Kutipan: Klockmann M, Kleinschmidt F,

Fischer K (2017) Dibawa ke atas: Stres

panas pada tahap telur mengurangi kinerja
berikutnya dalam kupu-kupu. PLoS SATU
12 (7): e0180968. https://doi.org/ 10.1371 /
journal.pone.0180968

Editor: Casper J. Breuker, Oxford

Brookes University, UNITED
KINGDOM

Diterima: 2 Mei
2017

Abstrak
Meningkatnya tekanan panas yang disebabkan oleh perubahan iklim antropogenik dapat
menimbulkan tantangan besar bagi keanekaragaman hayati karena efek merugikan
a11111111
terkait pada kelangsungan hidup dan reproduksi. Oleh karena itu, toleransi panas baru-
11 baru ini mendapat perhatian substansial, tetapi variasinya di seluruh ontogeni dan efek
a11111111 terbawa dari satu tahap perkembangan ke yang lain sebagian besar tetap diabaikan.
11 Untuk mengeksplorasi sejauh mana stres yang dialami pada awal kehidupan
a11111111 mempengaruhi tahap kehidupan selanjutnya, kami di sini menyelidiki efek stres panas
11 yang dialami pada tahap telur selama ontogeni pada kupu-kupu tropis Bicyclus anynana.
a11111111 Kami menemukan bahwa efek yang merusak dari stres panas pada tahap telur dapat
11 dideteksi pada tukik, larva, dan bahkan orang dewasa, yang dibuktikan dengan
a11111111 penurunan kelangsungan hidup, pertumbuhan, dan massa tubuh. Studi ini menunjukkan
1111 bahwa bahkan pada serangga holometabalous dengan tahap kehidupan diskrit efek
stres yang dialami di awal kehidupan dibawa ke tahap selanjutnya, secara substansial
mengurangi kebugaran berikutnya. Kami berpendapat bahwa efek seperti itu perlu
dipertimbangkan ketika mencoba meramalkan respons spesies terhadap perubahan
iklim.
AKSES BUKA
PLOS ONE | https://doi.org/10.1371/journal.pone.0180968 14 Juli
Diterima: 23 Juni 2017

Diterbitkan: 14 Juli 2017

Hak Cipta: 2017 1/13© 2017 Klockmann et

al. Ini adalah artikel akses terbuka yang
didistribusikan di bawah ketentuan Lisensi
Atribusi Creative Commons, yang
memungkinkan penggunaan, distribusi, dan
reproduksi tanpa batas dalam media apa
pun, asalkan penulis dan sumber aslinya
dikreditkan.

Pernyataan Ketersediaan Data: Semua file

data mentah tersedia dari database Dryad
(nomor aksesi:10.5061 / dryad.85325).

Pendanaan: Kami mengakui dukungan

keuangan dari Dewan Penelitian Jerman
(DFG Fi 846 / 8-1). MK adalah peneliti
doktoral terkait dari kelompok pelatihan
penelitian RESPONSE yang didanai oleh
Dewan Penelitian Jerman (DFG GRK2010).
Penyandang dana tidak memiliki peran
dalam desain studi, pengumpulan dan
analisis data, keputusan untuk menerbitkan,
atau persiapan naskah.

Dibawa ke atas: Tekanan

ARTIKEL PENELITIAN

panas pada tahap telur mengurangi

kinerja berikutnya pada kupu-kupu.
ua distribusi spesies daripada suhu rata-rata [7,8]. Oleh karena itu, batas termal kritis
atas baru-baru ini menerima perhatian substansial [9-11]. Di sini, ektoterm tropis
mungkin sangat sensitif, karena mereka hidup sudah dekat dengan batas termal
h salah satu faktor ekologis yang paling penting bagi
atas organisme
mereka [8,12-14].
dan kemampuan untuk mengatasi suhu yang berbeda merupakan kunci
Ketika mencoba menilai toleransi termal suatu
i kelangsungan hidup dan distribusi spesies. [1,2]. Paparan suhu tinggi
spesies, berbagai aspek perlu dipertimbangkan. Pertama, toleransi termal mungkin
enurunkan kebugaran individu dan pada akhirnya menyebabkan
berbeda secara substansial di seluruh ontogeni, karena tahap perkembangan
,4]. Karena perubahan iklim antropogenik yang sedang berlangsung,
bervariasi dalam ukuran, morfologi, fisiologi, dan perilaku, yang dapat dengan
yang penuh tekanan akan lebih sering ditemui di masa depan, yang
mudah mempengaruhi toleransi termal [11,15,16]. Kedua, tahap kehidupan
ngat mempengaruhi keanekaragaman hayati [5,6]. Peningkatan suhu
mungkin tidak sepenuhnya independen dari satu
ngkin sangat penting di sini, karena memiliki efek yang lebih kuat pada
Michael Klockmann *, Friederike Kleinschmidt,Klaus Fischer

Institut dan Museum Zoologi, Universitas Greifswald, Greifswald, Jerman

4 Michael.klockmann@uni-greifswald.de
Tekanan panas pada tahap telur mengurangi kinerja selanjutnya
Minat bersaing: Para penulis telah menyatakan yang
lain, sehingga stres termal yang dialami pada tahap perkembangan spesifik dapat memengaruhi kemudian sehingga tidak ada m
hidup ( “carry-over efek”;[17-21]).Ketiga, bahkan generasi yang berbeda mungkin tidak independen, rentan terhadap efek
transgenerasional [22-24]. Namun demikian, sebagian besar penelitian tentang toleransi panas telah difokuskan secara ek
satu tahap, biasanya yang dewasa [13,25,26]. Pengabaian yang terjadi secara terus-menerus pada tahap-tahap lain serta
terbawa dan efek transgenerasional dapat mengarah pada hasil palsu dan salah tafsir [26-29], dan karena itu mengejutkan
carry-over belum menerima lebih banyak perhatian dalam konteks yang diberikan kepada. tanggal [20,21,30,31].
Untuk menambah kerumitan lebih lanjut, efek negatif dari suhu tinggi pada pertumbuhan dan perkembangan juga bisa men
[14,32,33]. Misalnya, stres panas selama perkembangan dapat mengurangi ukuran tubuh orang dewasa, yang pada giliran
mengurangi toleransi panas berikutnya [16,32,34-36]. Selain toleransi stres, ukuran tubuh selanjutnya dapat mempengaruh
panjang, keberhasilan reproduksi serta daya saing [32,37-39], sehingga berpotensi mempengaruhi generasi selanjutnya. D
demikian, meningkatkan kemampuan kita untuk memprediksi respons terhadap perubahan iklim jelas memerlukan pertimb
panas pada kelangsungan hidup dan komponen kebugaran lainnya sepanjang pengembangan dan mungkin bahkan lintas
[19,25,40].
Terhadap latar belakang ini, kami di sini menyelidiki efek dari suhu yang berbeda yang dialami dalam tahap telur pada tole
tahap perkembangan selanjutnya di butiran tropis Bicyclus anynana (Butler 1897). Oleh karena itu, kami menguji kelangsu
panas (dan pertumbuhan) tukik (yaitu segera setelah paparan suhu), larva dan kupu-kupu dewasa untuk menguji terjadiny
efek carry-over di seluruh tahap perkembangan. Kami memperkirakan bahwa peningkatan tekanan panas yang dirasakan
telur akan mengurangi kinerja berikutnya, tetapi efek yang merugikan sebagian besar terbatas pada tahap berikutnya (yaitu
memang menemukan bahwa stres panas yang dialami pada tahap telur menurunkan kelangsungan hidup, pertumbuhan, d
tubuh berikutnya, dan bahwa efeknya terdeteksi hingga tahap dewasa. Dengan adanya siklus hidup kupu-kupu secara holo
hasil ini mengejutkan dan menunjukkan ketidak-independenan dari tahap perkembangan dan peran penting efek carry ove
berperan dalam menentukan toleransi terhadap stresor lingkungan.
Bahan dan metode Penelitian organisme dan pengambilan sampel telur
Bicyclus anynana adalah kupu-kupu pemakan buah tropis mulai dari Afrika selatan hingga Ethiopia [41]. Spesies ini mengh
yang sangat musiman dengan musim hujan-hangat dan kering-bergantian, sehingga sangat bergantung pada plastisitas fe
mengatasi tantangan terkait [42,43]. Variasi suhu menginduksi, misalnya, respons plastis pada pewarnaan sayap, pertumb
perkembangan, reproduksi, dan kelangsungan hidup [14,16,44-47]. Reproduksi terbatas pada musim hujan yang mengunt
mana tanaman oviposisi tersedia berlimpah [48,49]. Populasi stok laboratorium didirikan di Greifswald University, Jerman,
beberapa ratus telur yang berasal dari populasi stok yang mapan di Leiden University, Belanda. Beberapa ratus orang dew
per generasi untuk menghasilkan generasi berikutnya, mempertahankan tingkat heterozigositas yang tinggi di lokasi netral
hewan dipelihara pada suhu 27 ̊C, kelembaban relatif 70%, dan penyinaran L12: D12 dalam satu ruang iklim yang dikenda
cahaya, dan kelembaban. Untuk memulai percobaan, kami mengumpulkan telur dari beberapa ratus betina. Kami tidak me
desain keluarga di sini karena pekerjaan sebelumnya menunjukkan bahwa keluarga dibandingkan dengan efek suhu dapa
Desain eksperimental
Sekitar 500 B. anynana betina diizinkan untuk oviposit pada tanaman jagung kecil, dari mana telur dikumpulkan satu hari s
oviposisi. Telur ditempatkan di cawan petri dalam kelompok
PLOS ONE | https://doi.org/10.1371/journal.pone.0180968 14 Juli 2017
2/13 Stres panas pada tahap telur mengurangi kinerja selanjutnya
PLOS ONE | https://doi.org/10.1371/journal.pone.0180968 14 Juli 2017 3/13
Gambar 1. Sosok skematis dari desain eksperimental yang digunakan. Telur yang dikumpulkan dari populasi induk betina dibagi secara acak d
masing-masing selama 24 jam. Setelah itu, tukik berumur satu hari terpapar pada 27 ̊C atau 37 ̊C, setelah itu kelangsungan hidup dan lebar kapsul
dari tukik yang dihasilkan dibesarkan di bawah kondisi kontrol sampai eklosi dewasa dan kemudian terpapar selama 24 jam hingga 37 ̊C, setelah sk
dan sifat-sifat lainnya.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0180968.g001
10 butir telur per hidangan. Piring dibagi secara acak di antara enam kelompok, dan kemudian
jam hingga 27 (kontrol), 29, 31, 33, 35 atau 37 ̊C dalam lemari iklim (Sanyo MLR-351H; Bad N
Lemari iklim dipanaskan hingga suhu target sebelum transfer cawan petri, dengan demikian, t
digunakan. Semua telur terkena perlakuan suhu pada hari 2 setelah oviposisi, dan disimpan p
kecuali untuk waktu paparan 24 jam. Suhu yang digunakan didasarkan pada hasil sebelumny
perbedaan kuat dalam tingkat kelangsungan hidup [16]. Suhu ini jelas dalam kisaran suhu yan
di habitat aslinya [14], meskipun waktu paparan biasanya lebih pendek dari 24 jam. Keberhas
(rata-rata per cawan petri) kemudian dinilai di bawah kondisi kontrol (27 ̊C, kelembaban relatif
L12: D12). Kami menggunakan persentase orang mati per piring untuk analisis lebih lanjut.
Tukik yang dihasilkan secara acak dibagi menjadi dua kelompok (Gambar 1). Pada bagian pertama percobaan, tukik dib
diekspos selama 24 jam untuk kondisi kontrol (27 ̊C) atau panas (37 ̊C) (lemari iklim Sanyo M
Nenndorf, Jerman). Oleh karena itu, penetasan dipindahkan satu hari setelah menetas ke caw
dengan jaringan lembab dan potongan segar tanaman inang larva mereka (jagung) dalam kel
Kami menggunakan 23 hingga 55 ulangan per suhu telur dan perlakuan stres. Tingkat kelang
(dalam%) per cawan petri dinilai di bawah kondisi kontrol 24 jam setelah paparan. Selain itu k
kapsul kepala tetas mati dan hidup, menggunakan satu individu per cawan petri.
Stres panas pada tahap telur mengurangi kinerja selanjutnya

Pada bagian kedua percobaan, tetasan dibagi secara acak di antara lima kandang per suhu telur dengan masing-masin
dipelihara dalam kondisi kontrol hingga eklosi dewasa. Tingkat kelangsungan hidup selama pe
dan kepompong diberi skor per kandang (%). Satu hari setelah eklosi orang dewasa, semua k
secara individu ke gelas plastik (125 ml) dengan air, dan dipapar selama 24 jam hingga 37 ̊C.
dipindahkan kembali ke kondisi kontrol. Perhatikan bahwa semua individu terpapar pada kond
kami tertarik pada efek jangka panjang suhu telur terhadap resistensi stres. Tingkat kelangsun
jam kemudian (mati atau hidup). Kemudian, semua kupu-kupu dibekukan pada suhu -80 ̊C. D
di sini mencetak toleransi panas pada orang dewasa setelah mengalami perawatan yang berb
tahap telur. Kami mengukur massa tubuh orang dewasa, rasio thorax-abdomen, dan kadar lem
semua kupu-kupu setelah paparan panas. Oleh karena itu, kupu-kupu beku pertama kali ditim
terdekat (Sartorius LE225D). Setelah itu kaki, kepala, dan sayap diangkat pada es kering, dan
perut dipisahkan dan ditimbang. Kami menghitung rasio thorax-abdomen sebagai indikator un
antara mobilitas (thorax) dan reproduksi (abdomen) [51]. Kadar lemak perut, sebagai indikato
diukur setelah Fischer et al. (2003) tetapi menggunakan aseton yang kurang beracun daripad
Singkatnya, perut ditimbang dan kemudian dikeringkan selama 48 jam pada 60 C ̊ . Massa keri
Kemudian, lemak diekstraksi menggunakan aseton selama 48 jam, setelah itu perut sekali lag
kemudian ditimbang. Kadar lemak total dihitung dengan mengurangi massa kering bebas lem
awal dan diberikan sebagai persentase.

Analisis statistik
Kami menganalisis (1) tingkat kelangsungan hidup telur dan tukik sebagai persentase individu
tingkat kelangsungan hidup larva dan kepompong sebagai persentase individu hidup per kand
lebar kapsul kepala, massa tubuh orang dewasa, rasio thorax-abdomen, dan kandungan lema
 model campuran linier umum / umum (GLMMs) dengan suhu telur, tekanan panas, dan jenis k
tetap dan kandang sebagai efek acak (jika ada). Kelangsungan hidup orang dewasa setelah s
menggunakan regresi logistik nominal pada data biner (mati atau hidup) dengan suhu telur da
efek tetap, kandang sebagai efek acak (bersarang dalam suhu telur) dan massa tubuh orang
rasio, dan kandungan lemak sebagai kovariat. Perbandingan pasangan-bijaksana setelah GL
menggunakan Tukey's HSD untuk ukuran sampel yang tidak sama. Sepanjang teks, berarti di
dianalisis menggunakan STATISTICA 8.0 (Stat-Soft, Tulsa, OK, USA) atau JMP 7.0.1 (SAS in
USA).

Hasil
Keberhasilan penetasan telur menurun secara signifikan dengan meningkatnya suhu dari 52,8
menjadi 30,2 ± 1,4% pada 37 C ̊ (Tabel 1A; Gambar 2A). Kelangsungan hidup penetasan sec
dipengaruhi oleh suhu telur dan tekanan panas, dikurangi pada suhu yang lebih tinggi dan tek
(kontrol: 91,1 ± 1,7% > panas: 70,5 ± 1,2%; Tabel 1B; Gambar 2B). Selain itu, perbedaan ya
kelangsungan hidup penetasan antara kontrol dan kondisi stres ditemukan pada suhu telur 37
dibandingkan dengan suhu lainnya (8,6-20,4%; suhu signifikan x interaksi tekanan panas). Le
dipengaruhi secara negatif oleh suhu telur dan tekanan panas (kontrol: 0,66 ± 0,007 mm > pa
mm; Tabel 1C; Gambar 2C). Selain itu, tukik yang bertahan hidup memiliki lebar kapsul kepal
daripada individu yang mati (hidup: 0,69 ± 0,004 mm > mati: 0,57 ± 0,006 mm). Namun, keti
tersebut terlibat dalam interaksi dua arah yang signifikan. Pertama, efek suhu telur pada lebar
besar dalam kontrol (berkurang 17,1% antara 27 dan 37 ̊C) dibandingkan pada individu yang
(pengurangan sebesar 10,0%; suhu telur signifikan x

PLOS ONE | https: // doi.org/10.1371/journal.pone.01809684/13 14 Juli 2017

Stres panas pada tahap telur mengurangi kinerja selanjutnya.

Tabel 1. Hasil model linear umum (GLMs) untuk efek (a) suhu telur pada tingkat kelangsungan hidup telur , (B) suhu
pada tingkat kelangsungan hidup penetasan, (c) suhu telur, stres panas larva dan kelangsungan hidup (mati versus
kapsul kepala penetasan, dan untuk efek suhu telur pada tingkat kelangsungan hidup selama (d) larva dan (e) tahap
anynana. Nilai- signifikan Pdiberikan dalam huruf tebal.

(a) Kelangsungan hidup telur MQ DF FP Suhu telur 10957 5 27,2 <0,001 Kesalahan 402 909 (b) Penetasan survival MQ DF FP Telur suhu 7239 5 16,3 <0,001
<0,001 Temper ature x Panas 1981 5 4,5 <0,001 Kesalahan 444 456 (c) Lebar kapsul kepala MQ DF FP Suhu telur 0,158 5
0,526 1 76,9 <0,001 Kelangsungan hidup 1,862 1 272,4 <0,001 Suhu x Panas 0,019 5 2,8 0,015 Temp. x Kelangsungan Hid
Kelangsungan Hidup 0,502 1 73,4 <0,001 Temp. x Panas x Surv. 0,012 5 1,8 0,108 Kesalahan 0,007 728 (d) Tingkat pupat
1536 5 7,4 <0,001 Kesalahan 209 24 (e) Laju eklosi MQ DF FP Suhu telur 101 5 2,3 0,082 Kesalahan 45 24

https://doi.org/ 10.1371 / journal.pone.0180968.t001

interaksi panas). Kedua, efek suhu telur lebih kecil pada kematian (reduksi sebesar 10,7% an
dibandingkan dengan tetasan yang bertahan hidup (reduksi sebesar 16,2%; suhu telur signifik
hidup). Ketiga, efek stres panas terbatas pada individu yang bertahan hidup (perbedaan 17,2%
individu kontrol dan stres; panas signifikan x interaksi bertahan hidup). Data dari kohort kedua
suhu telur secara signifikan mempengaruhi tingkat kelangsungan hidup selama pengembanga
perkembangan kepompong tetap tidak terpengaruh (Tabel 1D dan 1E; Gambar 3A).
Kelangsungan hidup orang dewasa setelah stres panas hanya dipengaruhi oleh massa tubuh orang dewasa, yang lebih
daripada pada kupu-kupu mati (49,8 ± 0,7 mg > 45,3 ± 1,1 mg). Kelangsungan hidup orang
antara suhu telur (Tabel 2). Kupu-kupu berbeda secara signifikan dalam massa tubuh orang d
 pada 35 ̊C dan 37 ̊C (Tabel 3A; Gambar 3B). Selain itu, massa dewasa secara signifikan lebih
daripada pada pria (wanita: 60,0 ± 0,6 mg > pria: 36,5 ± 0,5 mg) dan juga berbeda antara pe
Rasio Thorax-abdomen, sebaliknya, secara signifikan dipengaruhi oleh jenis kelamin saja, me
laki-laki (57,3 ± 0,2%) dibandingkan pada perempuan (43,0 ± 0,2%; Tabel 3B). Kadar lemak
berbeda secara signifikan antara jantan (16,3 ± 0,4%) dan betina (5,2 ± 0,2%) dan di antara
(Tabel 3C).

Diskusi
Sejalan dengan penelitian sebelumnya, kami menemukan efek negatif yang kuat dari peningk
keberhasilan penetasan telur [16,52-57]. Efek merugikan seperti itu dapat muncul, misalnya, d

PLOS ONE | https://doi.org/10.1371/journal.pone.0180968 14 Juli 2017

5/13 Stres panas pada tahap telur mengurangi kinerja selanjutnya
PLOS ONE | https://doi.org/10.1371/journal.pone.0180968 14 Juli 2017
Gambar 2. 6/13Tingkat kelangsungan hidup telur dalam kaitannya dengan suhu (a; 24 jam pada 27, 29, 31, 33, 35, atau 37 ̊C ), tingkat kelangsungan hidup penetasan sehu
dan tekanan panas (b; paparan tukik selama 24 jam hingga 27 27C atau 37 ̊C), dan lebar kapsul kepala (HC) dalam kaitannya dengan suhu telur dan tekanan panas untuk in
hidup (c) dalam Bicyclus anynana. Diberikan berarti ± 1 SE. Ukuran sampel berkisar antara 132 dan 199 kelompok (a), 23 dan 55 kelompok (b), dan 6 dan 55 kelompok (c) d
orang. Huruf kecil yang berbeda huruf di atas balok menunjukkan perbedaan yang signifikan antara suhu telur (HSD Tukey untuk ukuran sampel yang tidak sama).

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0180968.g002

denaturasi protein, gangguan struktur membran, interaksi dengan pasokan oksigen, atau deh
Pertimbangan serupa mungkin berlaku untuk peningkatan mortalitas yang ditemukan pada tuk
panas (37 ̊C). Lebih menariknya, hasil kami juga menunjukkan efek stres termal yang parah d
dialami pada awal ontogeni pada kehidupan selanjutnya. Secara khusus, kami menemukan b
eksklusif dialami pada tahap telur menghasilkan efek pada penetasan dan kelangsungan hidu
yang ditemukan untuk tingkat penetasan telur, dan kecenderungan yang sama bahkan untuk
kepompong. Dengan demikian, probabilitas bertahan hidup jelas berkurang pada tahap kehidu
mengalami tekanan suhu di awal kehidupan. Terutama pada individu yang terpapar stres pan
tahap penetasan) kelangsungan hidup terganggu. Bahkan pada tahap dewasa, efek negatif d
tinggi masih terlihat, karena massa dewasa berkurang pada individu yang mengalami suhu te
Berkurangnya massa tubuh dapat memiliki efek merusak pada komponen kebugaran lainnya
dan reproduksi [32,34,58-60]. Dengan demikian, sementara suhu telur dalam penelitian kami
stres panas dalam tahap telur mengurangi kinerja berikutnya,
PLOS ONE | https://doi.org/10.1371/journal.pone.0180968 14 Juli 2017 7/13
Gambar 3. Tingkat kelangsungan hidup sampai kepompakan dan eklosi dewasa (a) dan massa tubuh dewasa pria dan wanita (b) sehu
(24 jam pada 27, 29, 31, 33, 35, atau 37 ̊C) di Bicyclus anynana. Diberikan berarti ± 1 SE. Ukuran sampel adalah 5 kandang dengan ma
(a) dan 29 hingga 73 individu (b). Huruf kecil yang berbeda huruf di atas bilah menunjukkan perbedaan yang signifikan antara suhu (HS
sampel yang sama).

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0180968.g003

efek langsung pada kelangsungan hidup panas orang dewasa, data kami menyarankan efek t
melalui pengurangan massa tubuh.
Tabel 2. Hasil regresi logistik nominal untuk efek suhu telur (tetap), kandang (bersarang dalam suhu; acak), jenis ke
orang dewasa, rasio toraks-perut dan kadar lemak kurang baik (kovariat) pada kelangsungan hidup panas orang dew
Nilai-signifikan P yangdiberikan dalam huruf tebal.

Kelangsungan hidup dewasa DF FP Telur suhu 5 5,52 0,356 Kandang (Suhu) 24 34,86 0,071 Seks 1 1,78 0,182 Suhu x S
dewasa 1 10,72 0,001 Tho.-abd. rasio 1 0,04 0,841 Kandungan lemak 1 0,01 0,945

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0180968.t002

Tabel 3. Hasil model campuran linier umum (GLMMs) untuk efek suhu telur (tetap), kandang ( bersarang dalam suhu, acak), dan jenis kelamin (tetap) pada (a) mas
rasio toraks-perut, dan (c) kandungan lemak perut di Bicyclus anynana. Nilai-signifikan P yangdiberikan dalam huruf tebal.

(a) Massa badan dewasa MQ DF FP Suhu telur 0,0019 5, 25 4,2 0,007 Kandang (Suhu) 0,0005 24, 649 5,3 <0,001 Seks 0,0892 1, 649 1003,7 <0,001 Suhu x Seks 0,0001 5
0,0001 649 (b ) Thor.-abd. rasio MQ DF FP Suhu telur 42,7 5, 25 1,8 0,153 Kandang (Suhu) 24,4 24, 647 1,4 0,108 Seks 30422,7 1, 647 1718,1 <0,001 Suhu x Seks 32,9 5,
647 (c) konten lemak MQ DF X2 P Suhu telur 1,4 5, 25 1,6 0,206 Kandang (Suhu) 0,9 24, 626 2,2 <0,001 Jenis Kelamin 219,7 1, 626 536,5 <0,001 Suhu x Jenis Kelamin 0,1
626

https://doi.org/10.1371 /journal.pone.0180968.t003
Efek negatif yang dilaporkan di atas menunjukkan adanya biaya (energetik) yang terkait dengan suhu tinggi. Misalnya, r
panas dianggap mahal yang dapat mengurangi ukuran tubuh berikutnya [56,61,62]. Ukuran tu
gilirannya sering kompromi aspek kehidupan lain seperti toleransi stres, reproduksi atau komp
Perhatikan di sini bahwa suhu yang lebih tinggi yang dialami selama pengembangan umumny
ukuran bopdy yang lebih kecil di ectotherms [16,32].
Kami mengukur lebar kapsul kepala tetas untuk menguji perubahan massa tubuh di awal pengembangan. Perhatikan ba
kapsul terkait erat dengan tukik massal di B. anynana [63]. Memang, kami menemukan lebar
lebih kecil dalam penetasan yang dihasilkan dari telur yang terpapar pada suhu yang lebih tin
menunjukkan peningkatan kehilangan metabolisme pada suhu yang lebih tinggi, yang menga
massa tubuh yang pada gilirannya berkontribusi terhadap penurunan kinerja secara keseluruh
laju makan mungkin menyebabkan lebar kapsul kepala lebih kecil [14]. Efek suhu telur lebih b
dibandingkan pada tukik yang stres panas, kemungkinan mencerminkan keseluruhan luas kap
berkurang pada individu yang mengalami
stres panas. Tekanan panas pada tahap telur mengurangi kinerja selanj
PLOS ONE | https://doi.org/10.1371/journal.pone.0180968 14 Juli 2017
8/13 Stres panas dalam tahap telur mengurangi kinerja selanjutnya

(Gbr 2C). Perhatikan bahwa efek negatif dari stres panas terbatas pada individu yang bertaha
efek panas yang merugikan pada pertumbuhan tetasan. Selain itu, tukik yang bertahan hidup
yang mati, yang berarti bahwa individu yang lebih besar memiliki ketahanan panas yang lebih
individu yang bertahan hidup memiliki lebih banyak waktu untuk makan dan dengan demikian
ini juga dapat menjelaskan mengapa efek suhu telur lebih jelas pada bertahan hidup daripada
ini menunjukkan bahwa, seperti yang diharapkan, stres panas akut memiliki efek merugikan p
kemungkinan melalui efek negatif pada makan dan metabolisme.
Secara bersama-sama, tekanan yang dikenakan pada tahap telur terlihat jelas di semua tahap kehidupan berikutnya ter
yang dihasilkan, diukur sebagai pengurangan massa tubuh dan kelangsungan hidup. Dalam s
holometabolous, siklus hidup jelas dibagi menjadi tahap perkembangan yang berbeda (telur, l
dipisahkan oleh transisi perkembangan utama. Potter et al. (2011), misalnya, menunjukkan ba
suhu telur yang berbeda kuat pada awal kehidupan tetapi menghilang dengan cepat pada tah
selanjutnya ([18]; lihat juga [33]). Hasil kami agak mirip dalam ukuran efek yang juga menurun
waktu sejak stres aslinya. Namun, dalam efek penelitian kami masih terlihat bahkan dalam tah
menunjukkan carry-over efek sepanjang hidup dan yang tahap perkembangan substansial tid
21,31,64,66].Selain itu, hasil kami menunjukkan bahwa stres dan kekurangan yang dialami se
awal kehidupan tidak dapat sepenuhnya dikompensasi selama pengembangan, meskipun per
adalah fitur umum pada serangga [21,67,68].
Massa tubuh betina dewasa yang lebih tinggi dibandingkan dengan jantan kemungkinan didorong oleh hubungan positif
dan fekunditas, sementara serangga jantan biasanya dipilih untuk perkembangan cepat yang
kawin [14,69]. Demikian juga, rasio thorax-abdomen laki-laki yang lebih tinggi dan kandungan
mencerminkan tekanan seleksi spesifik-jenis kelamin, mendukung kemampuan terbang dan d
untuk berhasil dalam kompetisi untuk perempuan [14,33,70].
Perubahan iklim yang sedang berlangsung, peningkatan suhu sekitar dan frekuensi peristiwa cuaca ekstrem seperti gelo
periode kekeringan, mungkin akan memiliki konsekuensi penting bagi kehidupan di bumi [71,7
gelombang panas mungkin memiliki efek dramatis pada dinamika populasi [72-74]. Data kam
bahkan gelombang panas yang relatif singkat sekalipun dapat memiliki dampak yang parah be
mortalitas langsung yang diinduksi tetapi (2) juga melalui pengurangan kebugaran sepanjang
bahkan jika selamat dari stres akut. Di sini, kami menunjukkan bahwa stres panas selama tah
kelangsungan hidup berikutnya dan massa tubuh hingga tahap dewasa. Salah satu peringata
adalah bahwa kami menggunakan periode waktu 24 jam yang dipilih secara sewenang-wenan
mensimulasikan tenunan panas, yang jelas tidak menyerupai kondisi alam yang sangat erat. N
hasil sebelumnya kami tidak berharap bahwa pengaturan yang lebih alami akan mengubah ke
substansial [75]. Efek merusak yang ditunjukkan bahkan pada massa tubuh orang dewasa tam
relevan karena dua alasan. Pertama, massa tubuh tampaknya menjadi kendala penting pada
B. anynana secara umum [16]. Kedua, ini bahkan dapat menyebabkan efek transgenasional [
lebih kecil biasanya bertelur lebih sedikit dan / atau telur yang lebih kecil berpotensi menimbu
penurunan kebugaran [32,37-39,45]. Singkatnya, temuan kami mungkin memiliki implikasi pen
meningkatkan kemampuan kami untuk memprediksi nasib spesies tertentu di bawah perubah
berlangsung, yang menunjukkan bahwa efek carry-over sepanjang siklus hidup serta efek tran
dipertimbangkan ketika mencoba untuk meramalkan tanggapan spesies terhadap perubahan

Kontribusi Penulis
 Konseptualisasi: Michael Klockmann, Friederike Kleinschmidt, Klaus Fischer.

Akuisisi pendanaan: Klaus Fischer.

PLOS ONE | https://doi.org/10.1371/journal.pone.0180968 14 Juli 2017

9/13 Stres panas dalam tahap telur mengurangi kinerja selanjutnya

Pengawasan: Klaus Fischer.

Penulisan - konsep asli: Michael Klockmann, Klaus Fischer.

Menulis - mengulas & mengedit: Michael Klockmann, Klaus Fischer.

Referensi
1. Minggu JM, Bates AE, Dulvy NK. Analisis global toleransi termal dan garis lintang dalam ectotherms. Proc R Soc Lond
1830. https://doi.org/10.1098/rspb.2010.1295 PMID: 21106582 2. Arau dan jo MB, Ferri-Ya ñ ́ ez F, Bozinovic F, Marqu
Pa
. Ecol Lett. 2013; 16: 1206-1219. https://doi.org/10.1111/ele.12155 PMID: 23869696 3. Le Moullac G, Haffner P. Faktor li
respons imun di Crustacea. Akuakultur.
2000; 191: 121–131. https://doi.org/10.1016/S0044-8486(00)00422-1 4. Overgaard J, Sørensen JG. Adaptasi termal yang cepat selama variasi suhu lapangan
melanogaster. Kriobiologi. 2008; 56: 159–162. https://doi.org/10.1016/j.cryobiol.2008.01.001 PMID: 18295194 5. Clusella-T
Chown SL. Prediktor iklim darikurva kinerja suhu
parameterdi ectotherms menyiratkan respons kompleks terhadap perubahan iklim. Saya Nat. 2011; 177: 738–751. https://d
PMID: 21597251 6. Hoffmann AA, Chown SL, Clusella-Trullas S. Batas termal atas dalam ectotherms terestrial: seberapa d
? Ecol yang Berfungsi. 2013; 27: 934–949. https://doi.org/10.1111/j.1365-2435.2012.02036.x 7. Zimmermann NE, Yoccoz NG, Edwards TC, Meier ES, Thuille
iklim
meningkatkan prediksi pola spasial spesies pohon. Proc Natl Acad Sci US A. 2009; 106: 19723– 19728. https://doi.org
PMID: 19897732

8. Kellermann V, Overgaard J, Hoffmann AA, Flojgaard C, Svenning JC, Loeschcke V. Batas termal
atas Drosophila adalah terkait dengan distribusi spesies dan sangat dibatasi secara filogenetik. Proc Natl Acad Sci U
https://doi.org/10.1073/pnas.1207553109 PMID: 22988106 9. Minggu JM, Bates AE, Dulvy NK. Toleransi termal dan redi
Chang. 2012; 2: 686–690. https://doi.org/10.1038/nclimate1539
10. Kaspari M, Clay NA, Lucas J, Yanoviak SP, Kay A. Adaptasi termal menghasilkan keragaman batas termal dalam komun
Chang Biol. 2015; 21: 1092–102. https://doi.org/10.1111/gcb. 12750 PMID: 25242246 11. Pincebourde S, Casas J. Tolerans
serangga ontogeni: pengaruh pergeseran sendi dalam mikrokontroler
dan batas termal. Ekologi. 2015; 96: 986–997. https://doi.org/10.1890/14-0744.1 PMID: 26230019 12. Deutsch CA, Tewksbu
Ghalambor CK, Haak DC, et al. Dampakiklim
pemanasanterhadap ektoterm terestrial lintas lintang. Proc Natl Acad Sci US A. 2008; 105: 6668–6672. https://doi.org/10.107
18458348 13. Kingsolver JG. Ahli biologi suhu baik. Saya Nat. 2009; 174: 755-768. https://doi.org/10.1086/
648310 PMID: 19857158 14. Fischer K, Klockmann M, Reim E. Efek negatif yang kuat dari gelombang panas simulasi pada kupu-kupu tropis.
J Exp Biol. 2014; 217: 2892–2898. https://doi.org/10.1242/jeb.106245 PMID: 24902752 15. Krebs RA, Loeschcke V. Resist
pada preadult Drosophila buzzatii: Variasi di antara
populasi dan perubahan resistensi relatif di seluruh tahapan kehidupan. Biol J Linn Soc. 1995; 56: 517–531. https://doi.org/1
16. Klockmann M, Gu ̈nter F, Fischer K. Tahan panas di seluruh ontogeni: ukuran tubuh membatasitermal
́ dez Moresino RD, Gonc ̧alves RJ, Helbling EW
toleransi. Glob Chang Biol. 2017; 23: 686–696. https://doi.org/10.1111/gcb.13407 PMID: 27371939 17. Herna n
ultraviolet radiation on crab
larvae of Cyrtograpsus altimanus. J Exp Mar Bio Ecol. 2011; 407: 363–369. https://doi.org/10.1016/j. jembe.2011.07.0

18. Potter KA, Davidowitz G, Arthur Woods H. Cross-stage consequences of egg temperature in the insect
Manduca sexta. Funct Ecol. 2011; 25: 548–556. https://doi.org/10.1111/j.1365-2435.2010.01807.x 19. Hettinger A, Sanford E, Hill TM, Russell AD, Sato KNS
carry-over effects of
planktonic exposure to ocean acidification in the Olympia oyster. Ecology. 2012; 93: 2758–2768. https://doi.org/10.1890/12-0
Zhang W, Rudolf VHW, Ma CS. Stage-specific heat effects: timing and duration of heat waves alter
 demographic rates of a global insect pest. Oecologia. 2015; 179: 947–957. https://doi.org/10.1007/ s00442-015-3409

PLOS ONE | https://doi.org/10.1371/journal.pone.0180968 July 14, 2017 10 / 13

Heat stress in egg stage reduces subsequent performance

21. Zhang W, Chang XQ, Hoffmann A, Zhang S, Ma CS. Impact of hot events at different developmental
stages of a moth: the closer to adult stage, the less reproductive output. Sci Rep. 2015; 5: 10436. https://doi.org/10.1038/sre
Marshall DJ. Transgenerational plasticity in the sea: context-dependent maternal effects across the life
history. Ecology. 2008; 89: 418–427. https://doi.org/10.1890/07-0449.1 PMID: 18409431 23. Donelson JM, Wong M, Booth DJ, Munday PL. Transgeneration
depends on rate of warming across generations. Evol Appl. 2016; 9: 1072–1081. https://doi.org/10.1111/eva.12386 PMID: 27
Ecology of Body Size in a Seed Beetle, Stator limbatus: Persistence of Environmental
Variation Across Generations? Evolution. 1997; 51: 1005. https://doi.org/10.1111/j.1558-5646.1997. tb03683.x PMID: 28568
Woods H, Buckley LB, Potter KA, MacLean HJ, Higgins JK. Complex life cycles
and the responses of insects to climate change. Integr Comp Biol. 2011; 51: 719–732. https://doi.org/ 10.1093/icb/icr015 PM
V, Turlure C, Schtickzelle N. Each life stage matters: the importance of assessing the
response to climate change over the complete life cycle in butterflies. J Anim Ecol. 2013; 82: 275–285. https://doi.org/10.111
PMID: 22924795 27. Pahkala M, Laurila A, Merila ̈ J. Carry–over effects of ultraviolet–B radiation on larval fitness in Rana
temporaria. Proc R Soc London B Biol Sci. 2001; 268: 1699–1706. 28. Fischer J, Phillips NE. Carry-over effects of multiple stressors on benthic embryos are
val exposure to elevated UVB and temperature. Glob Chang Biol. 2014; 20: 2108–2116. https://doi.org/ 10.1111/gcb.12472 P
Buckley LB, Keitt TH, Smith CD, Boateng KO, Kumar DS, et al. Resolving the life cycle alters expected impacts of climate ch
Biol Sci. 2015; 282: 20150837. https://doi. org/10.1098/rspb.2015.0837 PMID: 26290072
30. Vonesh JR. Sequential predator effects across three life stages of the African tree frog, Hyperolius spi-
nigularis. Oecologia. 2005; 143: 280–290. https://doi.org/10.1007/s00442-004-1806-x PMID: 15657758 31. Weinig C, Delph LF. Phenotypic plasticity early in
responses later. 2001;
55: 930–936. https://doi.org/10.1554/0014-3820(2001)055[0930:PPEILC]2.0.CO;2 PMID: 11430653 32. Kingsolver JGJG Huey RB. Size, temperature, and
Res. 2008; 10: 251. 33. Klockmann M, Karajoli F, Reimer S, Kuczyk J, Fischer K. Fitness implications of simulated climate
change in three species of Copper butterflies (Lepidoptera: Lycaenidae). Biol J Linn Soc. 2016. https:// doi.org/10.1111/bij.12
How rearing temperature affects optimal adult size in ectotherms. Funct Ecol.
1994; 8: 486–493. 35. Terblanche JS, Hoffmann AA, Mitchell KA, Rako L, le Roux PC, Chown SL. Ecologically relevant mea- sures of tolerance to potentially
Biol. 2011; 214: 3713–3725. https://doi.org/ 10.1242/jeb.061283 PMID: 22031735
36. Nielsen ME, Papaj DR. Effects of developmental change in body size on ectotherm body temperature
and behavioral thermoregulation: caterpillars in a heat-stressed environment. Oecologia. 2015; 177: 171–179. https://doi.org
PMID: 25367578 37. Fischer K, Bot ANM, Zwaan BJ, Brakefield PM, Central P. Genetic and environmental sources of egg s
Bicyclus anynana. Heredity. 2004; 92: 163–9. https://doi.org/10.1038/sj. hdy.6800382 PMID: 14722579 38. Hopwood PE, Mo
NJ. Niche variation and the maintenance of variation in
body size in a burying beetle. Ecol Entomol. 2016; 41: 96–104. https://doi.org/10.1111/een.12275 39. English S, Cowen H
Maternal effects on offspring size in a natural population of the viviparous tsetse fly. Ecol Entomol. 2016; 41: 618–626. https
40. Bowler K, Terblanche JS. Insect thermal tolerance: what is the role of ontogeny, ageing and se
cence? Biol Rev. 2008; 83: 339–355. https://doi.org/10.1111/j.1469-185X.2008.00046.x PMID: 18979595 41. Larsen TB. The
̈ L, Mappes J. Does predatio
natural history. Oxford: Oxford University Press; 1991. 42. Lyytinen A, Brakefield PM, Lindstro m
Bicy- clus anynana? Proc R Soc London B Biol Sci. 2004; 271: 279–283. https://doi.org/10.1098/rspb.2003. 2571 PMID: 150
PM, Zwaan BJ. Phenotypic plasticity of starvation resistance in the butterfly Bicyclus
anynana. Evol Ecol. 2007; 21: 589–600. https://doi.org/10.1007/s10682-006-9137-5

PLOS ONE | https://doi.org/10.1371/journal.pone.0180968 July 14, 2017 11 / 13

Heat stress in egg stage reduces subsequent performance

44. Wijngaarden PJ, Koch PB, Brakefield PM. Artificial selection on the shape of reaction norms for eyespot
size in the butterfly Bicyclus anynana: direct and correlated responses. J Evol Biol. 2002; 15: 290–300. https://doi.org/10.104
45. Fischer K, Brakefield PM, Zwaan BJ. Plasticity in butterfly egg size: why larger offspring at lower tem-
 peratures? Ecology. 2003; 84: 3138–3147. https://doi.org/10.1890/02-0733 46. Fischer K, Dierks A, Franke K, Geister TL, Liszka M, Winter S, et al. Environ
ture stress resistance in the tropical butterfly Bicyclus anynana. PLoS Satu. 2010; 5: e15284. https://doi. org/10.1371/journal
21187968 47. Franke K, Heitmann N, Tobner A, Fischer K. Fitness costs associated with different frequencies and magnitud
butterfly Bicyclus anynana. J Therm Biol. 2014; 41: 88–94. https://doi.org/10.1016/j.jtherbio.2014.02.006 PMID: 24679977 48
Phenotypic plasticity, seasonal climate and the population biology of Bicy-
clus butterflies (Satyridae) in Malawi. Ecol Entomol. 1991; 16: 291–303. 49. Brakefield PM. Phenotypic plasticity and fluctuating asymmetry as response to en
the butterfly Bicyclus anynana. In: Bijlsma R, Loeschke V, editors. Environmental Stress: Adaptation and Evolution. Birkha ̈us
Van't Hof AE, Zwaan BJ, Saccheri IJ, Daly D, Bot ANM, Brakefield PM. Characterization of 28 microsat- ellite loci for the butt
Ecol Notes. 2005; 5: 169–172. https://doi.org/10.1111/j. 1471-8286.2004.00870.x 51. Hughes CL, Hill JK, Dytham C. Evolutio
reproduction and dispersal in popula-
tions at expanding range boundaries. Proc R Soc London B Biol Sci. 2003; 270: 147–150. 52. Tewksbury JJ, Huey RB, De
tropical animals. Ilmu. 2008; 320: 1296–
1297. https://doi.org/10.1126/science.1159328 PMID: 18535231 53. Andrew NR, Hart RA, Jung MP, Hemmings Z, Terblanche JS. Can temperate insects tak
case study of the physiological and behavioural responses in a common ant, Iridomyrmex purpureus (Formicidae), with poten
Physiol. 2013; 59: 870–880. https://doi.org/10. 1016/j.jinsphys.2013.06.003 PMID: 23806604 54. Rukke BA, Aak A, Edgar KS
sterilization, and maternal effects of sublethal heat in bed bugs. PLoS Satu. 2015; 10: e0127555. https://doi.org/10.1371/jour
25996999
55. Klose MK, Robertson RM. Stress-induced thermoprotection of neuromuscular transmission. Integr
Comp Biol. 2004; 44: 14–20. https://doi.org/10.1093/icb/44.1.14 PMID: 21680481 56. Chown SL, Terblanche JS. Physiological diversity in insects: ecological
In Insect Phys. 2006; 33: 50–152. https://doi.org/10.1016/S0065-2806(06)33002-0 PMID: 19212462 57. Potter K, Davidowitz G, Woods HA. Insect eggs prote
temperatures by limited homeo- thermy of plant leaves. J Exp Biol. 2009; 212: 3448–3454. https://doi.org/10.1242/jeb.03336
Blanckenhorn WU. The evolution of body size: What keeps organisms small? Q Rev Biol. 2000; 75:
385–407. https://doi.org/10.1086/393620 PMID: 11125698 59. Gibbs AG. Water balance in desert Drosophila: lessons from non-charismatic microfauna. Com
Mol Integr Physiol. 2002; 133: 781–789. https://doi.org/10.1016/S1095-6433(02) 00208-8

60. Chidawanyika F, Terblanche JS. Rapid thermal responses and thermal tolerance in adult codling moth
Cydia pomonella (Lepidoptera: Tortricidae). J Insect Physiol. 2011; 57: 108–117. https://doi.org/10. 1016/j.jinsphys.2010.09.0
RA, Loeschcke V. Costs and benefits of activation of the heat-shock response in Drosophila mel-
anogaster. Funct Ecol. 1994; 8: 730–737.

62. Sørensen JG, Kristensen TN, Loeschcke V. The evolutionary and ecological role of heat shock proteins.
Ecol Lett. 2003; 6: 1025–1037. https://doi.org/10.1046/j.1461-0248.2003.00528.x 63. Fischer K, Zwaan B, Brakefield P. How
body size in butterflies? Oecologia.
2002; 131: 375–379. https://doi.org/10.1007/s00442-002-0913-9 PMID: 28547709 64. Pechenik JA. Larval experience
metamorphosis is not a new beginning. Integr
Comp Biol. 2006; 46: 323–33. https://doi.org/10.1093/icb/icj028 PMID: 21672745 65. Russell J, Phillips NE. Synergistic effects of ultraviolet radiation and con
mas-
ses of limpets (Benhamina obliquata and Siphonaria australis) in New Zealand. Mar Biol. 2009; 156: 579–587. https://doi.org
66. Marshall DJ, Morgan SG. Ecological and Evolutionary Consequences of Linked Life-History Stages in
the Sea. Curr Biol. 2011; 21: 718–725. https://doi.org/10.1016/j.cub.2011.08.022 PMID: 21959162

PLOS ONE | https://doi.org/10.1371/journal.pone.0180968 July 14, 2017 12 / 13

Heat stress in egg stage reduces subsequent performance

67. Metcalfe NB, Monaghan P. Compensation for a bad start: grow now, pay later? Trends Ecol Evol. 2001;
16: 254–260. https://doi.org/10.1016/S0169-5347(01)02124-3 PMID: 11301155 68. Dmitriew C, Rowe L. Resource limitation, predation risk and compensator
logia. 2005; 142: 150–154. https://doi.org/10.1007/s00442-004-1712-2 PMID: 15372227 69. Karl I, Fischer K. Why get big in
to a life-history puzzle. Oecologia. 2008;
155: 215–225. https://doi.org/10.1007/s00442-007-0902-0 PMID: 18000685 70. Fischer K, Fiedler K. Sex-related differences in reaction norms in the butterfly
Lycaenidae). Oikos. 2000; 90: 372–380. https://doi.org/10.1034/j.1600-0706.2000.900218.x
71. Battisti DS, Naylor RL. Historical warnings of future food insecurity with unprecedented seasonal heat.
Ilmu. 2009; 323: 240–244. https://doi.org/10.1126/science.1164363 PMID: 19131626 72. Coumou D, Rahmstorf S. A decade
Chang. 2012; 2: 1–6. https://doi.org/
10.1038/nclimate1452 73. McKechnie AE, Wolf BO. Climate change increases the likelihood of catastrophic avian mortality events
during extreme heat waves. Biol Lett. 2010; 6: 253–256. https://doi.org/10.1098/rsbl.2009.0702 PMID: 19793742
 74. Sentis A, Hemptinne JL, Brodeur J. Effects of simulated heat waves on an experimental plant-herbi-
vore-predator food chain. Glob Chang Biol. 2013; 19: 833–842. https://doi.org/10.1111/gcb.12094 PMID: 23504840 75. Fisch
I. Assay conditions in laboratory experiments: is the use of constant rather than fluctuating temperatures justified when inves
plasticity? Oeco- logia. 2011; 166: 23–33. https://doi.org/10.1007/s00442-011-1917-0 PMID: 21286923 76. Sgrò CM, Terblan
Can Plasticity Contribute to Insect Responses to Climate
Change? Annu Rev Entomol. 2016; 61: 433–451. https://doi.org/10.1146/annurev-ento-010715- 023859 PMID: 266673

PLOS ONE | https://doi.org/10.1371/journal.pone.0180968 July 14, 2017 13 / 13