ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay)

1. Pengertian ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay)

Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA) adalah suatu teknik biokimia yang
terutama digunakan dalam bidang imunologi untuk mendeteksi kehadiran antibodi atau
antigen dalam suatu sampel. ELISA telah digunakan sebagai alat diagnostik dalam
bidang medis, patologi tumbuhan, dan juga berbagai bidang industri. Dalam pengertian
sederhana, sejumlah antigen yang tidak dikenal ditempelkan pada suatu permukaan,
kemudian antibodi spesifik dicucikan pada permukaan tersebut, sehingga akan berikatan
dengan antigennya. Antibodi ini terikat dengan suatu enzim, dan pada tahap terakhir,
ditambahkan substansi yang dapat diubah oleh enzim menjadi sinyal yang dapat
dideteksi. Dalam ELISA fluoresensi, saat cahaya dengan panjang gelombang tertentu
disinarkan pada suatu sampel, kompleks antigen/antibodi akan berfluoresensi sehingga
jumlah antigen pada sampel dapat disimpulkan berdasarkan besarnya fluoresensi.

2. Jenis-Jenis Metode ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay)

Secara umum, teknik ELISA dibedakan menjadi dua jenis, yaitu teknik ELISA
kompetitif yang menggunakan konjugat antigen-enzim atau konjugat antibodi-enzim,
dan teknik ELISA nonkompetitif yang menggunakan dua antibodi (primer dan
sekunder). Pada teknik ELISA nonkompetitif, antibody kedua (sekunder) akan
dikonjugasikan dengan enzim yang berfungsi sebagai signal. Teknik ELISA
nonkompetitif ini seringkali disebut sebagai teknik ELISA sandwich.
Dewasa ini, teknik ELISA telah berkembang menjadi berbagia macam jenis
teknik. Perkembangan ini didasari pada tujuan dari dilakukannya uji dengan teknik
ELISA tersebut sehingga dapat diperoleh hasil yang optimal. Berikut ini adalah
beberapa macam teknik ELISA yang relatif sering digunakan:
a. ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) DIRECT
Teknik ELISA ini merupakan teknik ELISA yang paling sederhana. Teknik ini
seringkali digunakan untuk mendeteksi dan mengukur konsentrasi antigen pada sampel
ELISA direct menggunakan suatu antibody spesifik (monoklonal) untuk mendetaksi
keberadaan antigen yang diinginkan pada sampel yang diuji. Pada ELISA direct,
pertama microtiter diisi dengan sampel yang mengandung antigen yang diinginkan,
sehingga antigen tersebut dapat menempel pada bagian dinding-dinding lubang
microtiter, kemudian microtiter dibilas untuk membuang antigen yang tidak menempel
pda dinding lubang microtiter. Lalu antibodi yang telah ditautkan dengan enzim signal
dimasukkan ke dalam lubang-lubang microtiter sehingga dapat berinteraksi dengan
antigen yang diinginkan, yang dilanjutkan dengan membilas microtiter untuk
membuang antibody tertaut enzim signl yang tidak berinteraksi dengan antigen.
Selanjutnya ke dalam lubang-lubang microtiter tersebut ditambahkan substrat yang
dapat bereaksi dengan enzim signal, sehingga enzim yang tertaut dengan antibodi yang
telah berinteraksi dengan antigen yang diinginkan akan berinteraksi dengan substrat dan
menimbulkan signal dapat dideteksi. Pendeteksian interaksi antara antibodi dengan
antigen tersebut selanjutnya dapat dihitung dengan menggunakan kolorimetri,
chemiluminescent, atau fluorescent end-point.
ELISA direct memiliki beberapa kelemahan, antara lain :
1) Immunoreaktifitas antibodi kemungkinan akan berkurang akibat bertaut dengan
enzim.
2) Penautan enzim signal ke setiap antibodi menghabiskan waktu dan mahal.
3) Tidak memiliki fleksibilitas dalam pemilihan tautan enzim (label) dari antibodi
pada percobaan yang berbeda.
4) Amplifikasi signal hanya sedikit.
5) Larutan yang mengandung antigen yang diinginkan harus dimurnikan sebelum
digunakan untuk uji ELISA direct.
Sedangkan kelebihan dari ELISA direct antara lain :
1) Metodologi yang cepat karena hanya menggunakan 1 jenis antibody.
2) Kemungkinan terjadinya kegagalan dalam uji ELISA akibat reaksi silang dengan
antibody lain (antibody sekunder) dapat diminimalisasi.

b. ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) INDIRECT

ELISA Indirect ini pada dasarnya juga merupakan teknik ELISA yang paling
sederhana, hanya saja dalam teknik ELISA indirect yang dideteksi dan diukur
konsentrasinya merupakan antibody. ELISA indirect menggunakan suatu antigen
spesifik (monoklonal) serta antibody sekunder spesifik tertaut enzim signal untuk
mendeteksi keberadaan antibody yang diinginkan pada sampel yang diuji.
 Tahap umum yang digunakan dalam ELISA indirect untuk mendeterminasi
konsentrasi antibodi dalam serum adalah:
1) Suatu antigen yang sudah dikenal dan diketahui konsentrasinya ditempelkan pada
permukaan lubang plate mikrotiter. Antigen tersebut akan menempel pada
permukaan plastik dengan cara adsorpsi. Sampel dari konsentrasi antigen yang
diketahui ini akan menetapkan kurva standar yang digunakan untuk mengkalkulasi
konsentrasi antigen dari suatu sampel yang akan diuji.
2) Suatu larutan pekat dari protein non-interacting, seperti bovine serum
albumin (BSA) atau kasein, ditambahkan dalam semua lubang plate mikrotiter.
Tahap ini dikenal sebagai blocking, karena protein serum memblok adsorpsi non-
spesifik dari protein lain ke plate.
3) Lubang plate mikrotiter atau permukaan lain kemudian dilapisi dengan sampel
serum dari antigen yang tidak diketahui, dilarutkan dalam buffer yang sama dengan
yang digunakan untuk antigen standar. Karena imobilisasi antigen dalam tahap ini
terjadi karena adsorpsi non-spesifik, maka konsentrasi protein total harus sama
dengan antigen standar.
4) Plate dicuci, dan antibodi pendeteksi yang spesifik untuk antigen yang diuji
dimasukkan dalam lubang. Antibodi ini hanya akan mengikat antigen terimobilisasi
pada permukaan lubang.
5) Antibodi sekunder yang akan mengikat sembarang antibodi pendeteksi,
ditambahkan dalam lubang. Antibodi sekunder ini akan berkonjugasi menjadi
enzim dengan substrat spesifik. Tahap ini bisa dilewati jika antibodi pendeteksi
berkonjugasi dengan enzim.
6) Plate dicuci untuk membuang kelebihan konjugat enzim-antibodi yang tidak
terikat.
7) Dimasukkan substrat yang akan diubah oleh enzim untuk mendapatkan sinyal
kromogenik/ fluorogenik/ elektrokimia.
8) Hasil dikuantifikasi dengan spektrofotometer, spektrofluorometer atau alat optik/
elektrokimia lainnya.
ELISA indirect memiliki beberapa kelemahan yakni membutuhkan waktu
pengujian yang relative lebih lama daripada ELISA direct karena ELISA indirect
membutuhkan 2 kali waktu inkubasi yaitu pada saat terjadi interaksi antara antigen
spesifik dengan antibody yang dinginkan dan antara antibody yang diinginkan dengan
antibody sekunder tertaut enzim signal, sedangkan pada ELISA direct hanya
membutuhkan 1 kali waktu inkubasi yaitu pada saat terjadi interaksi antara antigen yang
diinginkan dengan antibody spesifik tertaut enzim signal.
Sedangkan kelebihan dari ELISA indirect antara lain terdapat berbagai macam
variasi antibody sekunder yang terjual secara komersial di pasar, immunoreaktifitas
dari antibody yang diinginkan (target) tidak terpengaruh oleh penautan enzim signal ke
antibody sekunder karena penautan dilakukan pada wadah berbeda, dan tingkat
sensitivitas meningkat karena setiap antibody yang diinginkan memiliki beberapa epitop
yang bisa berinteraksi dengan antibody sekunder.

c. ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) SANDWICH

Teknik ELISA jenis ini menggunakan antibody primer spesifik untuk menangkap
antigen yang diinginkan dan antibody sekunder tertaut enzim signal untuk mendeteksi
keberadaan antigen yang diinginkan. Pada dasarnya, prinsip kerja dari ELISA sandwich
mirip dengan ELISA direct, hanya saja pada ELISA sandwich, larutan antigen yang
diinginkan tidak perlu dipurifikasi. ELISA sandwich lebih banyak dimanfaatkan untuk
mendeteksi keberadaan antigen multivalent yang kadarnya sangat rendah pada suatu
larutan dengan tingkat kontaminasi tinggi. Hal ini disebabkan ELISA sandwich
memiliki tingkat sensitivitas tinggi terhadap antigen yang diinginkan akibat keharusan
dari antigen tersebut untuk berinteraksi dengan kedua antibody. Terdapat beberapa
faktor yang mempengaruhi tingkat sensitivitas dari hasil pengujian, antara lain banyak
molekul antibodi penangkap yang berhasil menempel pada dinding-dinding microtiter.
Serta avinitas dari antibodi penangkap dan antibodi detector terhadap antigen
sebenarnya, teknik ELISA sandwich ini merupakan pengembangan dari teknik ELISA
terdahulu, yaitu ELISA direct.
Kelebihan teknik ELISA sandwich ini pada dasarnya berada pada tingkat
sensitivitasnya yang relatif lebih tinggi karena antigen yang diinginkan harus dapat
berinteraksi dengan dua jenis antibody, yaitu antibody penangkap dan antibody
detector, kemampuannya menguji sampel yang tidak murni, dan mampu mengikat
secara selektif antigen yang dikehendaki. Tanpa lapisan pertama antibodi penangkap,
semua jenis protein pada sampel (termasuk protein serum) dapat diserap secara
kompetitif oleh permukaan lempeng, menurunkan kuantitas antigen yang terimobilisasi.
Namun demikian, teknik ELISA sandwich ini juga memiliki kelemahan, yaitu
teknik ini hanya dapat diaplikasikan untuk medeteksi antigen yang bersifat multivalent
serta sulitnya mencari dua jenis antibody yang dapat berinteraksi antigen yang sama
pada sisi antigenic yang berbeda (epitopnya harus berbeda).

d. ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) Biotin Sterptavidin (Jenis

ELISA Modern)
Pada perkembangan selanjutnya, teknik ELISA sandwich ini juga dikembangkan
untuk mendeteksi antibody dengan tingkat sensitivitas relatif lebih tinggi. Teknik ini
dikenal sebagai teknik ELISA penangkap antibody, dimana prinsip kerjanya sama
dengan ELISA sandwich, hanya saja yang digunakan dalam teknik ini adalah antigen
penangkap dan antigen detector (antigen bertaut enzim signal, bersifat opsional apabila
antibody yang diinginkan tidak bertaut dengan enzim signal).
Contoh dari aplikasi teknik ini adalah teknik ELISA untuk mendeteksi vitamin
biotin yang bertaut dengan suatu antibody avidin dengan mengubah antibody avidin
menjadi antibody streptavidin, dimana satu molekul streptavidin dapat mengikat empat
molekul biotin (pengembangan dari ELISA indirect), sehingga signal yang
teramplifikasi menjadi semakin kuat akibat interaksi antara biotin dengan enzim yang
menjadi semakin banyak.

e. ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) MULTIPLEX

Teknik ELISA merupakan pengembangan teknik ELISA yang ditujukan untuk
pengujian secara simultan, sedangkan prinsip dasarnya mirip dengan teknik ELISA
terdahulu (ELISA Direct)

f. ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) COMPETITIVE

Teknik ELISA jenis ini juga merupakan pengembangan teknik ELISA terdahulu.
Prinsip dasar dari teknik ini adalah dengan menambahkan suatu competitor ke dalam
lubang mikrotiter. Teknik ELISA kompetitif ini dapat diaplikasikan untuk mendeteksi
keberadaan antigen atau antibody.
 Pada pendeteksian antigen, pertama mikrotiter diisi antibody spesifik yang dapat
berinteraksi dengan antigen yang diinginkan maupun antigen spesifik bertaut enzim
signal, sehingga antibody spesifik tersebut dapat menempel pada bagian dinding-
dinding lubang mikrotiter. Lalu larutan yang mengandung antigen spesifik yang telah
ditautkan dengan enzim signal dan larutan sampel yang mengandung antigen yang
diinginkan dimasukkan ke dalam lubang-lubang mikrotiter sehingga terjadi kompetisi
antara antigen spesifik bertaut enzim signal dengan antigen yang diinginkan untuk dapat
berinteraksi dengan antibody spesifik yang dilanjutkan dengan membilas mikrotiter
untuk membuang antigen spesifik tertaut enzim signal atau antigen yang tidak
berinteraksi dengan antibody spesifik. Kemudian kedalam lubang-lubang mikrotiter
tersebut ditambahkan substrat yang dapat bereaksi dengan enzim signal yang tertaut
pada antigen spesifik, sehingga enzim yang tertaut dengan antigen yang telah
berinteraksi dengan antibody spesifik akan bereaksi dengan substrat dan menimbulkan
signal yang dapat dideteksi. Pada proses pendeteksian ini, pendeteksian positif ditandai
oleh tidak adanya signal yang ditimbulkan, yang berarti bahwa antigen yang diinginkan
telah menang berkompetisi dengan antigen spesifik tertaut enzim signal dan berinteraksi
dengan antibody spesifik.
Sedangkan pada pendeteksian antibody, pertama mikrotiter diisi antigen spesifik
yang dapat berinteraksi dengan anti bodi yang diinginkan maupun antibody spesifik
tertaut enzim signal, sehingga antigen spesifik tersebut dapat menempel pada bagian
dinding-dinding mikrotiter, kemudian mikrotiter dibilas untuk membuang antigen
spesifik yang tidak menempel pada dinding-dinding mikrotiter. Lalu larutan yang
mengandung antibody spesifik yang telah ditautkan dengan enzim signal dan larutan
sampel yang mengandung antibody yang diinginkan dimasukkan ke dalam lubang-
lubang mikrotiter, sehingga terjadi kompetisi antara antibody spesifik tertaut enzim
signal dengan antibody yang diinginkan untuk dapat berinteraksi dengan antigen
spesifik, yang dilanjutkan dengan membilas mikrotiter untuk membuang antibody
spesifik tertaut enzim signal atau antibody yang tidak berinteraksi dengan antigen
spesifik.
Selanjutnya kedalam lubang-lubang mikrotiter tersebut ditambahkan substrat yang
dapat bereaksi dengan enzim signal yang tertaut pada antibody spesifik, sehingga enzim
yang tertaut dengan antibody yang telah berinteraksi dengan antigen spesifik akan
bereaksi dengan substrat dan menimbulkan signal yang dapat dideteksi. Pada proses
pendeteksian ini, pendeteksian positif juga ditandai oleh tidak adanya signal yang
ditimbulkan, yang berarti antibody yang diinginkan telah menang berkompetisi dengan
antibody spesifik tertaut enzim signal dan berinteraksi dengan antigen spesifik.
Dalam ELISA kompetitif, semakin tinggi konsentrasi antigen orisinal, semakin
lemah sinyal yang dihasilkan. Kelebihan dari teknik ELISA kompetitif ini adalah tidak
diperlukannya purifikasi terhadap larutan sampel yang mengandung antibody atau
antigen yang diinginkan, tapi hasil yang diperoleh tetap memiliki tingkat sensitivitas
tinggi akibat sifat spesitifitas dari antibody dan antigen.

3. Prinsip Kerja ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay)

Pertama antigen atau antibodi yang hendak diuji ditempelkan pada suatu
permukaan yang berupa microtiter. Penempelan tersebut dapat dilakukan melalui dua
cara, yaitu penempelan secara non spesifik dengan adsorbs ke permukaan microtiter,
dan penempelan secara spesifik dengan menggunakan antibody atau antigen lain yang
bersifat spesifik dengan antigen atau antibodi yang diuji (cara ini digunakan pada teknik
ELISA sandwich). Selanjutnya antibodi atau antigen spesifik yang telah ditautkan
dengan suatu enzim signal (disesuaikan dengan sampel => bila sampel berupa antigen,
maka digunakan antibodi spesifik , sedangkan bila sampel berupa antibodi, maka
digunakan antigen spesifik) dicampurkan ke atas permukaan tersebut, sehingga dapat
terjadi interaksi antara antibodi dengan antigen yang bersesuaian. Kemudian ke atas
permukaan tersebut dicampurkan suatau substrat yang dapat bereaksi dengan enzim
signal. Pada saat substrat tersebut dicampurkan ke permukaan, enzim yang bertaut
dengan antibodi atau antigen spesifik yang berinteraksi dengan antibodi atau antigen
sampel akan bereaksi dengan substrat dan menimbulkan suatu signal yang dapat
dideteksi. Pada ELISA flourescense misalnya, enzim yang tertaut dengan antibodi atau
antigen spesifik akan bereaksi dengan substrat dan menimbulkan signal yang berupa
pendaran flourescense.

4. Kelebihan dan Kekurangan ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay)

Teknik ELISA ini memiliki beberapa kelebihan, antara lain :
a. Teknik pengerjaan relatif sederhana
 b. Relatif ekonomis (karena jenis a antibodi yang digunakan hanya satu saja,
sehingga menghemat biaya untuk membeli banyak jenis antibodi)
c. Hasil memiliki tingkat sensitivitas yang cukup tinggi.
d. Dapat digunakan untuk mendeteksi keberadaan antigen walaupun kadar
antigen tersebut sangat rendah (hal ini disebabkan sifat interaksi antara
antibodi atau antigen yang bersifat sangat spesifik)
e. Dapat digunakan dalam banyak macam pengujian.
Sedangkan kekurangan dari teknik ELISA antara lain :
a. Jenis antibodi yang dapat digunakan pada uji dengan teknik ELISA ini hanya
jenis antibodi monoklonal (antibodi yang hanya mengenali satu antigen).
b. Harga antibodi monoklonal relatif lebih mahal daripada antibodi poliklonal,
sehingga pengujian teknik ELISA ini membutuhkan biaya yang relatif mahal.
c. Pada beberapa macam teknik ELISA, dapat terjadi kesalahan pengujian
akibat kontrol negatif yang menunjukkan respons positif yang disebabkan
inefektivitas dari larutan blocking sehingga antibodi sekunder atau antigen
asing dapat berinteraksi dengan antibodi bertaut enzim signal dan
menimbulkan signal.
d. Reaksi antara enzim signal dan substrat berlangsung relatif cepat, sehingga
pembacaan harus dilakukan dengan cepat (pada perkembangannya, hal ini
dapat diatasi dengan memberikan larutan untuk menghentikan reaksi).

DAFTAR PUSTAKA
Brahmana K. 1981. Immunologi, Serologi dan Tata Kerja Laboratorium. Medan.
Suryo. 1996. Genetika. Departemen P dan K Direktorat Jendral Pendidikan Tinggi. Jakarta.