LAPORAN PRAKTIKUM MIKROBIOLOGI PERTANIAN

“Pengecetan Gram dan Pengujian KOH pada Bakteri”

OLEH :
NAMA : FEBRIANI
NIM : Q1A118014
KELOMPOK : II
KELAS : ITP 2018A
NAMA ASISTEN : PANDI AL PANDI

JURUSAN ILMU DAN TEKNOLOGI PANGAN

FAKULTAS PERTANIAN
UNIVERSITAS HALU OLEO
KENDAR
2019
 I. PENDAHULUAN

1.1 Latar Belakang

Bakteri mempunyai morfologi, struktur dan sifat-sifat yang khas. Bakteri

merupakan mikroorganisme yang berukuran mikroskopik. Selain mikroskopik,

bakteri juga hampir tidak berwarna atau transparan dan kontras dengan air. Sehingga

melihat dan mengamati bakteri dalam kedaan hidup sangat sulit. Untuk mengatasi hal

tersebut maka dikembangkan suatu teknik pewarnaan sel bakteri. Ini merupakan salah

satu cara yang paling utama dalam penelitian-penelitian mikrobiologi. Hal itu untuk

mempernudah proses identifikasi bakteri.

Dalam taksonomi mikroba alat yang paling ampuh digunakan yaitu pewarnaan

Gram (Gram Stain), yang dapat digunakan untuk memisahkan anggota- anggota

dominan bakteria ke dalam dua kelompok berdasarkan perbedaan dinding selnya.

Bakteri gram positif memiliki dinding sel yang lebih sederhana, dengan jumlah

peptidoglikan yang relatif banyak. Dinding sel bakteri gram-negatif memiliki

peptidoglikan yang lebih sedikit dan secara struktural lebih kompleks. Membran

bagian luar pada dinding sel gram-negatif mengandung lipopolisakarida, yaitu

karbohidrat yang terikat dengan lipid.

Selain pewarnaan gram, cara lain mengamati morfologi bakteri yaitu dengan uji

larutan KOH. Dimana hal yang diamati adalah adanya lender atau tidak. Bakteri yang

setelah dicampur oleh KOH berlendir, menandai bahwa bakteri tersebut Gram-

negatif. Bila tak berlendir berarti bakteri tersebut Gram-positif. Bakteri yang
berlendir dicirikan bahwa dindingh selnya lebih tepatnya peptidoglikan yang menipis.

Berdasarkan uraian diatas maka diperlukan pengamatan tentang morfologi bakteri

melalui pengujian KOH dan pengecetan gram.

1.2 Tujuan

Tujuan pelaksanaan kegiatan ini yaitu untuk melihat bentuk bakteri dan

mempelajari cara pewarnaan.

 II. TINJAUAN PUSTAKA

Karakterisasi merupakan salah satu kegiatan yang dilakukan untuk

mengobservasi bakteri maupun kapang hasil isolasi (isolat). Kegiatan karakterisasi

dapat dilakukan berdasarkan sifat sitologi (bentuk sel, gerak atau motilitas, sifat Gram

dan endospora), sifat morfologi, dan sifat fisiologi. Uji sifat morfologi mencakup

sifat-sifat koloni, seperti ukuran, bentuk, warna dan tepian, sedangkan uji sifat

fisiologi diantaranya uji hidrolisis pati, hidrolisis lemak, hidrolisis protein dan uji

katalase (Subandi, 2009).

Pewarnaan Gram dan spora dapat dilakukan dalam uji sifat sitologi suatu

bakteri. Prinsip pewarnaan Gram adalah kemampuan dinding sel terhadap zat warna

dasar (Kristal violet) setelah pencucian alkohol 96%. Bakteri Gram positif terlihat

berwarna ungu karena dinding selnya mengikat Kristal violet lebih kuat, sedangkan

sel Gram negatif mengandung lebih banyak lipid sehingga pori-pori mudah

membesar dan Kristal violet mudah larut saat pencucian alkohol. Pewarnaan spora

dilakukan untuk mengetahui ada atau tidaknya spora pada bakteri. Spora dapat

terbentuk saat kondisi tidak memungkinkan pertumbuhan bakteri. Spora juga mampu

mengikat warna lebih cepat dan sukar melepaskannya (Yuhana et al., 2011).

Pewarnaan gram dilakukan bertujuan sama dengan uji gram yaitu untuk

membedakan bakteri apakah gram positif atau gram negatif, bakteri dicampur dengan

tetesan air steril pada gelas objek, kemudian disebarkan ditengah gelas obyek

sehingga membentuk lapisan tipis dan difiksasi. Dengan kristal violet olesan bakteri

digenangi selama dua menit, lalu dicuci dengan air mengalir, dan dikering anginkan.
Diberi yodium selama dua menit, dicuci dengan air mengalir dan dikeringanginkan.

Selanjutnya diberi larutan pemucat yaitu alkohol 95%, tetes demi tetes sampai zat

warna ungu tidak terlihat lagi, lalu dicuci pada air mengalir dan dikeringanginkan.

Kemudian dogenangi lagi dengna safranin selama 30 detik, lalu dicuci dan dibiarkan

kering diudara. Warna merah pada olesan bakteri menujukkan bakteri gram negatif

dan jika warna ungu menunjukkan bakteri gram positif (Santoso dan Estiasih, 2014).

Bakteri dapat diklasifikasikan menjadi aerob dan anaerob. Perbedaan utama

antara kedua adalah kenyataan bahwa bakteri aerobik membutuhkan oksigen untuk

tetap hidup, sementara bakteri anaerob tidak bergantung pada oksigen untuk proses

metabolisme dan kelangsungan hidup. Sedangkan aerob dapat berkembang di habitat

yang memiliki oksigen berlimpah, anaerob dapat mati dalam dengan adanya oksigen.

Jenis bakteri memang memiliki keunggulan pertumbuhan area tubuh tidak terpapar

oksigen, dan mereka bisa menjadi patogen virulen. Perbedaan kapasitas untuk

memanfaatkan oksigen antara aerob dan anaerob penting dalam pengobatan infeksi

tubuh (Bernadip dan Sudadi, 2014).

Identifikasi dan determinasi suatu biakan murni bakteri yang diperoleh dari

hasil isolasi dapat dilakukan dengan cara pengamatan sifat morfologi koloni,

morfologi sel bakteri, pengujian sifat-sifat fisiologi dan biokimianya. Selain itu,

identifikasi juga dapat dilakukan dengan penguraian sifat patogenitas dan

serologinya. Pertumbuhan bakteri di alam dipengaruhi oleh beberapa faktor luar

seperti susbtrat, pertumbuhan , pH, temperatur, dan bahan kimia. Bakteri yang

nampak dapat memiliki morfologi yang sama, namun keperluan nutrisi dan
persyaratan ekologinya berbeda. Untuk pengamatan morfologi bakteri dengan jelas

,tubuhnya perlu diisi dengan cat warna, pewarnaan ini disebut pengecatan ekteri

(Sudjito, 2015).

Bakteri memiliki beberapa bentuk yaitu basil (tongkat), kokos, dan

spirilum. Bakteri yang berbentuk tongkat maupun kokus dibagi menjadi

beberapa macam. Pada bentuk basil pembagiannya yaitu basil tunggal,

diplobasil, dan tripobasil. Sedangkan pada kokus dibagi monokokus (satu

buah bakteri berbentuk kotak), diplokokus, sampai sthapylococcus

(bentukknya mirip buah anggur). Khusus pada spiral hanya di bagi dua yaitu

setengah melengkung dan tidak melengkung. Bakteri juga dapat dibedakan

melalui teknik pewarnaan gram. Teknik pewarnaan gram tersebut dapat

menghasilkan warna merah dan ungu. Bakteri gram negative ditandai

dengan pewarnaan ungu sedangkan yang positif berwarna merah (Wignyanto

dan Hidayat, 2017).

 III. METODOLOGI PRAKTIKUM

3.1 Tempat dan Waktu

Kegiatan praktikum ini dilaksanakan di Laboratorium Proteksi Tanaman Unit

Pendidikan Fakultas Pertanian Universitas Halu Oleo pada hari Kamis, 31 Oktober

2019 pukul 08:00 WITA – selesai.

3.2 Alat dan Bahan

Alat yang digunakan pada praktikum ini adalah kaca benda, jarum ose, pipet

dan cawan petri.

Bahan yang digunakan pada praktikum ini adalah biakan murni dan larutan

KOH 3%.

3.3 Prosedur Kerja

A. Pewarnaan Sederhana

1. Membuat olesan bakteri pada kaca benda.

2. Difiksasi.

3. Member zat warna utama yaitu amonium oksalat Kristal violet (berupa

larutan) selama 1 – 2 menit, kemudian dicuci dengan air mengalir.

4. Memberi mordan yaitu larutan iodium selama 1 – 2 menit, dicuci dengan air

mengalir.

5. Meneteskan larutan alkohol aseton sedikit sedikit demi sedikit, sehingga

larutan yang mengalir tadi berwarna menjadi tidak berwarna.

 6. Meneteskan zat pewarna penutup yaitu larutan berwarna merah atau karbon

selama 2 – 3 menit.

7. Mencuci dengan air mengalir, dikeringkan.

8. Mengamati di bawah mikroskop dengan minyak inersi.

9. Menggambar bentuk bakteri dan warnanya.

B. Uji Larutan KOH

1. Mengambil satu ose biakan bakteri Bacillus dan mencampurkan dengan 2

tetes larutan KOH 3% diatas gelas objek.

2. Mengaduk secara merata dengan jarum ose, menarik jarum ose ke atas gelas

objek dan mengamati pembentukan lender. Jika terbentuk lender

mengidentifikasi bakteri Gram-negatif, jika tidak berlendir mengidentifikasi

bakteri Gram-positif.

3. Melakukan hal yang sama (prosedur 1 dan 2) untuk isolate-isolat bakteri

lainnya.
 IV. HASIL DAN PEMBAHASAN

4.1 Hasil

Hasil praktikum kali ini dapat dilihat pada gambar dan tabel di bawah ini :

Hasil Pengamatan
No Kode Isolat Uji KOH Keterangan
Reaksi Gram Bentuk Sel
1. Dauh 1 Negatif Irregular Lendir
2. Dauh 2 Negatif Circular lendir

3. Tanah 1 Negatif Irregular Lendir

4. Tanah 2 Negatif Spindle Lendir

4.2 Pembahasan

Pewarnaan Gram atau metode Gram adalah suatu metode untuk membedakan

spesies bakteri menjadi dua kelompok besar, yakni gram-positif dan gram-negatif,

berdasarkan sifat kimia dan fisik dinding sel mereka. Metode ini diberi nama

berdasarkan penemunya, ilmuwan Denmark Hans Christian Gram (1853–1938) yang

mengembangkan teknik ini pada tahun 1884 untuk membedakan antara pneumokokus

dan bakteri Klebsiella pneumoniae.

Dengan metode pewarnaan Gram, bakteri dapat dikelompokkan menjadi dua,

yaitu bakteri Gram positif dan Gram negatif berdasarkan reaksi atau sifat bakteri

terhadap cat tersebut. Reaksi atau sifat bakteri tersebut ditentukan oleh komposisi

dinding selnya. Oleh karena itu, pengecatan Gram tidak bisa dilakukan pada

mikroorganisme yang tidak mempunyai dinding sel seperti Mycoplasma sp Contoh

bakteri yang tergolong bakteri tahan asam, yaitu dari genus Mycobacterium dan
beberapa spesies tertentu dari genus Nocardia. Bakteri bakteri dari kedua genus ini

diketahui memiliki sejumlah besar zat lipodial (berlemak) di dalam dinding selnya

sehingga menyebabkan dinding sel tersebut relatif tidak permeabel terhadap zat-zat

warna yang umum sehingga sel bakteri tersebut tidak terwarnai oleh metode

pewarnaan biasa, seperti pewarnaan sederhana atau Gram.

Bakteri Gram-negatif adalah bakteri yang tidak mempertahankan zat warna

metil ungu pada metode pewarnaan Gram. Bakteri gram-positif akan

mempertahankan zat warna metil ungu gelap setelah dicuci dengan alkohol,

sementara bakteri gram-negatif tidak. Pada uji pewarnaan Gram, suatu pewarna

penimbal (counterstain) ditambahkan setelah metil ungu, yang membuat semua

bakteri gram-negatif menjadi berwarna merah atau merah muda.

Perbedaan dasar antara bakteri gram positif dan negatif adalah pada

komponen dinding selnya. Kompleks zat iodin terperangkap antara dinding sel dan

membran sitoplasma organisme gram positif, sedangkan penyingkiran zat lipida dari

dinding sel organisme gram negatif dengan pencucian alcohol memungkinkan hilang

dari sel. Bakteri gram positif memiliki membran tunggal yang dilapisi peptidohlikan

yang tebal (25-50nm) sedangkan bakteri negative lapisan peptidoglikogennya tipis (1-

3 nm).
 Sifat bakteri terhadap pewarnaan Gram merupakan sifat penting untuk

membantu determinasi suatu bakteri. Beberapa perbedaan sifat yang dapat dijumpai

antara bakteri Gram positif dan bakteri Gram negatif yaitu:

Ciri-ciri bakteri gram negatif yaitu:

Struktur dinding selnya tipis, sekitar 10 – 15 mm, berlapis tiga atau multilayer.

Dinding selnya mengandung lemak lebih banyak (11-22%), peptidoglikan terdapat

d idalam.

lapisan kaku, sebelah dalam dengan jumlah sedikit ± 10% dari berat kering, tidak

mengandung asam tekoat.

Kurang rentan terhadap senyawa penisilin.

Pertumbuhannya tidak begitu dihambat oleh zat warna dasar misalnya Kristal

violet.

Komposisi nutrisi yang dibutuhkan relatif sederhana.

Tidak resisten terhadap gangguan fisik.

Resistensi terhadap alkali (1% KOH) lebih pekat

Peka terhadap streptomisin

Toksin yang dibentuk Endotoksin

Ciri-ciri bakteri gram positif yaitu:

Struktur dinding selnya tebal, sekitar 15-80 nm, berlapis tunggal atau monolayer.

Dinding selnya mengandung lipid yang lebih normal (1-4%), peptidoglikan ada

yang sebagai lapisan tunggal. Komponen utama merupakan lebih dari 50% berat

ringan. Mengandung asam tekoat.

Bersifat lebih rentan terhadap penisilin.

Pertumbuhan dihambat secara nyata oleh zat-zat warna seperti ungu kristal.

Komposisi nutrisi yang dibutuhkan lebih rumit.

Lebih resisten terhadap gangguan fisik.

Resistensi terhadap alkali (1% KOH) larut.

Tidak peka terhadap streptomisin

Toksin yang dibentuk Eksotoksin Endotoksin

 V. PENUTUP

3.4 Kesimpulan

Berdasarkan hasil dan pembahasan dapat disimpulkan bahwa Gram memiliki

dinding sel yang tebal dan lemak yang tipis sedangkan gram berlemak tebal dan

berdinding sel tipis yang berada di ruang periplasma. Penentuan sifat gram dengan

KOH 3% (disebut KOH string test) memiliki hasil yang sama dengan pewarnaan

gram. Semua bakteri memiliki enzim proteinase tapi tidak semuanya memiliki enzim

proteinase ekstraseluler, aktivitas enzim ini juga dapat dibuktikan dengan adanya

zona bening di sekeliling koloni. Jenis bakteri yang dapat menghidrolisis protein

adalah bakteri yang memproduksi enzim proteinase ekstraseluler.

3.5 Saran

Saran dari penulis yaitu penulis menyadari laporan ini belum sepenuhnya

sempurna, untuk itu kami mengharapkan kakak dari asisten praktikum mikrobiologi

pertanian untuk memeriksa. Semoga isi laporan ini dapat menjadi acuan dalam

praktikum mikrobiologi pertanian selanjutnya dan agar dapat membangun motivasi

dan kepahaman tentang alat-alat di laboratorium kedepannya.

 DAFTAR PUSTAKA

Subandi. 2009. Dasar-Dasar Mikrobiologi. Gunung Djati Press,Bandung.

Edwin. 2011. Materi Kuliah Mikrobiologi. Universitas Lambung

Mangkurat, Banjarbaru.

Fardiaz, S. 2012. Mikrobiologi pangan. IPB, Bogor.

Hadiotomo, Ratna Siri., 2011. Mikrobiologi dasar dalam praktek.

Pt.Gramedia, Jakarta.

Lay, Bibiana W.,2009.Analisis mikroba di laboratorium. PT. Raja Grafindo, Jakarta.

Michael J. Pelczar, dan E.C.S. Chan. 2008. Dasar-dasar mikrobiologi. Ui-

Press, Jakarta.