Ringkasan Isolasi &

Pemurnian Enzim
Contoh enzim yang digunakan dalam industri pangan.

-Pada pengolahan keju, enzim protease digunakan untuk memecah

misel kasein sehingga terbentuk curd.
-Enzim α-amilase digunakan dalam industri hidrolisis pati, bir, roti, dan
deterjen.
-Dalam industri hidrolisis pati, α-amilase digunakan untuk mencairkan
pati yang tergelatinasi. Enzim tersebut berfungsi menurunkan
viskositas pati dan menghidrolisisnya menjadi maltodekstrin.
-Enzim αamiloglukosidase (1,4-α-D-glukan glukohidrolase atau
glukoamilase) dari cendawan digunakan dalam produksi sirup glukosa
yang setara dengan dekstrosa sebesar 95-97%.
-Enzim isomerase digunakan untuk mengubah glukosa menjadi
fruktosa (pemanis alami yang paling manis) dalam industri sirup
jagung. Isomerisasi ini menggunakan enzim xilosa isomerase.
 Enzim dari tumbuhan dan hewan tersebut memungkinkan timbul
banyak persoalan.
 Enzim dari tumbuhan, persoalan yang timbul antara lain variasi
musim, konsentrasi rendah dan biaya proses yang tinggi.
 enzim dari hewan, selain jumlahnya terbatas juga dimanfaatkan
untuk kepentingan lain.
 Enzim yang secara tradisional diperoleh dari tumbuhan termasuk
protease (papain, fisin, dan bromelain), amilase, lipoksigenase, dan
enzim khusus tertentu.
 Enzim utama dari jaringan hewan adalah tripsin pankreas, lipase
dan enzim untuk pembuatan mentega.

Enzim dari
mikroorganisme
 Produksi enzim diawali dengan proses pemilihan mikroorganisme
penghasil enzim yang diinginkan.
 Proses seleksi dapat pula ditambah dengan memilih enzim intraseluler
atau ekstraseluler.
 Jika enzim yang diproduksi akan dimanfaatkan dalam industri pangan,
maka mikroorganisme harus memenuhi kriteria generally recognized as
safe (GRAS), yaitu mikroorganisme yang tidak menghasilkan toksikan
dan bukan merupakan mikroorganisme patogen.
 Mikroorganisme yang masuk dalam kategori GRAS yaitu Bacillus
subtilis, B. licheniformis, Saccharomyces cerevisiae, Aspergillus niger
dan A. oryzae.
Isolasi enzim

 Sel mengandung ribuan protein

 Prosedur pemurnian harus membedakan
protein yang diinginkan dari protein yang
lain
 Sifat protein merupakan kunci dalam
merancang prosedur pemurnian
 ENZIM, berdasarkan tempat
melakukan aktivitas
 Ekstraseluler:
enzim yang dihasilkan oleh mahkluk hidup. Kerjanya
diluar sel. Tidak perlu dilakukan pemecahan dinding sel
 Intraseluler:
enzim yang dihasilkan oleh mahkluk hidup. Digunakan
untuk melakukan aktivitas di dalam sel. Untuk
mengeluarkan harus dilakukan pemecahan dinding sel.
 Enzim
ekstraseluler
Sel + media pertumbuhan

Sentrifugasi

Pelet sel Supernatan

(buang) Protein terlarut

Isolasi Enzim
Enzim Sel
intraseluler
Lisis / pemecahan dinding sel
Osmosis (+ zat kimia)
Freeze/Thaw/ beku-cair cepat
Grinding glass beads/digerus
Sonication (suara tinggi)

Sentrifugasi

Pelet Supernatan
Debris sel
Protein terlarut

Isolasi Enzim
 Isolasi dan Presipitasi Protein

Homogenat
Homogenat Supernatan
Supernatan Presipitat
Presipitat

Larutan keruh : Fase cair : Memisahkan

• Debris Sel • Makromolekul protein
• Organel sel BM <<< berdasarkan
• Makromolekul • Organel terlarut kelarutannya thd
penyusun sel dlm buffer amonium sulfat
Stabilisasi: Ketika berada diluar lingkungan
aslinya), protein menjadi kurang stabil. Meskipun
organisme hidup pada temperatur 37oC, pemurnian
dilakukan pada temperatur 4oC
 Fraksinasi amonium sulfat

 Fraksinasi dengan amonium sulfat

 Garam berkompetisi
Fraksinasi enzim dilakukan dengan
dengan air menambahkan garam amonium sulfat
 + amonium sulfat dengan berbagai tingkat kejenuhan.
(NH4)2SO4  Penambahan senyawa elektrolit ke
dalam larutan enzim akan menyebabkan
menurunnya kelarutan enzim, sehingga
terbentuk endapan dari protein enzim.
 Jika suatu garam yang kelarutannya
dalam air sangat besar seperti amonium
sulfat ditambahkan ke dalam larutan
protein, maka terjadi kompetisi antara
garam tersebut dan protein untuk dapat
larut dalam air.
Endapan protein enzim hasil fraksinasi dimurnikan dengan
dialisis.
Proses dialisis ini bertujuan untuk memisahkan protein enzim
dari garam-garam dan ion-ion
Dialisis adalah proses perpindahan molekul terlarut dari suatu
campuran larutan yang terjadi akibat difusi pada membran semi-
permeabel. Molekul terlarut yang berukuran lebih kecil dari pori-
pori membran tersebut dapat keluar, sedangkan molekul lainnya
yang lebih besar akan tertahan di dalam kantung membran.
Strategi Pemurnian
 Muatan: Kromatografi Penukar Ion
 Kepolaran: Kromatografi Interaksi Hidrofobik
 Ukuran: Dialisis, Ultrafiltrasi, Gel elektroforesis,
Kromatografi Filtrasi Gel, Ultrasentrifugasi
 Spesifisitas: Kromatografi afinitas
Ion-exchange Chromatography (IEX)

 Cation exchangers
contain negatively
charged polymer
 Anion exchangers
contain positively
charged polymer.
 Is effected by pH
Gel Filtration/Size Exclusion
Chromatography
 Kromatografi Interaksi
Hidrofobik
 Protein mempunyai ‘daerah’
hidrofobik dipermukaan yang
dapat berinteraksi dengan
resin
 Resin yang mengandung
gugus fenil atau alifatik
mengikat protein: protein yang
paling hidrofobik akan terikat
paling kuat
 Elusi dilakukan dengan pelarut
yang kurang polar atau
dengan menurunkan [garam]
Pemisahan protein (molekul protein +
logam berikatan dengan matrik), sehingga
protein dapat terpisah
 Elektroforesis SDS-PAGE
 Pemisahan protein
(molekul bermuatan
berdasarkan ukuran
dalam medan listrik
 Protein didenaturasi
dengan detergen anion
Penentuan Massa Molekul Protein
Analisa Tingkat Kemurnian dengan
SDS-PAGE

1. Ekstrak kasar
2. Pengendapan dengan garam
3. Kromatografi penukar ion
4. Kromatografi filtrasi gel
5. Kromatografi afinitas

10μg protein/lajur