurnian Enzim dengan Kromatografi Kolom

Filtrasi Gel ........................................................................................................... 31

4.1.3. Tabel Data Absorbansi Penentuan Aktivitas Enzim .................................. 31

4.1.4. Tabel Data Absorbansi Pembuatan Kurva Baku ....................................... 32

4.1.5. Tabel Data Absorbansi Penentuan Kadar Protein Sampel......................... 32

4.2 Perhitungan ........................................................................................................ 33

4.2.1 Tabel Pemurnian ......................................................................................... 33

4.2.2 Volume / mL ............................................................................................... 33

4.2.3. Kadar Protein (KP) / (mg/mL) ................................................................... 34

4.2.4 Aktivitas Unit (AU) / (unit/mL).................................................................. 35

3
 4.2.5 Protein Total (PT) / mg ............................................................................... 36

4.2.6. Aktivitas Total (AT) / unit ......................................................................... 38

4.2.7 Aktivitas Spesifik (AS) / (unit/mg) ............................................................. 38

4.2.8 Perolehan / % .............................................................................................. 39

4.2.9 Kemurnian / kali ......................................................................................... 41

4.3 Pembahasan ....................................................................................................... 42

BAB IV ....................................................................................................................... 50

KESIMPULAN DAN SARAN ................................................................................... 50

4.1. Kesimpulan ................................................................................................... 50

4.2. Saran ............................................................................................................. 50

DAFTAR PUSTAKA ................................................................................................. 51

4
 BAB I

PENDAHULUAN

1.1. Latar Belakang

Protease, disebut juga peptidase atau proteinase, merupakan enzim
golongan hidrolase yang akan memecah protein menjadi molekul yang lebih
sederhana, seperti menjadi oligopeptida pendek atau asam amino, dengan reaksi
hidrolisis pada ikatan peptida.Enzim ini diperlukan oleh semua makhluk hidup
karena bersifat esensial dalam metabolisme protein Peranannya dalam tubuh
antara lain membantu pencernaan protein dalam makanan, menggunakan kembali
protein-protein intraseluler, koagulasi sel darah, dan akivasi berbagai jenis
protein, enzim, hormon, serta neurotransmitter. Enzim protease adalah enzim
pencernaan yang bertugas untuk memecah protein dalam makanan menjadi asam
amino. Enzim ini diproduksi di lambung, pankreas, dan usus halus. Terdapat
beberapa jenis enzim protase, yaitu pepsin (enzim pencernaan utama di lambung),
tripsin, dan kimotripsin.
Pepaya (Carica papaya L.) atau betik adalah tumbuhan yang berasal
dari Meksiko bagian selatan dan bagian utara dari Amerika Selatan, dan kini
menyebar luas dan banyak ditanam di seluruh daerah tropis untuk diambil
buahnya. C. papaya adalah satu-satunya jenis dalam genus Carica. Nama pepaya
dalam bahasa Indonesia diambil dari bahasa Belanda, "papaja", yang pada
gilirannya juga mengambil dari nama bahasa Arawak, "papaya". Dalam bahasa
Jawa pepaya disebut "katès" dan dalam bahasa Sunda "gedang. Buah pepaya,
selain sebagai buah meja yang mengandung vitamin bagi tubuh manusia juga
menghasilkan getah yang memiliki banyak manfaat. Dalam getah pepaya ini
terkandung enzim protease yang bersifat proteolitik atau memiliki kemampuan
mengurai protein, yaitu enzim papain.Beberapa manfaat papain di antaranya

5
 sebagai penjernih bir, pengempuk daging, bahan baku industri penyamak kulit,
serta industri farmasi dan kosmetika.Papain memiliki kemapuan mengurai protein
dengan cepat. Enzim Protease yang terkandung didalamnya mampu
menghidrolisis protein menjadi unsur-unsur yang lebih sederhana.

1.2. Identifikasi Masalah

Adapun identifikasi masalah dari percobaan ini adalah sebagai berikut :
1. Bagaimana cara mengisolasi enzim protease dari getah pepaya muda (Carica
papaya)?
2. Bagaimana cara memurnikan enzim protein dengan kromatografi filtrasi gel?
3. Bagaimana cara untuk menentukan aktivitas enzim protease dari getah pepaya
muda (Carica papaya)?
4. Bagaimana cara menentukan kadar protein dari getah pepaya muda (Carica
papaya)?

1.3. Tujuan Pecobaan

Percobaan ini dimaksudkan untuk memperoleh data dan informasi yang
objektif yang berkaitan dengan isolasi, pemurnian, penentuan uji aktivasi enzim
protease kadar protein dari getah pepaya muda (Carica papaya) untuk menyusun
laporan dari percobaan yang dilakukan sebagai tugas laporan akhir. Percobaan ini
bertujuan untuk :
1. Mengisolasi enzim protease dari getah pepaya muda (Carica papaya).
2. Memurnikan enzim protease dengan metode kromatografi filtrasi gel.
3. Menentukan aktivitas enzim protease dari getah pepaya muda (Carica
papaya) dengan menggunakan substrat N,N-dimetilkasein.
4. Menentukan kadar protein dari getah pepaya muda (Carica papaya) dengan
metode Lowry.

6
1.4. Manfaat Pecobaan
1. Bagi Penulis
Percobaan ini dapat menambah pengetahuan mengenai perbandingan
antara teori yang telah didapat selama perkuliahan dengan aplikasi secara
langsung yang dilakukan dalam percobaan ini.

2. Bagi Perkembangan Ilmu Pengetahuan

Hasil dari percobaan ini diharapkan dapat memberikan referensi bagi
cabang ilmu terkait dan menjadi manfaat bagi perkembangan ilmu kimia,
khususnya gambaran mengenai isolasi enzim serta pemurniannya, penentuan
kadar protein dan uji aktivitas enzim.

1.5. Metodologi Percobaan

Adapun metode yang digunakan dalam percobaaan ini adalah :
1. Isolasi enzim protease
2. Pemurnian enzim protease dengan kromatografi filtrasi gel
3. Penentuan aktivtas enzim protease
4. Pembuatan kurva baku standar protein
5. Penentuan kadar protein

1.6. Waktu dan Tempat Percobaan

Percobaan ini dilakukan di laboratorium Biomolekular Kesehatan dan Pangan,
Departemen Kimia, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam,
Universitas Padjadjaran yang dilaksanakan pada hari Rabu tanggal 13 November
2019 sampai dengan hari Kamis tanggal 14 November 2019.

7
 BAB II

TINJAUAN PUSTAKA

2.1. Teori Dasar

Protein merupakan segolongan besar senyawa organik yang dijumpai
dalam semua makhluk hidup. Protein terdiri dari karbon, hidrogen, oksigen,
nitrogen, dan kebanyakan juga mengandung sulfur. Bobot molekulnya berkisar
antara 6000 sampai beberapa juta. Molekul protein terdiri dari satu atau beberapa
rantai panjang polipeptida dari asam- asam amino yang terikat dengan urutan
yang khas. Urutan ini dinamakan struktur primer dari protein. Polipeptida ini
dapat melipat atau menggulung, peptida yang menggulung atau melipat ini
dinamakan struktur tersier. Struktur kuarterner muncul dari hubungan structural
beberapa polipeptida yang terlihat (Page, 1997).

Enzim adalah satu atau beberapa gugus polipeptida(protein) yang

berfungsi sebagai katalis dalam suatu reaksi kimia. Enzim bekerja dengan cara
menempel pada permukaan molekul zat-zat yang bereaksi dan dengan demikian
mempercepat proses reaksi. Dalam mempelajari mengenai enzim dikenal

8
beberapa istilah diantaranya haloenzim, apoenzim, kofaktor, gugus prostetik,
koenzim, dan substrat. Apoenzim adalah suatu enzim yang seluruhnya terdiri dari
protein, sedangkan haloenzim adalah enzim yang mengandung gugus protein dan
gugus non protein. Gugus yang bukan protein dikenal dengan istilah kofaktor
(Poedjadi,1994).

Fungsi enzim adalah mengurangi energi aktivitas, yaitu enzim yang

diperlukan untuk mencapai status transisi(suatu bentuk dengan tingkat energi
tertinggi) dalam suatu reaksi kimia. Suatu reaksi yang dikatalis oleh enzim
mempunyai energi aktivitas yang lebih rendah, dengan demikian membutuhkan
lebih sedikit energi untuk berlangsungnya reaksi tersebut (Pelezar& Chan, 2005).

Faktor – faktor yang dapat mempengaruhi fungsi enzim diantaranya adalah

(Dwidjoseputro, 1992):

1. Suhu
Oleh karena reaksi kimia itu dapat dipengaruhi suhu maka reaksi
menggunakan katalis enzim dapat dipengaruhi suhu. Disamping itu, karena
enzim adalah suatu protein maka kenaikan suhu dapat menyebabkan
denaturasi dan bagian aktif enzim akan terganggu sehingga konsentrasi dan
kecepatan enzim berkurang.
2. pH
Umumnya enzim efektifitas maksimum pada pH optimum, yang lazimnya
berkisar antara pH 4,5 – 8,0. Pada pH yang terlalu tinggi atau terlalu rendah
umumnya enzim menjadi nonaktif secara irreversibel karena denaturasi
protein.
3. Konsentrasi enzim
Kecepatan suatu reaksi yang menggunakan enzim tergantung pada konsentrasi
enzim tersebut. Kecepatan reaksi bertambah dengan bertambahnya
konsentrasi enzim.

9
4. Konsentrasi substrat
Hasil eksperimen menunjukkan bahwa dengan konsentrasi substrat akan
menaikkan kecepatan reaksi. Akan tetapi, pada batas tertentu tidak terjadi
kecepatan reaksi, walaupun konsentrasi substrat diperbesar.
5. Zat – zat penghambat
Hambatan atau inhibisi suatu reaksi akan berpengaruh terhadap penggabungan
substrat pada bagian aktif yang mengalami hambatan.
Aktivitas enzim pencernaan berkorelasi dengan jumlah enzim yang terdapat
pada tempat pencernaan berlangsung. Aktivitas amilase dan protease dapat
diketahui dengan cara mengukur banyaknya mikromol maltosa dan asam – asam
amino (tirosin) yang dihasilkan per menit. Enzim – enzim pencernaan dihasilkan
oleh hepatopankreas, sedangkan sekresinya ke dalam tempat yang sama yaitu
usus halus (Gadri et al., 2014).

Tanaman pepaya (Carica papaya) merupakan jenis tanaman yang

diklasifikasikan kedalam famili Caricaceae, berupa herba yang berasal dari
Amerika Tengah dan Hindia Barat bahkan kawasan sekitar Meksico dan Coasta
Rica. Dalam sistematika tumbuhan, tanaman pepaya diklasifikasikan ke dalam
(Kalie, 2007) :

Divisio : Magnoliopyta

Kelas : Magnoliopsida

Ordo : Violales

Familia : Caricaceae

Genus : Carica

Spesies : Carica papaya L

10
 Protease adalah enzim yang mengkatalisasi pemecahan ikatan peptida
dalam peptida polipeptida dan protein dengan menggunakan reaksi menjadi
molekul – molekul yang lebih sederhana seperti peptida rantai pendek dan
asam amino. Hidrolisis ikatan peptida adalah reaksi penambahan –
penghilangan, dimana protease bertindak sebagai nukleofilik atau bereaksi
dengan membentuk satu molekul air (Lehninger, 1992).

Protease dapat dihasilkan oleh tumbuhan, hewan, dan

mikroorganisme. Penggunaan tumbuhan sebagai sumber protease terbatas
oleh tersedianya lahan tanam dan kondisi tumbuhan yang sesuai, serta
memerlukan waktu produk enzim yang lama. Produksi protease dari hewan
juga dibatasi oleh ketersediaan ternak penghasil enzim (Rao et al., 1998).

Metode yang digunakan untuk pengukuran metode protein terlarut

adalah metode Lowry. Dimana, metode Lowry dapat juga digunakan untuk
menentukan protein rantai pendek (oligopetida) dan asam amino. Prinsip kerja
metode Lowry adalah reduksi Cu2+ dari CuSO4 (reagen Lowry B) menjadi
Cu+ oleh tirosin, triptopan, dan sistein yang terdapat dalam protein. Ion Cu+
bersama dengan fosfomolibdat dan fosfotungstat yang terkandung dalam
reagen folin menjadi tungsten dan molibden yang berwarna biru yang
kemudian diuji menggunakan spektrofotometer (Septiani et al., 2004).

Papain merupakan enzim proteolitik yang terkandung dalam getah

pepaya (Carica papaya). Papain biasa diperdagangkan dalam bentuk serbuk
putih kekuningan dan harus disimpan dibawah temperatur 4°C.Kelebihan
papain dibandingkan proteolitik yang lain adalah lebih tahan terhadap proses
suhu, mempunyai kisaran pH yang luas dan lebih murni dibandingkan
bromelin dan ficin. Kisaran pH optimum papain berkisar antara 5 -7,5 dan
stabil pada suhu 40 -60°C. (Fitriani, 2006).

11
 Enzim papain dapat diperoleh dengan menyadap getah buah pepaya
dengan pisau. Buah pepaya yang masih melekat dipohon digores memanjang
dari pangkal sampai ujug buah dengan kedalaman goresan kurang lebih 2 mm
dan getah pepaya dalam cawan. Beberapa faktor yang perlu diperhatikan
dalam penyadapan getah buah pepaya agar diperoleh hasil yang maksimal
adalah sebagai berikut: umur buah 2,5- 3 bulan, waktu penyadapan dilakukan
pagi hari sebelum pukul 08.00 dan sore hari setelah matahari terbenam, dan
banyak goresan tiap kali penyadapan adalah 4 kali goresan (Fitriani, 2006).

12
 BAB III

BAHAN DAN METODE PERCOBAAN

3.1 . Alat
Alat-alat yang digunakan dalam percobaan ini adalah gelas kimia, inkubator,
kolom filtrasi gel, neraca analitik, sentrifugator, spektrofotometer UV-Vis, dan
vial.

3.2 . Bahan

3.2.1 Bahan Praktikum

Bahan praktikum yang digunakan pada percobaan ini adalah getah
pepaya muda (Carica papaya) yang baru dipetik dari pohon.

3.2.2 Bahan Kimia

Bahan kimia yang digunakan pada percobaan praktikum ini adalah
akuades, ammonium sulfat, buffer fosfat pH 7,6 0,1 M, Bovine Serum
Albumin (BSA), follin ciocalteu (fosfomolibdat-fosfowolframat),
kuprisulfat pentahidrat, natrium hidroksida, natrium karbonat, N,N-dimetil
kasein, Sephadex G-25, dan TCA 8% (trichloro acetic acid).

3.3. Metode Penelitian

3.3.1 Isolasi Enzim Protease

Pepaya muda disayat dengan pisau, lalu ditampung getah pepaya muda
(Carica papaya) tersebut pada gelas kimia. Timbang sebanyak 5 g getah
papaya muda (Carica papaya), kemudian dilarutkan dengan 10 mL
akuades. Selanjutnya larutan disentrifugasi pada kecepatan 9.000 rpm

13
 selama 30 menit (enzim berada di supernatannya). Enzim yang berada di
supernatannya, diukur volumenya terlebih dahulu. Kemudian, diambil 3
mL ke dalam botol vial sebagai ekstrak kasar yang selanjutnya disimpan
dalam freezer. Enzim yang berada di supernatan sisa, diendapkan dengan
ammonium sulfat sedikit demi sedikit sambil diaduk. Enzim yang akan
mengendap, kemudian di sentrifugasi pada kecepatan 9.000 rpm selama 30
menit (enzim berada di endapannya). Kemudian endapan dilarutkan dalam
5 mL buffer fosfat pH 7,6 0,1 M dan diambil sebanyak 3 mL ke dalam
botol vial sebagai ekstrak pengendapan yang selanjutnya disimpan dalam
freezer.

3.3.2 Pemurnian Enzim dengan Kromatografi Kolom Filtrasi Gel

Kolom gelas ukuran 1 x 1 cm dibersihkan dan dikeringkan terlebih
dahulu. Kemudian dimasukkan kapas pada ujung kolom. Kolom lalu diisi
dengan matriks Sephadex G-25 sambil dielusi dan disetimbangkan dengan
buffer fosfat pH 7,6 0,1 M sampai tinggi matriks Sephadex G-25 mencapai
±15 cm. Kemudian diatur laju alir kolom (5-7 tetes/menit). Kemudian
sample dimasukkan ke dalam kolom Sephadex G-25 sambil dielusi dengan
buffer fosfat pH 7,6 0,1 M. Ditampung sebanyak 20 fraksi (fraksi no. 1-
20), volume penampungan 3 mL per fraksi (tabung). Selanjutnya tiap fraksi
diukur serapannya pada panjang gelombang 280 nm. Tiap puncak yang
didapatkan disimpan dalam freezer.

3.3.3 Penentuan Aktivitas Enzim

Sebanyak 0,5 mL sample protein (enzim) dimasukkan ke dalam
tabung reaksi. Lalu ditambahkan dengan 2,5 mL substrat N,N-dimetil
kasein dan 4,5 mL buffer fosfat pH 7,6 0,1 M. Campuran kemudian
diinkubasi pada suhu 37C selama 30 menit. Inkubasi dihentikan dengan

14
 menambahkan 2,5 mL larutan trikloroasetat (TCA) 8%, kemudian disaring
dengan corong saring. Selanjutnya diukur serapannya pada panjang
gelombang 280 nm dengan kontrol air yang diperlakukan sama seperti
prosedur untuk sample (digunakan buffer fosfat pH 7,6 sebagai blanko
untuk measure blank).

3.3.4 Pembuatan Kurva Baku

Larutan Bovine Serum Albumin (BSA) dibuat dengan konsentrasi 4
g/mL (40 mg dalam 10 mL akuades). Kemudian dibuat variasi konsentasi
0,1; 0,5 ;1,0; 1,5; 2,0 mg/mL BSA. Sebanyak 0,1 mL larutan standar
protein atau larutan Bovine Serum Albumin (BSA) (0,1; 0,5 ;1,0; 1,5; 2,0
mg/mL BSA) dimasukkan masing-masing ke dalam tabung reaksi yang
berbeda. Kemudian ditambahkan 2,5 mL pereaksi C, dikocok dan dibiarkan
selama 10 menit pada suhu kamar. Setelah itu ditambah 0,25 mL pereaksi
D dikocok dan dibiarkan selama 30 menit. Kemudian serapan diukur pada
panjang gelombang 750 nm. Sebagai blanko (untuk menentukan titik 0/
measure blank), larutan standar protein diganti dengan akuades yang
diperlakuan sama dengan larutan standar protein. Kemudian dibuat kurva
baku protein dengan memplotkan serapan (Absorbansi) terhadap
konsentrasi standar. Selanjutnya kurva baku ini digunkan untuk
menentukan kadar protein sample yang dianalisis.

3.3.5 Penentuan Kadar Protein Sampel

Sebanyak 0,1 mL larutan sampel (ekstrak kasar, ekstrak pengendapan,
fraksi puncak) dimasukkan masing-masing ke dalam tabung reaksi yang
berbeda. Kemudian ditambahkan 2,5 mL pereaksi C, dikocok dan dibiarkan
selama 10 menit pada suhu kamar. Setelah itu ditambah 0,25 mL pereaksi
D dikocok dan dibiarkan selama 30 menit. Kemudian serapan diukur pada
panjang gelombang 750 nm. Sebagai blanko (untuk menentukan titik 0/

15
 measure blank), larutan standar protein diganti dengan akuades yang
diperlakuan sama.

3.4. Diagram Alir Prosedur

3.4.1 Isolasi Protein

Pepaya muda
• sayat pepaya muda
• tampung getahnya pada gelas kimia
• timbang sebanyak 5 gram
• larutkan dengan 10 mL akuades
• masukkan ke dalam tabung sentrifugasi
• sentrifugasi pada kecepatan 9000 rpm selama 30 menit
Supernatan Endapan
• ukur volume supernatan
• ambil 3 mL ke dalam botol vial sebagai ekstrak kasar
• tambahkan ammonium sulfat sedikit demi sedikit ke supernatan sisa
• masukkan dalam tabung sentrifugasi
• sentrifugasi pada kecepatan 9000 rpm selama 30 menit
Endapan Supernatan
• larutkan dengan 5 mL larutan buffer pH 7,6 0,1 M
• ambil 3 mL ke botol vial sebagai ekstrak pengendapan
• masukkan ke dalam freezer

Hasil

16
 3.4.2. Pemurnian dengan Kromatografi Filtrasi Gel

Kolom
• masukkan matrix Sephadex G-25 sampai 15 cm
• elusi dengan larutan buffer fosfat pH 7,6 0,1 M
• atur laju alir kolom 5-7 tetes/menit
• masukkan sampel ke dalam kolom sambil dielusi
• tampung 20 fraksi dengan volume 3 mL/fraksi
• ukur serapannya pada panjang gelombang 280nm
• plotkan grafiknya

Puncak Fraksi

17
 3.4.3. Penentuan Aktivitas Enzim

0,5 ml Sampel
Protein

• masukkan ke dalam tabung reaksi

• tambahkan 2,5 mL substrat N,N-dimetilkasein
• tambahkan 4,5 mL buffer fosfat pH 7,6 0,1 M
• inkubasi suhu 37°C selama 30 menit
• tambahkan 2,5 mL larutan trikloroasetat (TCA) 8%
• saring dengan corong saring
• ukur serapan pada panjang gelombang 280 nm dengan kontrol
air yang diperlakukan sama
Aktivitas Enzim

18
 3.4.4. Pembuatan Kurva Baku

Larutan Standar
(Bovine Serum
Albumin)
• buat variasi konsentrasi 0,1;0,5;1;1,5;2 mg/mL
• ambil masing-masing 0,1 mL
• tambah 2,5 mL pereaksi C, kocok
• biarkan selama 10 menit
• tambahkan 0,25 pereaksi D
• kocok dan biarkan selama 30 menit
• ukur serapannya dengan panjang gelombang 750 nm dengan blanko air yang
diperlakukan sama
• plot kurva baku absorbansi terhadap konsentrasi

Kurva Baku

19
 3.4.5. Penentuan Kadar Protein (sampel)

0,1 mL
sampel
• tambahkan 2,5 mL pereaksi C
• kocok dan diamkan selama 10 menit
• tambahkan 0,25 mL pereaksi D
• kocok dan diamkan selama 20 menit
• ukur serapan pada panjang gelombang 750 nm dengan blanko air yang
diperlakukan sama dengan sampel
• tentukan kadar protein

Kadar
Protein

20
 BAB IV

HASIL DAN PEMBAHASAN

4.1. Tabel Pengamatan

4.1.1. Tabel Zat Perlakuan Hasil

Zat Perlakuan Hasil

Isolasi Enzim
Protease
Pepaya Muda - disayat
- ditampung
- getah papaya
getah pada
muda
gelas kimia
Getah Pepaya Muda - ditimbang - m = 5,0000 gr
- dilarutkan
dengan 10 mL
akuades
- dimasukan
dalam tabung
sentrifugasi
- disentrifugasi
pada
kecepatan - endapan dan
9000 rpm supernatan
selama 30
menit
Supernatan - diambil dan - v = 8,2 mL

21
 diukur volume
supernatan
- diambil 3 mL
ke dalam botol
vial dan
- Ekstrak kasar
dimasukkan
ke dalam
freezer
- ditambahkan
ammonium
Supernatan sisa - v= 5,2 mL
sulfat sedikit
demi sedikit
- diaduk
- dimasukkan
ke dalam
tabung
sentrifugasi
- disentrifugasi
pada
kecepatan - endapan dan
9000 rpm supernatan
selama 30
menit
- diambil
Endapan
endapannya
- dilarutkan
dengan 5 mL
larutan buffer

22
 pH 7,6 0,1 M
- diambil 3 mL
ke dalam botol
- ekstrak
vial dan
pengendapan
dimasukkan ke
dalam freezer
Pemurnian Enzim
dengan
Kromatografi
Filtrasi Gel
- dibersihkan
dan
dikeringkan
kolom
- dimasukkan
kapas ke dalam
kolom
- dielusi kolom
dengan larutan
buffer fosfat
pH 7,6 0,1 M
- dimasukkan
matriks
Sephadex G-25
hingga 7,7 cm
- dielusi dengan
larutan buffer
fosfat pH 7,6

23
 0,1 M
- diatur laju alir
kolom 5 tetes /
menit
- dimasukkan
sampel ke
dalam kolom
berisi matriks
Sephadex G-25
dan dielusi
dengan buffer
fosfat pH 7,6
0,1 M
- ditampung
sebanyak 20
fraksi dengan - fraksi 1-20
volume 3 mL
tiap fraksi
- diukur serapan
pada panjang
Fraksi 1-20
gelombang 280
nm
- disimpan tiap
- fraksi
puncak protein
1,2,3,4,6
dalam freezer
Penetuan Aktivitas
Enzim
Ekstrak kasar, ekstrak - diambil masing

24
pengendapan, fraksi masing
1,2,3,4,6 sebanyak 0,5
mL
- dimasukkan
masing-masing
ke dalam
tabung reaksi
yang berbeda
- ditambahkan
2,5 mL substrat
N,N-dimetil
kasein
- ditambahkan
4,5 mL buffer
fosfat pH 7,6
0,1 M
- diinkubasi
pada suhu
37°C selama
30 menit
- ditambahkan
2,5 mL larutan
TCA
(trikloroasetat)
8%
- disaring
dengan corong
saring

25
 - Blanko =
0,000 A
Kontrol =
- diukur serapan 0,081 A
pada panjang Ekstrak
gelombang 280 Pengendapan
nm dengan = 0,310 A
kontrol dan air Ekstrak Kasar
yang = 0,070 A
diperlakukan Fraksi 1 =
sama (Ekstrak 0,089 A
kasar dan Fraksi 2 =
ekstrak 0,313 A
pengendapan Fraksi 3 =
diencerkan 0,141 A
100x) Fraksi 4 =
0,066 A
Fraksi 6 =
0,074 A
Pembuatan Kurva
Baku
Larutan Standar
Bouvine Serum - ditimbang - m=40 mg
Albumin
- dimasukkan ke
dalam labu
ukur 10 mL
- dilarutkan

26
 dengan
akuades hingga
tanda batas
labu ukur
- dibuat variasi
konsentrasi
- larutan variasi
0,1;0,5;1,0;1,5;
konsentrasi
2,0 mg/mL
BSA
- dipipet masing-
masing 0,1 mL
Larutan variasi
ke dalam
konsentrasi
tabung reaksi
yang berbeda
- ditambahkan
2,5 mL
pereaksi C
- dikocok dan
dibiarkan
selama 10
menit pada
suhu kamar
- ditambahkan
0,25 mL
pereaksi D
- dikocok dan
dibiarkan
selama 30

27
 menit pada
suhu kamar
- Blanko =
- diukur 0,000 A
absorbansi 0,1 = 0,07 A
pada panjang 0,5 = 0,341 A
gelombang 750 1 = 0,703 A
nm 1,5 = 1,039 A
2 = 1,226 A
- digunakan
akuades yang
diperlakukan
sama sebagai
blanko
- dibuat kurva
- y = 0,6258x +
baku
0,0375
absorbansi
R² = 0,9885
terhadap
konsetrasi
Penentuan Kadar
Protein Sampel
- dipipet masing-
Ektrak kasar, Ekstrak masing 0,1 mL
Pengendapan, Fraksi ke dalam
1,2,3,4,6 tabung reaksi
yang berbeda
- ditambahkan
2,5 mL

28
 pereaksi C
- dikocok dan
dibiarkan
selama 10
menit pada
suhu kamar
- ditambahkan
0,25 mL
pereaksi D
- dikocok dan
dibiarkan
selama 30
menit pada
suhu kamar
- Blanko =
0,000 A
Ekstrak
- diukur Pengendapan
absorbansi = 0,608 A
pada panjang Ekstrak Kasar
gelombang = 0,054 A
750 nm Fraksi 1 =
(Ekstrak kasar 0,043 A
diencerkan Fraksi 2 =
100x) 0,026 A
Fraksi 3 = -
0,036 A
Fraksi 4 =

29
 0,043 A
Fraksi 6 =
0,004 A
- digunakan
akuades yang
diperlakukan
sama sebagai
blanko
- Ekstrak
Pengendapan
= 0,9916
mg/mL
Ekstrak Kasar
= 0,0264
mg/mL
Fraksi 1 =
- ditentukan
0,0088 mg/mL
kadar protein
Fraksi 2 = -
0,0184 mg/mL
Fraksi 3 = -
0,1174 mg/mL
Fraksi 4 =
0,0088 mg/mL
Fraksi 6 = -
0,0535 mg/mL

30
 4.1.2. Tabel Data Absorbansi Pemurnian Enzim dengan Kromatografi
Kolom Filtrasi Gel

Fraksi Absorbansi Fraksi Absorbansi

1 0,4 11 0,022

2 0,545 12 0,038

3 0,23 13 0,002

4 0,224 14 0,017

5 0,056 15 0,011

6 0,2 16 0,027

7 0,01 17 0

8 0,037 18 0

9 0 19 0,007

10 0,021 20 0,003

4.1.3. Tabel Data Absorbansi Penentuan Aktivitas Enzim

Aktivitas Unit
Fraksi Absorbansi (A)
(AU)/(unit/mL)
Blanko 0,000 -
Kontrol 0,081 -
Ekstrak Pengendapan 0,310 15,2667
Ekstrak Kasar 0,070 -0,7333
1 0,089 0,5333
2 0,313 15,4667

31
 3 0,141 4
4 0,066 -1
6 0,074 -0,4667

4.1.4. Tabel Data Absorbansi Pembuatan Kurva Baku

Konsentrasi (mg/mL) Absorbansi (A)

0,1 0,07
0,5 0,341
1 0,703
1,5 1,039
2 1,226

4.1.5. Tabel Data Absorbansi Penentuan Kadar Protein Sampel

Kadar Protein (KP)

Fraksi Absorbansi (A)
(mg/mL)
Ekstrak Pengendapan 0,608 0,9116
Ekstrak Kasar 0,024 0,0264
1 0,043 0,0088
2 0,026 -0,0184
3 -0,036 -0,1174
4 0,043 0,0088
6 0,004 -0,0535

32
 4.2 Perhitungan

4.2.1 Tabel Pemurnian

Kadar Aktivitas Protein Aktivitas Aktivitas

Volume Perolehan
Zat Protein Unit Total Total Spesifik Kemurnian
(mL) (%)
(mg/mL) (Unit/mL) (mg) (unit) (unit/mg)
Ekstrak
8,2 0,0264 -0,7333 0,2165 -6,0133 -27,7778 1 1
Kasar
Ekstrak
7,8846 0,9116 15,2667 7,1876 120,3716 16,7471 -20,0174 -0,6029
Pengendapan

Fraksi 1 90,5929 0,0088 0,5333 0,7972 48,3162 60,6061 -8,0348 -2,1818

Fraksi 2 90,5929 -0,0184 15,4667 -1,6669 1401,17 -840,58 -233,011 30,2609

-
Fraksi 3 90,5929 -0,1174 4 362,3716 -34,0716 -60,2614 1,2266
10,6356

Fraksi 4 90,5929 0,0088 -1 0,7972 -90,5929 -113,636 15,0653 4,0909

Fraksi 6 90,5929 -0,0535 -0,4667 -4,8467 -42,2767 8,7227 7,0305 -0,3140

4.2.2 Volume / mL
- Volume matriks = πr2t = 3,14 . (0.6)2 . 7,7 = 8,7041 mL

3 3
- Volume sampel = 100 . volume matriks = 100 . 8,7041 = 0,2611mL

- Volume sampel praktis = 5 tetes

- Ekstrak kasar

V = 8,2 mL

- Ekstrak pengendapan

33
 8,2
V = (8,2−3) . 5 mL = 7,8846 mL

- Fraksi 2,3,4,5

7,8846
V= . 3 mL = 90,5929 mL
0.2611

4.2.3. Kadar Protein (KP) / (mg/mL)

Persamaan kurva baku
y = 0,6258x + 0,0375
R² = 0,9885
a = 0,6258
b = 0,0375
Keterangan : y = absorbansi
x = kadar protein
- Ekstrak kasar
y = 0,6258x + 0,0375
0,054 = 0,6258x + 0,0375
x = 0,0264 mg/mL
- Ekstrak Pengendapan
y = 0,6258x + 0,0375
0,608 = 0,6258x + 0,0375
x = 0,9116 mg/mL
- Fraksi 1
y = 0,6258x + 0,0375
0,043 = 0,6258x + 0,0375
x = 0,088 mg/mL
- Fraksi 2
y = 0,6258x + 0,0375
0,026 = 0,6258x + 0,0375

34
 x = -0,0184 mg/mL
-Fraksi 3
y = 0,6258x + 0,0375
-0,036 = 0,6258x + 0,0375
x = -0,1174 mg/mL
- Fraksi 4
y = 0,6258x + 0,0375
0,043 = 0,6258x + 0,0375
x = 0,0088 mg/mL
-Fraksi 6
y = 0,6258x + 0,0375
0,004 = 0,6258x + 0,0375
x = -0,0535 mg/mL

4.2.4 Aktivitas Unit (AU) / (unit/mL)

A sampel − A Blanko (kontrol)
AU =
0,001 x t hidrolisis(menit)x Venzim(mL)

- Ekstrak Kasar

0,070 − 0,081
AU =
0,001 x 30 x0,5

AU = -0,7333 unit/mL

- Ekstrak Pengendapan

0,310 − 0,081
AU =
0,001 𝑥 30 𝑥 0,5

AU = 15,2667 unit/mL

- Fraksi 1

35
 0,089 − 0,081
AU =
0,001 x 30 x 0,5)

AU = 0,5333 unit/mL

- Fraksi 2

0,313 − 0,081
AU =
0,001 x 30 x 0,5)

AU = 15,4667 unit/mL

- Fraksi 3

0,141 − 0.081
AU =
0,001 x 30 x 0,5

AU = 4,0000 unit/mL

- Fraksi 4

0,066 − 0,081
𝐴𝑈 =
0,001 𝑥 30 𝑥 0,5)

AU = -1,0000 unit/mL

- Fraksi 6

0,074 − 0,081
AU =
0,001 x 30 x 0,5

AU = -0,4667 unit/mL

4.2.5 Protein Total (PT) / mg

PT = V x KP

- Ekstrak kasar

PT = 8,2 mL x 0,0264 mg/mL

36
 PT = 0,2165 mg

- Ekstrak pengendapan

PT = 7,8846 mL x 0,9116 mg/mL

PT = 7,1876 mg

- Fraksi 1

PT = 90,5929 mL x 0,0088 mg/mL

PT = 0,7972 mg

- Fraksi 2

PT = 90,5929 mL x (-0,0184) mg/mL

PT = -1,6669 mg

- Fraksi 3

PT = 90,5929 mL x (-0,1174) mg/mL

PT = -10,6356 mg

- Fraksi 4

PT = 90,5929 mL x 0,0088 mg/mL

PT = 0,7972 mg

- Fraksi 6

PT = 90,5929 mL x (-0,0535) mg/mL

PT = -4,8467 mg

37
4.2.6. Aktivitas Total (AT) / unit
AT = V x AU

- Ekstrak kasar
AT = 8,2 mL x (-0,7333) unit/mL
AT = -6,0133 unit
- Ekstrak Pengendapan
AT = 7,8846 mL x 15,2667 unit/mL
AT = 120,3716 unit
- Fraksi 1
AT = 90,5929 mL x 0,5333 unit/mL
AT = 48,3162 unit
- Fraksi 2
AT = 90,5929 mL x 15,4666 unit/mL
AT = 1401,1700 unit
- Fraksi 3
AT = 90,5929 mL x 4,0000 unit/mL
AT = 362,3716 unit
- Fraksi 4
AT = 90,5929 mL x (-1) unit/mL
AT = -90,5929 unit
- Fraksi 6
AT = 90,5929 mL x (-0,4667) unit/mL
AT = -42,2767 unit

4.2.7 Aktivitas Spesifik (AS) / (unit/mg)

AT
AS =
PT

- Ekstrak kasar

38
 −6,0133 unit
AS =
0,2165 mg
AS = -27,7778 unit/mg
- Ekstrak pengendapan
120,3716 unit
AS =
7,1876 mg
AS = 16,7471 unit/mg
- Fraksi 1
48,3162 unit
AS =
0,7972 mg
AS = 60,6061 unit/mg
- Fraksi 2
1401,1702 unit
AS =
−1,6669 mg
AS = -840,5797 unit/mg
- Fraksi 3
362,3716 unit
AS =
−10,6356 mg
AS = -34,0715 unit/mg
- Fraksi 4
−90,5929 unit
AS =
0,7972 mg
AS = -113,6363 unit/mg
- Fraksi 6
− 42,2767 unit
AS =
−4,8467 mg
AS = 8,7227 unit/mg

4.2.8 Perolehan / %
AT sampel
Perolehan = AT Ekstrak Kasar x 100 %

39
- Ekstrak kasar
−6,0133
Perolehan = x 100 %
−6,0133
Perolehan = 100 %
- Ekstrak pengendapan
120,3716
Perolehan = x 100 %
−6,0133
Perolehan = -2001,74 %
- Fraksi 1
48,3162
Perolehan = x 100 %
−6,0133
Perolehan = -803,485 %
- Fraksi 2
1401,1702
Perolehan = x 100 %
−6,0133
Perolehan = -23301,1 %
- Fraksi 3
362,3716
Perolehan = x 100 %
−6,0133
Perolehan = -6026,14 %
- Fraksi 4
−90,5929
Perolehan = x 100 %
−6,0133
Perolehan = 1506,534 %
- Fraksi 6
−42,2767
Perolehan = x 100 %
−6,0133
Perolehan = 7,0305 %

40
4.2.9 Kemurnian / kali
AS sampel
Kemurnian =
AS Ekstrak Kasar

- Ekstrak kasar
−27,7778
Kemurnian =
−27,7778
Kemurnian = 1
- Ekstrak pengendapan
16,7471
Kemurnian =
−27,7778

Kemurnian = -0,6029

- Fraksi 1
60,6061
Kemurnian =
−27.7778
Kemurnian = -2,1818
- Fraksi 2
−840,5797
Kemurnian =
−27,7778
Kemurnian = 30,2609
- Fraksi 3
−34,0715
Kemurnian =
−27,7778
Kemurnian = 1,2266

- Fraksi 4
−113,6364
Kemurnian =
−27,7778
Kemurnian = 4,0909
- Fraksi 5

41
 8,7227
Kemurnian =
−27,7778

Kemurnian = -0,3140

4.3 Pembahasan
Percobaan kali ini yaitu Isolasi, Penentuan Kadar Protein, dan Uji Aktivitas
Enzim Protease dari Getah Pepaya Muda (Carica papaya). Tujuan dari
percobaan ini adalah mengisolasi enzim protease dari getah pepaya muda
(Carica papaya) dengan fraksionasi, memurnikan enzim protease dengan
kromatografi filtrasi gel, menguji aktivitas enzim protease dari getah pepaya
muda (Carica papaya) dengan menggunakan substrat N,N – dimetilkasein, dan
menentukan kadar protein dari getah pepaya muda (Carica papaya) dengan
metode Lowry.
Prosedur pertama yang dilakukan yaitu isolasi enzim protease. Pepaya muda
diambil getahnya dengan cara disayat dan ditampung dalam gelas kimia. Getah
pepaya lalu ditimbang sebanyak 5,0000 gram kemudian dilarutkan dalam 10 mL
akuades. Akuades berfungsi untuk melarutkan enzim karena enzim protease
memiliki kepolaran yang hampir sama dengan air sesuai dengan prinsip like
dissolve like. Selanjutnya getah papaya muda (Carica papaya) yang telah
dilarutkan dengan akuades dimasukkan ke dalam tabung sentrifugasi lalu
disentrifugasi dengan kecepatan 9000 rpm selama 30 menit. Sentrifugasi
bertujuan untuk memisahkan enzim yang berada pada supernatan dan zat
pengotor atau senyawa – senyawa lain selain enzim. Hal ini sesuai dengan
prinsip sentrifugasi yaitu teknik pemisahan berdasarkan perbedaan sedimentasi
dari partikel – partikel molekul berdasarkan gaya sentrifugal.

Setelah disentrifugasi, enzim yang berada pada supernatannya diukur

volumenya terlebih dahulu. Kemudian, diambil 3 mL ke dalam botol vial sebagai
ekstrak kasar yang selanjutnya disimpan dalam freezer. Enzim yang berada di

42
sisa supernatan diendapkan dengan ammonium sulfat sedikit demi sedikit sambil
diaduk. Penambahan ammonium sulfat akan mengendapkan enzim berdasarkan
prinsip salting out, dimana ion – ion garam ammonium sulfat akan menarik
molekul air menjauh dari enzim karena memiliki muatan berat jenis lebih besar
sehingga ketika ditambahkan dan berikatan dengan molekul air, enzim akan
berinteraksi dan menyebabkan enzim terpresipitasi. Menurunnya jumlah air yang
terikat pada enzim menyebabkan gaya tarik menarik antara enzim lebih kuat
dibandingkan dengan gaya tarik menarik antara enzim dan air (mempertinggi
interaksi hidrofobik), sehingga enzim akan mengendap. Hal tersebut sesuai
dengan prinsip fraksionasi, yaitu pemisahan protein dengan mengendapkannya
melalui proses salting out. Enzim yang akan mengendap kemudian disentrifugasi
dengan kecepatan 9000 rpm selama 30 menit (enzim berada di endapannya).
Sentrifugasi dilakukan untuk mempercepat proses pengendapan dengan
memberikan gaya sentrifugal pada partikel – partikelnya. Endapannya dilarutkan
dengan dalam 5 mL buffer fosfat pH 7,6 0,1 M. Buffer fosfat berfungsi untuk
melarutkan endapan dan menjaga agar enzim tetap stabil. Selain itu penambahan
buffer fosfat bertujuan untuk mengondisikan sampel sebelum masuk ke dalam
kolom. Sampel diambil sebanyak 3 mL ke dalam botol vial sebagai ekstrak
pengendapan yang selanjutnya disimpan di dalam freezer.

Prosedur selanjutnya yaitu pemurnian enzim dengan kromatografi filtrasi gel.

Kromatografi kolom filtrasi gel adalah suatu teknik pemisahan yang berdasarkan
pada perbedaan berat molekul (BM). Molekul-molekul dengan BM kecil akan
masuk ke dalam pori-pori gel, sedangkan molekul-molekul dengan BM besar
akan ditolak sehingga molekul yang besar akan berada pada fase gerak dan lewat
melalui jarak antarpori. Hal tersebut sesuai dengan prinsip kromatografi filtrasi
gel. Matriks gel yang digunakan pada percobaan ini yaitu Sephadex G-25
memiliki pori-pori sebesar 1000-5000 Da. Kolom gelas ukuran 1 x 1 cm
dibersihkan dan dikeringkan terlebih dahulu. Kemudian kolom dijenuhkan

43
dengan buffer fosfat pH 7,6 0,1 M. Kolom kemudian disumbat dengan kapas
yang telah dijenuhkan dengan buffer fosfat pH 7,6 0,1 M ke dalam ujung kolom.
Kolom diisi dengan buffer fosfat pH 7,6 0,1 M lalu diisi dengan matriks
Sephadex G-25 sebagai fase diam. Kolom dielusi dengan buffer fosfat pH 7,6 0,1
M dan diatur laju alirnya 3 tetes per menit. Sampel yang telah ditambahkan
dengan buffer fosfat dimasukkan ke dalam kolom sebanyak 0,4 mL (volume
praktis) yang diperoleh dari perhitungan volume kolom yaitu luas lingkaran
dikalikan tinggi kolom. Setelah sampel dimasukkan lalu dielusi dengan buffer
fosfat pH 7,6 0,1 M dan ditampung sebanyak 20 fraksi dengan tiap fraksinya
berisi 3 mL. Hasil dari tiap fraksi diukur absorbansinya menggunakan
spektrofotometer UV dengan panjang gelombang 280 nm karena protein
memiliki asam-asam amino spesifik yang memiliki gugus aromatik terkonjugasi
yang dapat menyerap spektra di panjang gelombang 280 nm. Pengukuran
absorbansi ini digunakan akuades sebagai blanko pada spektrofotometer. Setelah
itu, di plot absorbansi terhadap fraksi dan diperoleh beberapa puncak-puncak
pada grafik yang didapat. Puncak tersebut disebabkan karena adanya fraksi yang
memiliki absorbansi yang paling tinggi. Absorbansi yang tinggi tersebut
menandakan fraksi yang memiliki kemurnian yang tinggi. Dari hasil percobaan
diperoleh puncak pada fraksi 1,2,3,4, dan 6.

44
 Grafik Absobansi Pemurnian Enzim
dengan Kromatografi Filtrasi Gel
0.6
0.5

0.4
Absorbansi (A)

0.3
0.2
0.1
0
0 5 10 15 20 25
-0.1
Fraksi

Grafik 4.3.1 Grafik Absorbansi Pemurnian Enzim dengan Kromatografi Filtrasi

Gel

Kemudian, dilakukan prosedur penentuan aktivitas enzim dengan

menggunakan sampel protein yang terdiri atas ekstrak kasar, ekstrak
pengendapan, fraksi 1,2,3,4, dan 6. Masing-masing sampel protein dipipet
sebanyak 0,5 mL ke dalam tabung reaksi yang berbeda. Lalu ditambahkan
dengan 2,5 mL N,N-dimetil kasein yang berfungsi sebagai substrat yang akan
terikat pada sisi aktif enzim sehingga aktivitas enzim dapat diketahui. Hal
tersebut sesuai dengan prinsip penentuan aktivitas enzim, yaitu suatu enzim akan
bereaksi dengan substrat atau senyawa yang mirip dengan substrat. Selanjutnya,
ditambahkan 4,5 mL buffer fosfat pH 7,6 0,1 M yang berfungsi untuk
mempertahankan kestabilan protein substrat, karena sebagian besar protein stabil
pada daerah pH netral. Kasein yang ditambahkan jumlahnya harus berlebih agar
seluruh enzim dapat terikat. Enzim protease akan memecah ikatan peptida
substrat membentuk asam amino penyusunnya. Banyaknya asam amino yang
terbentuk itulah yang menentukan aktivitas enzim protease. Semakin banyak
asam amino yang terbentuk maka aktivitasnya semakin besar. Enzim dapat

45
mengkatalisis reaksi pemecahan protein dari kompleks tersebut dapat dibantu
dengan melakukan inkubasi pada suhu 37o C selama 30 menit. Suhu ini
merupakan suhu optimum untuk enzim, jika inkubasi dilakukan di atas suhu
optimumnya dikhawatirkan enzim akan terdenaturasi sehingga aktivitas enzim
tidak dapat ditentukan. Pada saat inkubasi, di dalam campuran terjadi hidrolisis
protein oleh enzim protease. Setelah 30 menit dilakukan penambahan asam
trikloroasetat (TCA) 8% sebanyak 0,5 mL yang berfungsi untuk memutuskan
rantai peptida yang panjang menjadi rantai peptida yang pendek sehingga proses
hidrolisis terhenti (inhibitor).

Selanjutnya disaring dengan corong saring untuk memisahkan kasein yang

terendapkan dan untuk mendapatkan filtrat yang bebas dari pengotor. Lalu diukur
serapannya pada panjang gelombang 280 nm dengan kontrol air yang
diperlakukan sama seperti prosedur untuk sample. Sebagai blanko digunakan
buffer fosfat pH 7,6 0,1 M untuk measure blank. Panjang gelombang ini akan
memberikan serapan maksimum untuk enzim protease.

Didapatkan absorbansi sampel ekstrak kasar, ekstrak pengendapan, fraksi

1,2,3,4, dan 6, yaitu 0,070 A, 0,310 A, 0,089 A, 0,313 A, 0,141 A, 0,066 dan
0,074 A. Kemudian ditentukan aktivitasnya / (unit/mL). Didapatkan aktivitas
sampel ekstrak kasar, ekstrak pengendapan, fraksi 1,2,3,4, dan 6, yaitu -0,7333
unit/mL; 15,2667 unit/mL; 0,5333 unit/mL; 15,4667 unit/mL; 4 unit/mL; -1
unit/mL; dan -0,4667unit/mLPada sampel ekstrak kasar, fraksi 4 dan fraksi 6
didapatkan aktivitas enzim yang bernilai negatif. Hal ini menandakan tidak
adanya aktivitas enzim protease, hal ini dapat disebabkan pada saat penyaringan
setelah penambahan TCA, yaitu penggunaan kertas saring akan menyebabkan
protein teradsorbsi sehingga akan mempengaruhi pengujian aktivitas enzim.

Prosedur selanjutnya, yaitu penentuan kurva baku (standar protein). Larutan

standar protein Bovine Serum Albumin dibuat dengan konsentrasi 4 g/mL.

46
Bovine Serum Albumin ditimbang sebanyak 40 mg, kemudian dimasukkan ke
labu ukur 10 mL, dan dilarutkan dengan akuades sampai tanda batas labu ukur.
Larutan standar protein Bovine Serum Albumin kemudian diencerkan untuk
membuat variasi konsentrasi 0,1, 0,5, 1,5, 1, dan 2 g/mL. Selanjutnya pada
masing-masing konsentrasi diambil 0,1 mL dan dimasukkan dalam tabung reaksi
yang berbeda. Kemudian ditambahkan 2,5 mL pereaksi C (campuran 50 mL
pereaksi A dan 1 mL pereaksi B). Pereaksi A adalah larutan natrium karbonat 2%
dalam natrium hidroksida 0,1 M yang berfungsi sebagai pemberi suasana basa
pada reaksi pembentukan senyawa kompleks antara Cu2+ dengan gugus -NH dari
rantai peptida pada protein. Pereaksi B adalah larutan tembaga (II) sulfat
pentahidrat 0,5% dalam Na-K-tartar 1% yang berfungsi sebagai sumber ion Cu2+
dalam percobaan. Lalu larutan didiamkan selama 10 menit agar proses dapat
berlangsung. Selanjutnya ditambahkan 0,25 mL pereaksi D yaitu pereaksi Folin-
Ciocalteu (fosfomolibdat dan fosfowolframat) yang akan direduksi oleh asam
amino tirosin dan triptofan yang berasal dari molekul protein. Larutan didiamkan
selama 30 menit agar proses reduksi berlangsung sempurna. Kompleks biru yang
terbentuk menandakan bahwa proses ini telah selesai.

Setelah itu diukur absorbansinya dengan panjang gelombang 750 nm pada

spektrofotometer UV-Vis, karena pereaksi folin-ciocalteu berwarna biru akan
terdeteksi pada panjang gelombang tersebut dan mempunyai absorbansi
maksimum. Sebagai blanko (untuk menentukan titik 0/ measure blank), larutan
standar protein Bovine Serum Albumin diganti dengan akuades yang diperlakuan
sama dengan larutan standar protein Bovine Serum Albumin. Didapatkan
absorbansi larutan standar protein Bovine Serum Albumin 0,1, 0,5, 1, 1,5, dan 2
g/mL, yaitu 0,07 A; 0,341 A; 0,703 A; 1,039 A;dan 1,226 A. Pada prosedur ini
berlaku prinsip Hukum Lambert-Beer, yaitu absobansi berbanding lurus dengan
konsentasi, sehingga semakin besa konsentrasi maka absorbansi akan semakin
besar pula. Kemudian dibuat kurva baku dengan memplotkan absorbansi

47
terhadap konsentrasi. Selanjutnya kurva baku ini digunakan untuk menentukan
kadar protein sample yang dianalisis. Didapatkan persamaan kurva baku, yaitu y
= 06258x+ 0,0375 dengan R2 = 0,9885.

Grafik Kurva Baku Standar Protein

1.4
y = 0.6258x + 0.0375
1.2
R² = 0.9885
1
Absorbansi (A)

0.8

0.6

0.4

0.2

0
0 0.5 1 1.5 2 2.5
Konsentrasi (mg/mL)

Grafik 4.3.2 Kurva Baku Standar Protein (Bovine Serum Albumin)

Selanjutnya, dilakukan prosedur penentuan kadar protein sampel. Sampel

yang digunakan terdiri atas ekstrak kasar, ekstrak pengendapan, fraksi 1,2,3,4,
dan 6. Masing-masing sampel diambil 0,1 mL dan dimasukkan dalam tabung
reaksi yang berbeda. Kemudian ditambahkan 2,5 mL pereaksi C (campuran 50
mL pereaksi A dan 1 mL pereaksi B). Pereaksi A adalah larutan natrium
karbonat 2% dalam natrium hidroksida 0,1 M yang berfungsi sebagai pemberi
suasana basa pada reaksi pembentukan senyawa kompleks antara Cu2+ dengan
gugus -NH dari rantai peptida pada protein. Pereaksi B adalah larutan tembaga
(II) sulfat pentahidrat 0,5% dalam Na-K-tartat 1% yang berfungsi sebagai sumber
ion Cu2+ dalam percobaan. Lalu larutan didiamkan selama 10 menit. Selanjutnya
ditambahkan 0,25 mL pereaksi D yaitu pereaksi Folin-Ciocalteu (fosfomolibdat
dan fosfowolframat) yang akan direduksi oleh asam amino tirosin dan triptofan

48
yang berasal dari molekul protein. Kemudian, larutan didiamkan selama 30
menit.

Pada prosedur penentuan kadar protein sampel digunakan metode Lowry.

Metode Lowry terjadi dalam dua tahap reaksi yang berbeda. Pertama, terjadi
reaksi Biuret yang merupakan reaksi pembentukan senyawa kompleks antara
Cu2+ dengan gugus -NH dari rantai peptida pada protein. Dengan adanya Cu2+
dalam suasana basa, biuret akan membentuk kompleks berwarna ungu. Tahap
kedua, reduksi pereaksi Folin-Ciocalteu (fosfomolibdat dan fosfowolframat) oleh
asam amino tirosin dan triptofan. Reaksi Biuret sendiri tidak terlalu sensitif,
namun dengan menggunakan reagen Folin-Ciocalteu membuat metode ini lebih
sensitif 1000 kali dibandingkan reaksi Biuret sendiri.

Setelah itu diukur absorbansinya dengan panjang gelombang 750 nm pada

spektrofotometer UV-Vis. Sebagai blanko (untuk menentukan titik 0/ measure
blank), digunakan akuades yang diperlakuan sama dengan sampel. Didapatkan
absorbansi sampel ekstrak kasar, ekstrak pengendapan, fraksi 1,2,3,4, dan 6,
yaitu 0,024 A; 0,608 A; 0,043 A; 0,026 A; -0,036 A; 0,043 A; dan 0,004 A.
Kemudian ditentukan kadar protein / (mg/mL). Didapatkan kadar protein sampel
ekstrak kasar, ekstrak pengendapan, fraksi 1,2,3,4, dan 6, yaitu 0,0264
mg/mL;0,9116 mg/mL; 0,0088 mg/mL; -0,0184 mg/mL; -0,1174 mg/mL; 0,0088
mg/mL; -0,0535 mg/mL.Pada fraksi 2,3 dan 6 didapatkan kadar protein yang
bernilai negatif. Hal ini dapat disebabkan karena adanya galat teknis yaitu
kesalahan pada alat spektrofotometer. Pada saat percobaan, alat spektrofometer
bekerja tidak stabil.

49
 BAB IV

KESIMPULAN DAN SARAN

4.1. Kesimpulan
4.1.1 Enzim protease dapat diisolasi dari getah pepaya muda.
4.1.2 Enzim protease dapat dimurnikan dengan metode kromatografi filtrasi gel.
4.1.3 Aktivitas enzim protease dari getah pepaya muda dapat ditentukan dengan
menggunakan substrat N,N-dimetilkasein, yaitu didapatkan aktivitas
sampel ekstrak kasar, ekstrak pengendapan, fraksi 1,2,3,4, dan 6, yaitu
4.1.4 Kadar protein dari getah pepaya muda dapat ditentukan dengan metode
Lowry, yaitu didapatkan kadar protein pada sampel ekstrak kasar, ekstrak
pengendapan, fraksi 1,2,3,4, dan 6, yaitu yaitu -0,7333 unit/mL; 15,2667
unit/mL; 0,5333 unit/mL; 15,4667 unit/mL; 4 unit/mL; -1 unit/mL; dan -
0,4667unit/mL

4.2. Saran
4.1.5 Sebaiknya preparasi kolom dilakukan sebaik mungkin agar didapatkan
laju alir yang sesuai, yaitu 5-7 tetes/ menit, sehingga tidak menggunakan
waktu yang lama untuk percobaan yang dilakukan.
4.1.6 Sebaiknya alat mikropipet yang telah selesai digunakan, diatur kembali ke
skala alat mikropipet awal.

50
 DAFTAR PUSTAKA

Dwidjoseputro, D. 1992. Pengantar Fisiologi Tumbuhan. Gramedia Pustaka Utama.

Jakarta

Fitriani,V. 2006. Getah Sejuta Manfaat. PT. Trubus Swadaya. Edisi April 2006.
Jakarta.

Gadri, S. F. A., Susilo, U., & Priyanto, S. 2014. Aktivitas Protease dan Amilase Pada
Hepatopankreas dan Intestine Ikan Nilem (Osteochilus hasselti c.v). Universitas
Jendral Soedirman. Purwakarta

Kalie, M. B. 2007. Pepaya. Penebar Swadaya. Jakarta.

Lehninger,A.L. 1992. Dasar - Dasar Biokimia, diterjemahkan oleh Maggy

Thenawidjaya. Erlangga. Jakarta

Page, D. S. 1997. Prinsip – Prinsip Biokimia, diterjemahkan oleh R.Soendoro. Edisi

Kedua. Erlangga. Jakarta.

Pelezar, M.J& Chan, E.C. 2005. Dasar-Dasar Mikrobiologi. Jilid 2. UI Press. Jakarta.

Poedjiadi, Anna. 1994. Dasar-dasar Biokimia. Universitas Indonesia. Jakarta.

Rao, M. B., Tankscale, A.M., Ghatye, M. S., Deshpande, V. V. 1998. Molecular and
Biotechnological Aspect of Microbial Proteases. Microbiology and Molecular
Biology Reviews. Vol 62. PP 597-635

Septiani, Y., Purwoko, T., & Pangastuti, H. 2004. Kadar Karbohidrat, Protein, Lemak
Pada Kecap dan Tempe. Bioteknologi. Vol 2. PP 48-53

51