1

ISOLASI PLASMID SEBAGAI VEKTOR KLONING Gα (SL16)

NINDA NINGTYAS
P051190091

SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2019
 1

1 PENDAHULUAN

Latar Belakang

DNA terbagi menjadi dua yaitu DNA kromosom dan DNA

ekstrakromosomal seperti DNA mitokondria, kloroplas dan plasmid. Plasmid
adalah DNA ektrakromosomal yang dapat bereplikasi secara mandiri dan
ditemukan dalam sel prokariot dan eukariot. Dalam sel bakteri plasmid biasanya
ada dalam bentuk superkoil, tetapi setelah dilakukan lisis alkali dan elektroforesis,
mereka dapat ditemukan dalam bentuk linear, open circle, dan multiple-
supercoiled (Bauer dan Crick, 1980).
Plasmid bakteri ukurannya bervariasi berkisar antara 1 kb sampai 200 kb.
Dalam penelitian rekayasa genetika, plasmid digunakan sebagai vektor untuk
mengklonkan gen. Dalam hal ini, plasmid digunakan sebagai pembawa fragmen
DNA asing ke dalam sel inang (Palomares et al., 2004; Yadav et al., 2011).
Plasmid mempunyai 3 komponen penting yaitu: 1) Origin of replication (ORI),
sehingga plasmid dapat mereplikasi diri tanpa pengaturan dari DNA kromosom,
2) memiliki daerah unik sebagai situs pemotongan enzim endonuclease, yang
biasa disebut multiple cloning site (MCS), 3) membawa penanda seleksi (biasanya
resistensi terhadap antibiotika) untuk membedakan antara sel inang yang
mengandung plasmid atau tidak. Berdasarkan fungsinya menurut Calladine (2004)
plasmid dapat dikelompokkan menjadi 5, yaitu: 1) fertility- F plasmids, 2)
resistance- R plasmids, 3) plasmid penyandi bacteriocins, 4) degradative
plasmids, dan 5) virulence plasmids. Sedangkan berdasarkan jumlah plasmid di
dalam sel dapat dibedakan menjadi low copy number plasmid dan high copy
number plasmid. Selain fungsi, plasmid juga memiliki bentuk yang beragam,
antara lain: 1) supercoiled (covalently closed-circular), 2) relaxed circular, 3)
supercoiled denature, dan 4) nicked open circular (Campbell, 2002).
Secara umum, inti dari isolasi plasmid adalah isolasi plasmid bertujuan
mengekstrak plasmid dan memisahkannya dari berbagai komponen selular bakteri
lainnya, seperti protein, lemak, RNA, dan DNA kromosomal dengan cara
menghancurkan membran sel agar semua organel sel dapat keluar (Lodish, 2000).
Metode isolasi plasmid yang tepat sangat penting untuk mendapatkan plasmid
dengan konsentrasi dan kemurnian yang tinggi. Beberapa metode isolasi plasmid
antara lain: lisis alkali, lisis dengan pemanasan, menggunakan bahan kimia sesium
klorida, metode dengan menggunakan microwave dan metode kromatograpi
(Birnboim dan Doli, 1979). Pada praktikum ini plasmid yang digunakan adalah
plasmid pGEM-T Easy yang mengandung gen Gα diisolasi menggunakan metode
alkaline lysis. Metode alkaline lysis secara garis besar terbagi ke dalam enam
tahap, yakni tahap kultivasi bakteri dan pemanenan sel, tahap resuspensi sel, tahap
lisis sel dan denaturasi DNA, tahap netralisasi, tahap purifikasi, dan tahap
pemekatan DNA (Sambrook dan Russell, 2001)
Isolasi DNA plasmid sangat penting dalam rekayasa genetika karena
merupakan langkah awal yang harus dilakukan dari proses pengklonan di mana
plasmid memiliki peran yang sentral sebagai vektor untuk pengganda. Oleh
karena itu keberadaan plasmid merupakan hal yang terpenting dalam teknik DNA
 1

rekombinan. Keberhasilan suatu teknik DNA rekombinan tergantung dari

keberhasilan isolasi DNA plasmid dari bakteri. Dengan demikian perlu adanya
metode yang tepat sehingga perlu adanya penelitian untuk mengetahui metode
isolasi serta analisis kualitas DNA hasil isolasi plasmid tersebut. Dengan harapan
akan mendapatkan hasil yang maksimal dan dapat dijadikan sebagai bahan untuk
penelitian bidang terkait. Berdasarkan uraian diatas maka perlu dilakukan
praktikum mengenai isolasi DNA plasmid.

Tujuan Penelitian

Praktikum isolasi plasmid sebagai vektor kloning gen α (SL16) bertujuan

untuk mengisolasi fragmen DNA dari bakteri Escherichia coli Gα, serta melihat
kualitas dan kuantitas DNA yang diperoleh menggunakan metode elektroforesis
dan spektrofotometri.

2 METODE

Waktu dan Tempat

Praktikum isolasi plasmid dilaksanakan pada tanggal 20 sampai dengan 29

Agustus 2019 pukul 11.00-16.00 WIB. Praktikum ini dilakukan di laboratorium
Biorin gedung Pendidikan Antar, Institut Pertanian Bogor.

Alat

Alat-alat yang digunakan dalam praktikum ini adalah tabung mikro steril 1.5
mL, mikropipet (100 µL, 200 µL, dan 1000 µL), MaxiMix®II vortex mixer
(Thermo Scientific, Jerman), microlitre centrifuges Z 216 MK (HERMLE
Labortechnik GmbH, Jerman), Sorvall™ Legend™ Micro 17 microcentrifuge
(Thermo Scientific, Jerman) lemari pendingin, Jenway®7315 spektrofotometer
(Cole-Parmer, UK), microwave, perangkat elektroforesis Mupid®exU
(Eurogentec, Belgia), spindown, timbangan analitik, tabung erlenmeyer, dan gel
doc.
Bahan

Bahan-bahan yang digunakan pada praktikum isolasi plasmid adalah kultur

bakteri Escherichia coli Gα, larutan 1 (25 mM Tris-HCl pH 7.4, 10 mM EDTA
15% Saccharose), larutan 2 (200 mM NaOH, SDS 1%), larutan 3 (3 M natrium
asetat pH 4.7), es batu, larutan P:C:I (fenol, kloroform, dan isoamil alkohol
dengan perbandingan 25:24:1), etil alkohol (100% dan 70%), RNAase, gel
agarosa 1%, etidium bromida, ddH2O, Buffer Tris-Asetat-EDTA (TAE).
 1

Prosedur Kerja

Isolasi DNA Plasmid

Kultur bakteri yang digunakan, yaitu Escherichia coli yang mengandung

plasmid PGEM-T easy. Isolat bakteri yang mengandung DNA plasmid dikultur
dalam media cair selama 18 jam kemudian diambil menggunakan mikropipet
sebanyak 1.5 ml ke dalam microtube. Sel bakteri tersebut selanjutnnya pisahkan
dengan medianya menggunakan sentrifugasi pada 5000 rpm selama 5 menit pada
suhu 20 ○C. Pelet yang diperoleh kemudian ditambahkan dengan 100 µL SOL 1
(Tris HCl pH 7.5 + EDTA) yang telah didinginkan dengan es lalu divorteks atau
diresuspensi dengan pipet sampai homogenkan. Setelah homogen, ditambahkan
SOL 2 (0.2M NaOH, 1% SDS) sebanyak 200 µL kedalam microtube, kemudian
dihomogenkan dengan cara dibolak-balik kurang lebih 10 kali, lalu diinkubasi
selama 5 menit dalam kotak es. Langkah selanjutnya, sebanyak 150 µL SOL 3
(1.32 M Na-asetat pH 4.8) ditambahkan kedalam microtube, dibolak-balik
perlahan kurang lebih 10 kali, lalu diinkubasi di dalam kotak es selama 10 menit.
Setelah proses inkubasi selesai dilakukan, sampel tersebut disentrifugasi pada
10000 rpm selama 15 menit pada suhu 20 ○C. Sebanyak 300 µL supernatant
diambil dan dipindahkan pada microtube yang baru lalu ditambahkan P:C:I
(Phenol-chloroform-isoamylalkohol) sebanyak 1x volume supernatan yang
diambil, kemudian dihomogenkan dengan cara dibolak-balik atau divorteks.
Setelah homogen, sampel tersebut disentrifugasi kembali pada 10000 rpm selama
10 menit pada suhu 20 ○C. Fase atas diambil kembali dari hasil sentrifuge dan
ditambahkan 1000 µL EtOH (etil alcohol) 100%, dibolak balik perlahan, lalu di
freezer overnight..
Setelah tahap freezer overnight kemudian sampel disentrifugasi dengan
kecepatan 10000 rpm, pada suhu 4°C selama 25 menit. Selanjutnya pelet yang
diperoleh ditambahkan 500 µl EtOH 70% dan disentrifugasi kembali dengan
kecepatan 10000 rpm, pada 4°C selama 5 menit. Kemudian Pelet DNA plasmid
yang diperoleh dikeringkan dalam oven 60°C selama 10-15 menit. Kemudian
ditambahkan 15-20 µl dH2O dan RNAse sebanyak 0.2 x volume (1 mg/mL).
Setelah itu diinkubasi pada suhu 37°C selama 10 menit. DNA plasmid yang
berhasil diisolasi dianalisis kemurnian dan konsentrasinya dengan elektroforesis
dan spektrofotometer.

Pembuatan Agarose

Gel agarose 1% dibuat dengan melarutkan 0.35 gram agarose kedalam 35

ml buffer TAE (Tris-HCl pH 8.3 40 mM, asam asetat pekat 1.98 mM, EDTA 1
mM), dipanaskan pada microwave 100oC hingga bubuk agarose tercampur selama
1 sampai 2 menit. Setelah suhu gel agarose tidak terlalu panas, gel dituangkan ke
dalamgel tray (cetakan gel) dan di pasang sisir untuk membuat sumuran. Setelah
gel mengeras, sisir dilepas kemudian gel dipindah kedalam electroforesis chamber
yang sudah diisi dengan buffer TAE.
 1

Uji Kualitatif DNA Plasmid Metode Elektroforesis

Plasmid hasil isolasiakan dielektroforesis pada gel agarose 1% (b/v).

Praktikum kali ini digunakan 2 marker λ dengan konsentrasi masing-masing 1 µl
dan 3 µl. Sebanyak 5 µl DNA plasmid dihomogenkan dengan 1 µl larutan loading
dye diatas kertas parafilm dengan cara dipipeting, lalu dengan hati-hati
dimasukkan ke dalam masing-masing sumur pada gel agarosa. Selanjutnya
running dengan tegangan 100 volt selama 25 menit menggunakan fase gerak
berupa buffer TAE.. Setelah itu gel direndam dalam larutan EtBr (Etidium
Bromide) selama 10 menit. Gel hasil elektroforesis divisualisasikan dalam
GelDoc/Transluminator. Pita DNA yang tergambar menjadi indikasi berhasil atau
tidaknya proses isolasi dna plasmid.

Uji Kuantitatif DNA Plasmid Metode Spektrofotometri

Konsentrasi larutan DNA plasmid diukur secara spektrofotmetri pada

panjang gelombang λ260 nm. Kemurnian DNA dihitung berdasarkan rasio
absorbansi pada panjang gelombang λ260 nm dan λ280 nm. Uji ini dilakukan
dengan blanko berupa aquades sebanyak 700 µl dan suspensi DNA plasmid yang
sebanyak 3 µl ditambahkan dengan 697 µl ddH2O. Nilai absorbansi pada panjang
gelombang 260 nm dikonversikan kedalam konsentrasi, yaitu 1 OD260 = 50 µg/ml.
DNA dikatakan murni apabila tingkat kemurniannya berada diantara 1.8 – 2.0.

3 HASIL DAN PEMBAHASAN

Isolasi DNA Plasmid

Secara garis besar prinsip besar isolasi plasmid terdiri dari tiga tahapan
kegiatan, yaitu :1) tahap kultivasi dan harvesting; 2) tahap lisis; dan 3) tahap
pemurnian DNA plasmid. Kultivasi yaitu memberikan kesempatan bagi bakteri
untuk memperbanyak diri sehingga pada saat pemanenan didapatkan plasmid
dalam jumlah yang banyak. Lisis (pemecahan dinding sel), membran sel bakteri
tersusun atas membran luar dan membran dalam, membran luar terdiri atas
lipopolisakarida, protein, fosfolipid, lipoprotein, dan peptidoglikan sedangkan
membran dalam tersusun atas membran fosfolipid bilayer yang juga terintegrasi
protein di dalamnya. Tahap pemurnian DNA plasmid meliputi proses neutralizer,
presipitasi, dan pembilasan DNA plasmid (Brock, et al., 1994).
Pada tahap kultivasi dan harvesting bakteri E. Coli yang telah dikultur
diambil sebanyak 1.5 ml kemudian disentrifugasi hingga terbentuk pellet. Tahap
kedua yaitu lisis menggunakan SOL 1, SOL 2 dan SOL 3. Pellet akan diresuspensi
dengan menggunakan SOL 1 (25 mM Tris-HCl pH 7.4, 10 mM EDTA 15%
Saccharose), yang berfungsi untuk memecahkan dinding sel. Tris HCL atau
Thrometamine HCL berfungsi buffer untuk menjaga pH dan melindungi isi sel
 1

agar tidak ikut lisis. Sedangkan penambahan EDTA berfungsi untuk

mengnaktivasi enzim DNAse yang dapat mendenaturasi DNA yang diisolasi.
Tahap berikutnya yaitu penambahan SOL 2 (200 mM NaOH, SDS 1%) yang
digunakan untuk mengendapkan dinding sel bakteri. SDS atau Sodium dodesil
sulfat berfungsi untuk mendenaturasi protein dengan jalan memutuskan ikatan-
katan non kovalen (terutama ikatan hidrogen) pada protein, sehingga kembali ke
struktur primernya, sebagai rantai linier polipeptida. Selanjutnya penambahan
SOL 3 (3 M natrium asetat pH 4.7) sebagai netralisasi dilakukan dengan
penambahan larutan SOL 3 yaitu natrium asetat untuk membuat konsentrasi
garam tinggi dan single stranded RNA tidak bisa larut pada keadaan tersebut.
Penambahan garam berfungsi sebagai neutralize charge pada gula fosfat DNA
untuk menetralkan suasana basa yang diciptakan oleh ion hidroksida dari NaOH
yang diberikan pada tahap lisis sebelumnya menetralkan suasana basa yang
diciptakan oleh ion hidroksida dari NaOH yang diberikan pada tahap lisis
sebelumnya.
Pada tahap pemurnian DNA plasmid ditambahkan PCI (Phenol :
Chloroform : Isoamil alkohol) yang berfungsi untuk memisahkan kandungan
lipid, protein dari DNA, menghilangkan kontaminan yg masih melekat. Kemudian
ditambahkan ETOH 100% untuk mengikat air yang sebelumnya terikat pada DNA
sehingga DNA mengendap dengan sentrifugasi. Kemudian pellet dibilas dengan
ETOH 70% untuk membersihkan sisa-sisa larutan yang digunakan untuk
mengendapkan plasmid sebelumnya sehingga dapat diperoleh plasmid yang
murni. Lalu dH2O ditambahkan untuk melarutkan DNA agar DNA yang
diendapkan tercampur. Terakhir penambahan RNAse bertujuan untuk memisahkan
DNA dengan RNA dan melisis RNA sehingga yang didapat hanya DNA saja.
Pada saat elektroforesis penambahan buffer TAE (Tris Asetat EDTA) bertujuan
untuk memisahkan molekul DNA dan RNA. Loading dye juga berguna sebagai
penambah densitas DNA, pewarna dan tanda migarsi DNA. Sedangkan
perendaman agarose di etidhium bromida untuk membantu visualisasi, karena
etidhium bromida akan memendarkan sinar UV (Brown, 1991).

Analisis Kualitatif DNA Plasmid Metode Elektroforesis

Kualitas dan kuantitas DNA yang telah diisolasi dapat diuji secara
kualitatif dan kuantitatif dengan elektroforesis agarose dan kuantitatif dengan
spektofotometer. Kualitas isolat DNA dilakukan dengan elektroforesis pada
konsentrasi gel agarose 1%. Elektroforesis gel agarosa adalah metode pemisahan
molekul DNA dan RNA menurut muatan, ukuran dan bentuk. Gel agarose sendiri
berfungsi untuk memisahkan molekul yang berukuran lebih dari 100bp.
Konsentrasi agarose mempengaruhi hasil elektroforesis, karena semakin tinggi
konsentrasi maka ruang antar molekul pada gel agarose lebih kecil sehingga
mempersulit pergerakan molekul yang melewatinya. Secara umum hasil
pengamatan isolasi DNA plasmid dengan elektroforesis berhasil, dilihat dari
pita-pita DNA yang terbentuk pada elektroforesis.
Hasil elektroforesis menunjukkan bahwa DNA plasmid dan marker
tervisualisasi seperti yang terlihat pada Gambar 1. Dari Gambar 1. terlihat bahwa
DNA plasmid dari bakteri terkonstruksi gen Gα berhasil diisolasi. Pita tunggal
DNA yang bersih menunjukkan bahwa proses isolasi dilakukan dengan baik
 1

terutama pada proses inkubasi, proses sentrifugasi dan homogenisasi telah

dilakukan dengan teknik dan waktu yang tepat. Berdasarkan dari hasil
pengamatan, foto kelompok kami (4) menunjukkan adanya pendaran pita yang
cukup jelas dan sama dengan kelompok yang lain (1, 2, 5, 6, 7, dan 8). Sebagai
kontrol positif menggunakan marker marker λ yang sudah diketahui
konsentrasinya yaitu 1 µl dan 3 µl. Hal ini menunjukkan keberhasilan percobaan
isolasi DNA yang telah kami lakukan. Hasil pengamatan hanya bisa melihat
keberadaan pita DNA, tidak bisa mengukur panjang dan ukuran DNA. Hasil
elektroforesis menunjukkan seluruh sampel kecuali sampel kelompok 3
menghasilkan ketebalan pita yang beragam. Ketebalan pita yang beragam
diakibatkan oleh nilai kemurnian dan nilai konsentrasi yang diperoleh juga
berbeda.
Berdasarkan hasil elektofogram terdapat 3 pita yang belum diketahui
jenisnya. Apabila hasil isolasi DNA plasmidnya murni maka akan muncul satu
atau dua band. DNA plasmid mempunyai ukuran yang jauh lebih kecil daripada
DNA kromosom sehingga laju perpindahan molekulnya lebih cepat daripada DNA
kromosom dengan artian pada agarose letak DNA kromosom akan berada diatas
DNA plasmid. Oleh karena itu pita yang paling atas diduga adalah pita DNA
kromosom dan duapita dibawahnya diduga sebagai pita DNA plasmid. Plasmid
yang diperoleh kemungkinan dalam bentuk supercoil atau nicked (Anonim, 2013).

Gambar 1. Elektoforegram DNA plasmid;

M1= Marker λ 3µl;
1-8 = Sampel kelompok hasil isolasi plasmid sebagai vektor kloning
gen Gα;
M3 = Marker λ 1µl.

Berbagai macam bentuk plasmid itu akan mempengaruhi kecepatan

migrasi plasmid dalam elektroforesis. Urutan migrasi bentuk-bentuk plasmid
 1

tersebut dari yang paling cepat adalah supercoiled, supercoiled denaturated,

relaxed circular, dan nicked open circular. Bentuk plasmid yang semakin kecil
atau ramping akan lebih mudah bergerak melalui pori gel agarose sehingga akan
mencapai bagian bawah terlebih dahulu. Selain pita DNA, hasil elektroforesis
DNA menunjukkan adanya materi ikutan lain (smear) yang masih terbawa dan
nampak pada sampel 3. Smear dapat disebabkan karena pada DNA masih terdapat
protein dan RNA. Menurut Mulyani, dkk (2011) smear tersebut bisa merupakan
sisa dari larutan-larutan yang masih terbawa selama proses isolasi.

Analisis Kuantitatif DNA Plasmid Metode Spektrofotometri

Selain menggunakan elektroforesis, untuk melihat kuantitas DNA juga

dilakukan dengan spektofotometer. Pengukuran jumlah DNA dengan
spektofotmeter didasarkan pada prinsip radiasi sinar UV yang diserap oleh
nukleotidadan protein dalam larutan. Kemurnian DNA diperoleh dari
perbandingan absorban A260/280 . molekul DNA dikatakan murni jika rasio kedua
nilai tersebut berkisar antara 1,8-2,0. Menurut Sambrook et al. (2001), DNA
dengan rasio pada kisaran angka tersebut telah memenuhi persyaratan kemurnian
yang dibutuhkan dalam analisis molekuler. Berdasarkan hasil pengukuran
kemurnian DNA plasmid dengan spektrofotometer sampel 1-8 menunjukkan
kemurnian DNAnya mencapai 1,816 sampai dengan 1,904. berdasarkan
perhitungan yang telah dilakukan maka DNA sampel dapat dikatakan murni.
Hasil spektrofotometri kelompok 4, dapat dilihat pada (Tabel 1) absorbansi
yang didapatkan pada DNA plasmid yaitu pada panjang gelombang 260 nm
sebesar 0,961 dan panjang gelombang 280 nm sbesar 0,517. Kemudian dihitung
kemurniannya dan didapatkan 1,858 dan konsentrasi DNA plasmidnya adalah
11211 ng/µL. Secara kuantitas hasil isolasi DNA plasmid pada kelompok 4
menunjukkan tingkat kemurnian yang tinggi karena diantara nilai 1,8-2,0.

Tabel 1 Uji Kuantitatif DNA Plasmid metode spektrofotometri

Sampel Panjang Gelombang (λ) Kemurnian Konsentrasi
260 280 DNA (ng/µL)
1 1.194 0.627 1.904 13930
2 1.026 0.554 1.851 11970
3 1.133 0.597 1.897 13218
4 0.961 0.517 1.858 11211
5 1.366 0.752 1.816 15936
6 0.520 0.285 1.824 6066
7 0.944 0.502 1.880 11013
8 0.931 0.499 1.865 10861

Keterangan Perhitungan Kelompok 4 :

Perhitungan Kemurnian =

Perhitungan Konsentrasi DNA

 1

= 11211 ng/µL

4 KESIMPULAN

Pada praktikum kali ini hasil yang didapatkan adalah kami berhasil
mengisolasi plasmid yang dibuktikan dengan adanya 2 pita di agarose setelah
dilakukan uji kualitatif dengan elektroforesis. Sedangkan hasil uji kuantitatif
DNA plasmid dengan spektrofotmeter pada kelompok 4 DNA plasmid yang
diperoleh nilai kemurnian sebesar 1,858 yang menunjukkan bahwa sampel murni
dengan konsentrasi 11211 ng/µL

DAFTAR PUSTAKA

Anonim. 2013. Plasmid Isolation (Alkaline Lysis). Bioscience A Gene

Technology, Inc. USA Brown, TA. 2010. Gene Cloning and DNA
Analysis: An Introduction, ed. Ke-6.
Bauer WR, Crick FHC, & White JH. 1980. Supercoiled DNA. Soc Am. 243: 100-
13.
Birnboim HC, Doli J. 1979. A rapid alkaline extraction procedure for screening
recombinant plasmid dna. Nucleic Acids Res 7:1513-1523 .
Calladine, C. R., Horace R D., Ben F L., Andrew A T. 2004. Understanding DNA.
Amsterdam : Academic Press.
Campbell, N.A., J.B. Reece, & L.G. Mitchell. 2002. Biologi 5th ed. Jakarta :
Erlangga.
Graphicraft Limited. Hongkong.13-17
Lodish, H., Arnold B., S. Lawrence Z., Paul M., David B. James D. 2000.
Molecular Cell Biology. Wh Freeman Company.
Mulyani, Y., A.Purwanto., I. Nurruhwati.2011. Perbandingan Beberapa Metode
Isolasi DNA untuk deteksi dini Koi herpes virus (KHV) pada Ikan Mas
(Cyprinus carpio L.). Jatinangor : Fakultas Perikanaan dan Ilmu Kelautan.
Universitas Padjajaran. Jurnal Akuatika Vol, II No. 1/Maret Tahun 2011.
Sambrook, R. 2006. The Condensedprotocols From Molecular Cloning: A
Laboratory Manual. New York: Cold Spring Harbour Laboratory Press.
Sudjadi. 2008. Bioteknologi Kesehatan. Kasinius. Yogyakarta.