REVIEW JURNAL PEMURNIAN PROTEIN

Dosen Pengampu :
Jena Hayu W., M. Farm., Apt

Disusun oleh :

Verdy Napitupulu(24185515A)

UNIVERSITAS SETIA BUDI

SURAKARTA
2019
I. Pendahuluan
Pada akhir-akhir ini, penelitian tentang kestabilan enzim sangat menarik
perhatian karena kaitannya dengan pengembangan industri, khususnya
industri deterjen, sirup gula cair dari pati, sintesis senyawa organik, pulp dan
kertas, pakan ternak, dan pada penanganan buangan industri1. Hingga saat
ini sebagian besar enzim yang digunakan dalam industri di Indonesia masih
diimpor. Keadaan ini tentunya sangat merugikan jika ditinjau secara ekonom
i, padahal Indonesia merupakan negara tropis yang kaya akan sumber alam
hayati, terutama mikroba penghasil enzim , termasuk protease. Melihat
kondisi ini sangatlah penting untuk mengembangkan teknik produksi,
pemurnian dan teknik untuk meningkatkan kestabilan enzim , sehingga dapat
memenuhi tuntutan industri agar tidak selalu tergantung pada sumber dari
luar negeri.

Berdasarkan hasil-hasil yang telah dilaporkan tersebut, maka pada

penelitian ini dipilih memproduksi, mengisolasi dan memurnikan enzim
protease dari bakteri isolat lokal Bacillus subtilis ITBCCB148 yang bersifat
mesofilik. Dengan dikuasainya teknik produksi, isolasi dan pemurnian, maka
tujuan utama penelitian ini untuk mendapatkan enzim yang stabil terhadap
suhu dan pH dapat dilakukan, sehingga enzim hasil isolasi dan pemurnian
dapat digunakan dalam industri yang dapat menunjang kemajuan
pembangunan dan institusi. Enzim hasil pemurnian dapat dimodifikasi untuk
meningkatkan kestabilannya. Selanjutnya enzim hasil pemurnian dengan
aktivitas dan tingkat kemurnian yang tinggi juga dapat digunakan untuk
mempelajari struktur enzim terutama struktur primernya untuk menunjang
kemajuan ilmu pengetahuan dan teknologi.
II. Metode Penelitian

Tahapan penelitian yang akan dilakukan adalah sebagai berikut :

a. Produksi enzim protease

Tahap produksi protease meliputi : penentuan lama waktu
inkubasi untuk mendapatkan enzim dengan aktivitas tertinggi, penentuan
suhu optimum , dan penentuan pH optimum media fermentasi. Media
fermentasi yang digunakan adalah media yang mengandung pepton 0,5%,
ekstrak ragi 0,15%, glukosa 0,036%, dan NaCl 0,25%.
b. Isolasi dan pemurnian enzim protease

Isolasi dan pemurnian dilakukan beberapa tahap, yaitu : pem

isahan cairan enzim dari sel dengan sentrifuga dingin sehingga diperoleh
ekstrak kasar enzim , pengendapan dengan garam amonium sulfat dengan
berbagai tingkat kejenuhan, kromatografi kolom penukar ion, dan
kromatografi kolom penyaringan molekul

c. Uji aktivitas protease dan penentuan kadar protein

Pengujian aktivitas protease dilakukan dengan metode Kunitz modifikasi

Kadar protein ditentukan dengan metode Lowry

d. Karakterisasi enzim hasil pemurnian

Karakterisasi enzim hasil pemurnian meliputi: penentuan pH dan suhu

optimum, dan penentuan data kinetika.

e. Penentuan pH dan suhu optimum enzim hasil pemurnian

Untuk mencari pH optimum enzim sebelum dan sesudah modifikasi
digunakan bufer fosfat 0,1 M dengan pH bervariasi, yaitu 5,0; 5,5; 6,0;
6,5; 7,0; 7,5; 8,0; 8,5; dan 9,0. Suhu dijaga tetap pada suhu optimum yang
 telah ditentukan. Sedangkan untuk mencari suhu optimum, digunakan
suhu yang bervariasi, yaitu 40, 45; 50; 55; 60; 65; 70 dan 75 C.
f. Penentuan data kinetika enzim hasil pemurnian
Konstanta M ichaelis-Menten (Km) dan laju reaksi maksimum (Vmaks)
enzim sebelum dan sesudah modifikasi ditentukan dari persamaan
Lineweaver-Burk.

III. Pembahasan

A. Produksi Enzim Protease

a. Penentuan suhu, dan waktu panen

Gambar 1 menunjukkan hubungan antara lama waktu pertumbuhan bakteri

terhadap aktivitas enzim protease yang dihasilkan. Grafik tersebut
menunjukkan bahwa suhu optimum pertumbuhan bakteri untuk
mendapatkan enzim protease dengan aktivitas maksimum adalah pada suhu
35 C. Sedangkan lama waktu pertumbuhan bakteri untuk mendapatkan
enzim dengan aktivitas optimum adalah jam ke-60. Aktivitas enzim pada
jam ke-60 adalah 0,23 U/mL. Aktivitas enzim pada suhu 32 C tidak
berbeda jauh dengan aktifitas enzim pada suhu 35 0C. Sedangkan aktivitas
enzim pada suhu 37 C sangat kecil sekali dibandingkan kedua suhu
tersebut, ini menunjukkan pertumbuhan bakteri sudah tidak berlangsung
dengan baik sehingga enzim protease tidak dapat dihasilkan secara optimal.
Gambar 1. Kurva hubungan antara lama waktu pertumbuhan bakteri terhadap
aktivitas enzim protease yang diproduksi pada berbagai suhu

b. Penentuan pH optimum

Penentuan pH optimum media, untuk menghasilkan enzim protease dengan

aktivitas optimum dilakukan dengan memvariasikan pH media fermentasi yaitu:
5,0; 6,0; 7,0; dan 8,0. Suhu fermentasi yang digunakan 35oC. Grafik pada
Gambar 2 menunjukkan hubungan antara lama waktu pertumbuhan bakteri
dengan aktivitas enzim protease yang dihasilkan pada berbagai pH media
fermentasi. Grafik tersebut menunjukkan enzim protease dengan aktivitas
optimum dihasilkan pada media fermentasi dengan pH 7,0. Aktivitas enzim pada
pH tersebut dengan lama waktu inkubasi 60 jam adalah 0,304 U/mL.
Gambar 2. Kurva hubungan antara lama waktu pertumbuhan bakteri terhadap
aktivitas enzim protease yang diproduksi pada berbagai pH

B. Isolasi dan Pemurnian Enzim Protease

a. Fraksinasi dengan garam amonium sulfat
Gambar 3 menunjukkan hubungan antara kejenuhan amonium
sulfat dengan aktivitas spesifik enzim yang menunjukkan enzim
protease mempunyai aktivitas tertinggi pada fraksi 50-65% dengan
aktivitas spesifik 0,55 U/mg.

Gambar 3. Hubungan antara kejenuhan amonium sulfat dengan aktivitas

spesifik enzim protease
b. Kromatografi penukar kation CM-Sephadex C-50
Pola protein (A280 ) dan aktivitas (U/mL) enzim protease hasil
kromatografi kolom CM-Sephadex C-50 dapat dilihat pada Gambar 4.
Gambar 4 menunjukkan aktivitas enzim protease terletak pada puncak
protein nomor 3 yaitu pada fraksi ke 16 dan 17 . Aktivitas enzim
tertinggi terdapat pada fraksi nomor 17 dengan aktivitas unit sebesar
2,10 U/mL.

Gambar 4. Kromatogram enzim protease dari Bacillus subtilis

ITBCCB148 pada kolom CM-Sephadex C-50

c. Kromatografi kolom penyaringan molekul Sephadex G-100

Pemurnian enzim dengan kromatografi kolom penyaringan
molekul Sephadex G-100 menggunakan bufer fosfat 0,05 M , pH 7,0
sebagai bufer elusi. Pola protein (A280) dan aktivitas enzim protease
hasil kromatografi kolom Sephadex G-100 dapat dilihat pada Gambar 5.
Gambar 5 menunjukkan dari 4 puncak protein yang diperoleh hanya
satu puncak protein nomor 3 yang beraktivitas enzim protease, yaitu
fraksi 13 sampai fraksi ke-18 dengan aktivitas tertinggi pada fraksi ke
16 dengan aktivitas 0,25 U/mL
Gambar 5. Kromatogram enzim protease dari Bacillus subtilis
ITBCCB148 pada kolom filtrasi Sephadex G-100.

Tabel tahapan pemurnian enzim protease dari Bacillus subtilis

ITBCCB148 dapat dilihat pada Tabel 1. Data pada Tabel 1 menunjukkan
terjadi peningkatan aktivitas spesifik enzim yang tinggi untuk masing-
masing tahap pemurnian, terutama hasil kromatografi kolom Sephadex
G-100. Peningkatan aktivitas spesifik enzim pada tahap pemurnian
dengan fraksinasi amonium sulfat adalah 19 x ; 245 x pada pemurnian
dengan kromatografi kolom CM-Sephadex C-5; dan 263 x pada
pemurnian dengan kromatografi kolom Sephadex G-100. Hasil ini
menunjukkan pemurnian yang dilakukan telah berhasil mendapatkan
enzim protease hasil pemurnian dengan tingkat kemurnian yang tinggi.
C. Karakterisasi Enzim Protease Hasil Pemurnian

a. Penentuan pH optimum enzim protease hasil pemurnian

Aktivitas enzim protease hasil pemurnian Bacillus subtilis ITBCCB148
pada berbagai pH dapat dilihat pada Gambar 6 yang menunjukkan pH
optimum enzim protease hasil pemurnian 7,5 dengan aktivitas 0,102
(U/mL). Enzim protease ini termasuk enzim protease netral. Data pada
gambar juga menunjukkan enzim protease mengalam i penurunan
aktivitas pada pH 8 dan mengalami penurunan aktivitas yang tinggi
pada pH 8,5.0

Gambar 6. Kurva hubungan antara pH dengan aktivitas enzim protease

hasil pemurnia

b. Penentuan suhu optimum enzim protease hasil pemurnian

Aktivitas enzim protease hasil pemurnian dari Bacillus subtilis
ITBCCB148 pada berbagai suhu dapat dilihat pada Gambar 7. Suhu
optimum enzim protease hasil pemurnian berdasarkan gambar tersebut
60 C, dengan aktivitas 0,91 U/mL. Enzim protease ini termasuk enzim
yang bersifat termostabil.
 Gambar 7. Kurva hubungan antara suhu dengn aktivitas enzim protease
hasil pemurnian

c. Penentuan data kinetika enzim protease hasil pemurnian

Kurva penentuan harga Km dan Vmaks enzim protease hasil pemurnian
Bacillus subtilis ITBCCB148 dapat dilihat pada Gambar 8. Dari
persamaan Lineweaver-Burk diperoleh harga Vmaks enzim hasil
pemurnian 3,26 U/mL, sedangkan Km enzim hasil pemurnian 6,48

mg/mL substrat.

Gambar 8. Kurva Lineweaver-Burk enzim protease hasil pemurnian

 IV. Kesimpulan

Aktivitas spesifik enzim protease hasil pemurnian 65,8 U/mg protein,

meningkat 263 kali dibandingkan dengan ekstrak kasar enzim yang mempunyai
aktivitas spesifik 0,25 U/mg protein. Pemurnian enzim telah berhasil
mendapatkan enzim dengan aktivitas dan tingkat kemurnian yang tinggi. Enzim
protease hasil pemurnian mempunyai pH optimum 7,5 dan stabil pada rentang
pH 5,0 8,0. Enzim ini termasuk enzim yang dapat bekerja pada rentang pH yang
cukup lebar dan memenuhi syarat untuk penggunaan dalam industri. Suhu
optimum eanzim protease hasil pemurnian adalah 60 C; termasuk enzim yang
bersifat termostabil dan dapat digunakan dalam proses industri. N ilai Km enzim
hasil pemurnian adalah 6,48 mg /mL substrat, dan Vmaks 3,26 U/ mL/ menit,
enzim ini mempunyai afinitas yang tinggi terhadap substrat.