PERCOBAAN 3

ISOLASI, IDENTIFIKASI, DAN KONFIRMASI MIKROBA

I. Tujuan Percobaan
1.1. Mengamati pertumbuhan bakteri tertentu yang diinokulasi pada media spesifik
yang digunakan.
1.2. Mengamati perubahan yang terjadi pada media spesifik yang diinokulasi
bakteri.

II. Teori Dasar

2.1. Isolasi
Isolasi adalah mengambil mikroorganisme yang terdapat di alam dan
menumbuhkannya dalam suatu medium buatan. Prinsip dari isolasi mikroba adalah
memisahkan satu jenis mikroba dengan mikroba lainnya yang berasal dari campuran
bermacam-macam mikroba. Hal ini dapat dilakukan dengan menumbuhkannya dalam
media padat sel-sel mikroba akan membentuk suatu koloni sel yang tetap pada
tempatnya (Sutedjo, 1996).
Bila digunakan media cair, sel-sel mikroba sulit dipisahkan secara individu
karena terlalu kecil dan tidak tetap tinggal di tempatnya. Akan tetapi bila sel-sel itu
dipisahkan dengan cara pengenceran, kemudian ditumbuhkan dalam media padat dan
dibiarkan membentuk koloni, maka sel-sel tersebut selanjutnya dapat diisolasi dalam
tabung-tabung reaksi atau cawan petri-cawan petri yang terpisah (Sutedjo, 1996).
2.2. Metode Isolasi
Ada berbagai cara untuk mengisolasi bakteri dalam biakan murni yaitu, cara
pengenceran, cara penuangan, cara penggesekan, atau penggoresan, setiap masing-
masing cara mempunyai kelebihan dan kekurangan (Waluyo, 2007).
2.2.1. Isolasi Tunggal
 Merupakan metode isolasi dengan cara meneteskan bahan yang mengandung
mikroorganisme pada suatu kaca penutup dengan menggunakan mikropipet, yang
kemudian diteliti dibawah obyektif mikroskop (Dwidjoseputro, 1998).
2.2.2. Isolasi Gores
Merupakan metode isolasi dengan cara menggeser atau menggoreskan ujung
jarum ose yang telah mengandung mikroorganisme dengan hati-hati di atas
permukaan agar secara zig zag yang dimulai dari dasar tabung menuju ke bagian
atas tabung. (Dwidjoseputro, 1998).
Metode goresan untuk menghasilkan koloni-koloni bakteri yang terpisah
dengan baik dari suspensi sel yang pekat (Nuniek. 2001).
2.2.3. Isolasi Tebar
Merupakan metode isolasi dengan cara menebarkan bahan yang mengandung
mikroorganisme pada permukaan atas tabung (Dwidjoseputro, 1998).
Metode tebar dengan media agar diinokulasi dalam keadaan tetap cair pada
suhu 45oC, dan koloni-koloni akan berkembang diseluruh media. Tidak hanya pada
permukaan. Untuk beberapa tujuan hal ini menguntukan, contohnya dalam
memperlajari pertumbuhan Kololoni Streptococcal pada sel darah merah (Nuniek,
2001).
2.2.4. Isolasi Tuang
Merupakan metode isolasi dengan cara mengambil sedikit sampel campuran
bakteri yang telah diencerkan dan sampel tersebut kemudian disebarkan didalam
suatu medium dari kaldu dan gelatin encer (Dwidjoseputro, 1998).
2.3. Faktor-Faktor yang mempengaruhi isolasi
1. Sifat dan jenis mikroorganisme
2. Habitat mikroorganisme
3. Medium pertumbuhan
4. Cara menginokulasi dan inkubasi
5. Cara mengidentifikasi bakteri
6. Cara pemeliharaannya (Dwidjoseputro, 1998)
2.4. Media yang digunakan
2.4.1. Mac Conkey Agar (MCA)
Agar Mac Conkey Menghambat pengaruh kristal ungu terhadap pertumbuhan
bakteri Gram positif, selanjutnya bakteri Gram-negatif dapat diisolasi. Medium
dilengkapi dengan karbohidrat (laktosa), garam empedu, dan neutral red sebagai pH
indikator yang mampu membedakan bakteri enterik sebagai dasar kemampuannya
untuk memfermentasi laktosa, media ini termasuk pada media selektif (Kusnadi,
2003).
2.4.2. Vogel Jonson Agar (VJA)
Vogel Jonson Agar, mengandung manitol, tellurite dan lithium chloride yang
berperan untuk mengisolasi bakteri yang bersifat koagulase positip, karena semua
yang bersifat koagulase positip akan tumbuh pada media ini. S. aureus mempunyai
koloni hitam sebagai akibat pengendapan hasil reduksi tellurite. Media di sekitar
koloni akan berubah menjadi kuning akibat fermentasi mannitol. Adanya lithium
chloride: sangat bermanfaat untuk menghambat pertumbuhan bakteri lain termasuk E.
coli. Namun demikian media ini kurang mampu memilah S. aureus karena semua
koagulase positip dapat tumbuh termasuk S. epidermidis dan Proteus (Waluyo,
2004).
2.4.3. Media Cetrimide Agar
Cetrimide Agar, biasanya digunakan untuk isolasi Pseudomonas. Kandungan
cetrimide yang merupakan quarternary ammonium merupakan senyawa yang dapat
menghambat pertumbuhan bakteri lan, karena menyebabkan kebocoran unsur-unsur
didalam sel, namun tidak terjadi pada Pseudomonas (Waluyo, 2004).
2.4.4. Media Simmon Sitrat (Simmon Citrate)
Simmon Sitrat atau nama lainnya Simmons Citrate Medium mengandung
amonium dihidrogen fosfat, natrium klorida, natrium sitrat, magnesium sulfat, agar,
bromtimol biru, aquades dan memiliki pH 6,9 (Waluyo, 2004).
2.4.5. Triple Sugar Iron Agar (TSIA)
 TSIA (Triple Sugar Iron Agar medium), biasanya digunakan untuk konfirmasi
pengujian E. coli dan dapat digunakan untuk identifikasi bakteri gram negatif yang
memfermentasi dekstrosa/laktosa/sukrosa dan produksi H2S. Dari fungsi tersebut
media ini dapat diusulkan untuk konfirmasi Salmonella dan memilahkan dari
Pseudomonas yang tumbuh pada media lain BSA dan BGA. Terjadinya fermentasi
dekstrosa oleh Salmonella akan menurunkan pH menjadi asam. Kondisi ini akan
menyebabkan perubahan phenol red (media merah) menjadi kuning. Sedangkan
Pseudomonas karena tidak mampu memfermentasi dekstrosa, maka media akan tetap
berwarna merah. Dengan demikian media ini dapat dengan mudah memilah
Salmonella dari Pseudomonas (Waluyo, 2004).
2.5. Bakteri
2.5.1. Bakteri Gram Negatif
Bakteri gram negatif adalah bateri yang tidak mempertahankan zat warna metil
ungu pada metode pewarnaan gram. Bakteri gram positif akan mempertahankan
warna ungu gelap setelah dicuci dengan alkohol, sementara bakteri gram negative
tidak (Rudi, 2010).
Bakteri E.coli merupakan bakteri Gram negatif bersifat anaerob fakultatif dan
tidak dapat membentuk spora. Bakteri ini dapat hidup pada berbagai substrat dengan
melakukan fermentasi anaerobik menghasilkan asam laktat, suksinat, asetat, etanol,
dan karbondioksida. E. coli termasuk family Enterobacteriaceae, bentuknya batang
atau koma, terdapat tunggal atau berpasangan dalam rantai pendek. (Whittam., et al,
2011).
Bakteri Pseudomonas aeruginosa merupakan bakteri yang tergolong bakteri
gram negatif dan dapat muncul dalam bentuk tunggal, berpasangan atau kadang-
kadang dalam bentuk rantai pendek (Whittam., et al, 2011).
3.5.2. Bakteri Gram Positif
Bakteri gram positif adalah bakteri yang mempertahankan zat warna metil ungu
sewaktu proses pewarnaan. Bakteri jenis ini akan berwarna ungu dibawah mikroskop,
sedangkan gram negatif akan berwarna merah muda. Perbedaan klasifikasi antara
kedua jenis bakter ini terutama berdasarkan pada perbedaan struktur dinding sel
bakteri (Rudi, 2010).
Bakteri Staphylococcus aureus merupakan bakteri Gram positif berbentuk bulat
berdiameter 0,7-1,2 μm, tersusun dalam kelompok-kelompok yang tidak teratur
seperti buah anggur, fakultatif anaerob, tidak membentuk spora, dan tidak bergerak.
Bakteri ini tumbuh pada suhu optimum 37ºC, tetapi membentuk pigmen paling baik
pada suhu kamar (20-25ºC). Koloni pada perbenihan padat berwarna abu-abu sampai
kuning keemasan, berbentuk bundar, halus, menonjol, dan berkilau (Jawetz et al.,
2008).
Streptococcus Merupakan bakteri gram-positif berbentuk bulat yang
mempunyai pasangan atau rantai pada pertumbuhannya. Beberapa streptococcus
merupakan flora normal manusia tetapi lainnya bisa bersifat patogen pada manusia.
Ada 20 spesies diantaranya; Streptococcus pyogenes, Streptococcus agalactiae, dan
jenis Enterococcus (Jawetz et al., 2008).

III. Alat dan Bahan

Alat Bahan
Bunsen Media Mac Conkey Agar (MCA),
Inkubator 37oC Vogel Jonson Agar (VJA), Cetrimide
Ose bundar dan lurus Agar (CA), Simmon sitrat, dan Triple
Pipet ukur 5 dan 10 ml Sugar Iron Agar (TSIA).
Pulpen pengganjal agar miring Suspensi bakteri; S. aureus, P.
Rak tabung reaksi aeruginosa, E. coli, dan B. subtilis.
Tabung reaksi steril

IV. Prosedur
4.1. Pembuatan media MCA
 Serbuk MCA 12,5 gram dimasukan kedalam erlenmayer, lalu ditambahkan
akuades sebanyak 250 ml dipanaskan menggunakan hotplate, dan dimasukan
magnetic stirrer, ditunggu sampai medidih dan homogen. Kemudian ditutup dengan
kapas berlemak, alumunium foil, dan diikat dengan benang kasur. Dimasukkan
kedalam autoklaf, kemudian dimasukan kedalam lemari pendingin. Jika media MCA
dipakai dipanaskan terlebih dahulu dengan menggunakan magnetic stirrer.
4.2. Pembuatan media CA
Serbuk CA 13,5 gram dimasukan kedalam erlenmayer, lalu ditambahkan
akuades sebanyak 100 ml dipanaskan menggunakan hotplate, dan dimasukan
magnetic stirrer, ditunggu sampai medidih dan homogen. Kemudian ditutup dengan
kapas berlemak, alumunium foil, dan diikat dengan benang kasur. Dimasukkan
kedalam autoklaf, kemudian dimasukan kedalam lemari pendingin. Jika media CA
dipakai dipanaskan terlebih dahulu dengan menggunakan magnetic stirrer.
4.3. Pembuatan media Simmon sitrat
Serbuk Simmon sitrat 2,25 g dimasukan kedalam erlenmayer, lalu ditambahkan
akuades sebanyak 100 ml dipanaskan menggunakan hotplate, dan dimasukkan
magnetic stirrer, ditunggu sampai medidih dan homogen. Kemudian ditutup dengan
kapas berlemak, alumunium foil, dan diikat dengan benang kasur. Dimasukkan
kedalam autoklaf, kemudian dimasukkan kedalam lemari pendingin. Jika media
Simmon sitrat dipakai dipanaskan terlebih dahulu dengan menggunakan magnetic
stirrer.
4.4. Pembuatan media TSIA
Serbuk TSIA 6,5 g dimasukan kedalam erlenmayer, lalu ditambahkan akuades
sebanyak 100 ml dipanaskan menggunakan hotplat, dan dimasukan magnetic stirrer,
ditunggu sampai medidih dan homogen. Kemudian ditutup dengan kapas berlemak,
alumunium foil, dan diikat dengan benang Kasur. Dimasukan kedalam autoklaf,
kemudian dimasukkan kedalam lemari pendingin. Jika media TSIA dipakai
dipanaskan terlebih dahulu dengan menggunkan magneti stirrer.
4.5. Percobaan Isolasi
 Dibuat media MCA, VJA, dan CA dalam bentuk plat agar, dan media simmon
sitrat dan TSIA dalam bentuk agar miring. Kemudian masing-masing media dicatat
dan didokumentasikan warnanya sebelum diinokulasikan bakteri. Diinokulasikan
masing-masing suspensi bakteri pada media MCA, VJA,CA, Simmon sitrat, dan
TSIA. Kemudian di inkubasi seluruh kultur bakteri pada inkubator bersuhu 37oC.

V. Data Pengamatan
VI. Pembahasan
VII. Kesimpulan
7.1. Isolasi mikroba adalah upaya pembiakan suatu jenis mikroba tertentu yang
diperoleh dari suatu sampel di dalam suatu media yang spesifik.
7.2. Identifikasi mikroba adalah suatu proses yang bertujuan untuk mengetahui
struktur, sifat, morfologi, warna, dan koloni suatu mikroba.
7.3. Konfirmasi mikroba merupakan upaya validasi.
7.4. Setelah diinkubasi selama satu hari, bakteri Staphylococcus aureus (gram
positif) pada media MCA tidak terjadi perubahan pada warna media dan tidak
terlihat adanya koloni bakteri yang tumbuh. Hal ini sudah sesuai literatur.
7.5. Setelah diinkubasi selama satu hari, bakteri Escherichia coli (gram negatif)
pada media MCA tidak terjadi perubahan pada warna media dan tidak terlihat
adanya koloni bakteri yang tumbuh, seharusnya bakteri dapat tumbuh di media
ini yang ditandai dengan perubahan warna media menjadi merah muda. Hal ini
tidak sesuai literatur.
7.6. Setelah diinkubasi selama satu hari, bakteri Staphylococcus aureus (gram
positif) pada media VJA tidak terjadi perubahan pada warna media dan koloni
bakteri berwarna putih tumbuh pada permukaan atas, seharusnya warna media
berubah menjadi kuning dan koloni bakteri berwarna hitam. Hal ini tidak sesuai
literatur.
7.7. Setelah diinkubasi selama satu hari, bakteri Escherichia coli (gram negatif)
pada media VJA tidak terjadi perubahan pada warna media dan tidak terlihat
adanya koloni bakteri yang tumbuh. Hal ini sudah sesuai literatur.
7.8. Setelah diinkubasi selama satu hari, bakteri Staphylococcus aureus (gram
positif) dan Escherichia coli (gram negatif) pada media Simmon sitrat tidak
terjadi perubahan pada warna media dan tidak terlihat adanya koloni bakteri
yang tumbuh. Hal ini sudah sesuai literatur.
7.9. Setelah diinkubasi selama satu hari, bakteri Staphylococcus aureus (gram
positif) pada media TSIA tidak terjadi perubahan pada warna media dan tidak
 terlihat adanya koloni bakteri yang tumbuh, seharusnya warna koloni dan media
menjadi kuning. Hal ini tidak sesuai literatur.
8.0. Setelah diinkubasi selama satu hari, bakteri Escherichia coli (gram negatif)
pada media TSIA tidak terjadi perubahan pada warna media dan tidak terlihat
adanya koloni bakteri yang tumbuh, seharusnya bakteri tersebut tumbuh baik
pada media ini. Hal ini tidak sesuai literatur.
 Daftar Pustaka

Dwidjoseputro, D. (1994). Dasar-Dasar Mikrobiologi. Jakarta: Djambatan.

Jawetz, E., Melnick, J. L., Adelberg, E. A. (2008). Mikrobiologi kedokteran. Jakarta:
Penerbit Salemba Medika.
Kusnadi, dkk. (2003). Mikrobiologi. Malang: JICA.
Nuniek. (2001). Mikrobiologi Industri. Jakarta: Teknik Kimia FTI-ITS.
Rudi. (2010). Bakteri Gram dan Pewarnaannya. Makassar: Wordpress.
Sutedjo, M., dkk. (1996). Mikrobiologi Tanah. Jakarta: Penerbit Rineka Cipta.
Waluyo, L. (2004). Mikrobiologi Umum, Malang: UMM press.
Waluyo, L. (2007). Mikrobiologi Umum. Malang: UPT Penerbit UMM.
Whittam, T.S. et. al. (2011). Pathogenesis and evolution of virulence in
enteropathogenic and enterohemorrhagic Escherichia coli, J. Clin.
Invest.107;539–548.