BAB II.

METODE PENELITIAN

A. Alat dan Bahan Penelitian

1. Bahan Penelitian
a. Bahan Simplisia
Daun sawo durian (Chrysophyllum cainito L.) dipanen dari Desa

Wonorejo RT 2 RW 10 Kecamatan Bawen, Salatiga.

b. Bahan Ekstraksi dan Fraksinasi

Bahan pelarut yang digunakan untuk ekstraksi yaitu etanol 70 %

(Teknis) (Brataco), sedangkan untuk fraksinasi yaitu n-heksan (Teknis)

(PT. MKR Semarang).

c. Bahan Uji Aktivitas Antibakteri

Bahan uji antibakteri yang digunakan penelitian adalah bakteri

Escherichia coli dan Staphylococcus aureus, Nutrien Agar (NA)

(Merck), Nutrient Broth (NB) (Merck), kloramfenikol disk 30 µg

(Oxoid), Dimetilsulfoxide (DMSO) (Oxoid), kapas, alkohol, blank disk,

larutan NaCl 0,9 % (Brataco) dan larutan standar Mc. Farland I (108

CFU/ml).

2. Alat Penelitian

a. Alat yang digunakan dalam pembuatan simplisia

Alat pembuatan simplisia yang digunakan dalam penelitian adalah

timbangan kilogram elektrik (Five Goats), timbangan gram (ACII), oven

(Memmert), blender (Maspion), moisture balance (Ohaus MB 23), mesin

penyerbuk.

22
 23

b. Alat yang digunakan dalam Ekstraksi

Alat ekstraksi yang digunakan dalam penelitian adalah timbangan

analitik (Hanrerr), toples kaca untuk maserasi, pengaduk kayu, alat-alat

gelas (Pyrex), vaccum pump, corong Buchner, rotary evaporator

(Heidolph).

c. Alat yang digunakan dalam Fraksinasi

Alat fraksinasi yang digunakan dalam penelitian adalah timbangan

analitik (Hanrerr), corong pisah (Pyrex), alat-alat gelas (Pyrex), cawan

porselen, sendok logam, batang pengaduk, rotary evaporator (Heidolph).

d. Alat yang digunakan untuk uji Antibakteri

Alat uji antibakteri yang digunakan dalam penelitian adalah

alat-alat gelas (Pyrex), autoclave (All American), Laminar Air Flow

(Airtech), lampu spiritus, micropipette 5-10 µl (Socorex), micropipette

100-1000 µl (Socorex), inkubator (Binder), petri dish, jangka sorong

(Mitutoyo).

B. Jalannya Penelitian

1. Pengumpulan Bahan Uji

Bahan uji yang digunakan adalah daun sawo durian (Chrysophyllum

cainito L.) yang dipanen dari Desa Wonorejo RT 2 RW 10, Kecamatan

Bawen, Salatiga, Jawa Tengah. Daun yang dipanen adalah daun yang masih

segar dan tidak berpenyakit seperti memiliki bercak-bercak pada bagian daun

dan bekas gigitan serangga.

 24

2. Determinasi Tanaman

Determinasi tanaman bertujuan untuk mengetahui identitas tanaman

sawo durian yang digunakan dalam penelitian. Determinasi tanaman

dilakukan di Laboratorium Ekologi dan Biosistematika Jurusan Biologi

Fakultas MIPA Universitas Diponegoro Semarang. Determinasi tanaman

dilakukan dengan cara mencocokkan morfologi tanaman dengan kunci-kunci

determinasi dari tanaman sawo durian yang ada dalam buku Flora of Java

(Backer and de Brink, 1968).

3. Pembuatan Serbuk Daun Sawo Durian

Daun sawo durian yang telah dipanen sebanyak 15,20 kg kemudian

disortasi basah, dipilih daun yang masih segar dan bebas hama. Daun sawo

durian kemudian dibersihkan dan diangin-anginkan. Pengeringan daun

dilakukan dengan oven pada suhu 50°C. Daun yang sudah kering diperoleh

sebanyak 8,185 kg kemudian diserbuk menggunakan blender dan diukur

kadar airnya menggunakan moisture balance. Syarat kadar air untuk simplisia

tidak lebih dari 10% (Depkes RI, 2000). Rendemen serbuk yang diperoleh

sebesar 44,96 %.

4. Pembuatan Ekstrak Etanol Daun Sawo Durian

Pembuatan ekstrak etanol daun sawo durian dilakukan dengan

menyari daun sawo durian menggunakan etanol 70 %. Metode yang

digunakan adalah maserasi dengan perbandingan (1:10). Serbuk daun sawo

durian sebanyak 2.000 gram dimasukkan ke dalam 8 toples kaca dengan

jumlah serbuk sebanyak 250 gram dalam setiap toplesnya. Tahap yang
 25

pertama yang dilakukan yaitu menambahkan etanol 70 % sebanyak 1.875 mL

(75 %) ke dalam setiap toples yang sudah berisi serbuk daun sawo durian

kemudian diaduk secara perlahan selama 15 menit. Pengadukan dilakukan

3 kali sehari dan prosesnya membutuhkan waktu selama 3 hari. Setelah 3 hari

campuran tersebut disaring menggunakan corong buchner dan didapatkan

maserat I pada keseluruhan toples sebanyak 9.725 mL.

Proses remaserasi dilakukan dengan menambahkan sisa pelarut

sebanyak 625 mL (25 %) ke dalam ampas masing-masing toples kemudian

diaduk perlahan dan proses ini dilakukan selama 2 hari. Setelah proses

penyaringan didapatkan maserat II pada seluruh toples sebanyak 4.700 mL.

Hasil penggabungan maserat I dan II diperoleh sebanyak 14.425 mL.

Maserat diuapkan menggunakan rotary evaporator pada suhu 500C

dengan kecepatan 60 rpm untuk mendapatkan ekstrak kental daun sawo

durian. Ekstrak etanol daun sawo durian yang diperoleh selanjutnya

dikumpulkan dan ditimbang bobotnya dalam botol kaca gelap untuk

menghitung rendemen yang dihasilkan.

Berdasarkan Depkes RI (2000), perhitungan rendemen ekstrak

menggunakan rumus sebagai berikut :

𝐵𝑒𝑟𝑎𝑡 𝑒𝑘𝑠𝑡𝑟𝑎𝑘 𝑘𝑒𝑛𝑡𝑎𝑙 𝑦𝑎𝑛𝑔 𝑑𝑖𝑝𝑒𝑟𝑜𝑙𝑒ℎ

Rendemen = × 100%
𝐵𝑒𝑟𝑎𝑡 𝑠𝑒𝑟𝑏𝑢𝑘
 26

Skema proses ekstraksi daun sawo durian dapat dilihat pada Gambar 4.

Serbuk daun sawo durian 2 kg

+ Etanol 70 % 15 liter

Maserasi
5 hari

Diserkai

Maserat 1 Ampas

+ etanol 70 %
sampai volume 5 L

Remaserasi
2 hari

Diserkai

Maserat 2 Ampas

Dibuang
Pemekatan menggunakan
rotary evaporator pada suhu
500 C

Ekstrak etanol daun sawo durian

Rendemen
Gambar 4. Skema Pembuatan Ekstrak Etanol Daun Sawo Durian

5. Pembuatan Fraksi N-Heksan Ekstrak Etanol Daun Sawo Durian

Fraksi n-heksan ekstrak etanol daun sawo durian dibuat dengan cara

melarutkan 20 gram ekstrak etanol daun sawo durian dengan 200 mL akuades
 27

lalu diaduk hingga terlarut sempurna. Selanjutnya dipartisi dengan n-heksan

dengan perbandingan (1:1) menggunakan corong pisah. Proses partisi

dihentikan apabila fase n-heksan sudah jernih. Fraksi n-heksan yang

diperoleh kemudian ditampung dan diuapkan pelarutnya menggunakan rotary

evaporator pada suhu 500C dengan kecepatan 60 rpm sampai diperoleh fraksi

kental. Fraksi tersebut kemudian ditimbang, dibuat berbagai seri konsentrasi

dan diuji aktivitas antibakterinya. Skema pembuatan fraksi n-heksan ekstrak

etanol daun sawo durian dapat dilihat pada Gambar 5.

Ekstrak etanol daun sawo durian

dilarutkan dalam air (1 bagian)
Dipartisi dengan n-heksan (1 : 1)

Fraksi n-heksan Fase air

- Gojog dan dipisahkan
- Partisi kembali dengan n-heksan : air (1:1)
hingga jernih

Fraksi n-heksan dipekatkan dengan

rotary evaporator T 500C

Fraksi n-heksan
kental
Gambar 5. Skema Pembuatan Fraksi n-heksan Ekstrak Etanol Daun Sawo Durian

6. Persiapan Uji Aktivitas Antibakteri

a. Sterilisasi Alat

Alat-alat yang digunakan dalam penelitian uji aktivitas antibakteri dicuci

bersih, selanjutnya dikeringkan dan dibungkus kertas coklat kemudian

disterilkan. Alat-alat gelas dan media disterilkan dalam autoklaf pada suhu

1210C selama 15-20 menit sedangkan kawat ose dan pinset disterilisasikan
 28

dengan cara dibakar diatas api langsung menggunakan lampu bunsen hingga

menjadi warna merah menyala (Lay and Hastowo, 1992).

b. Pembuatan Media

a. Nutrien Agar (NA)

Komposisi media Nutrient Agar (NA) yaitu Pepton from meat 5 gram,

Yeast extract 2 gram, agar-agar 15 gram. Nutrient Agar (NA) dibuat dengan

cara yaitu 28 gram dilarutkan dalam 1000 mL akuades kemudian

dimasukkan dalam erlenmayer. Media dipanaskan diatas kompor hingga

mendidih sambil diaduk hingga homogen. Setelah itu medium disterilisasi

dengan autoklaf pada suhu 1210C dengan selama 15 menit, kemudian

didinginkan pada suhu kamar. Simpan media yang sudah siap pada suhu

2-80C (Oxoid, 2006).

b. Nutrient Broth (NB)

Komposisi media Nutrient Broth (NB) yaitu Pepton from meat 5 gram,

Yeast extract 2 gram. Media Nutrient Broth (NB) dibuat dengan cara

menimbang 13 gram serbuk Nutrient Broth (NB) ditambah 1000 mL

aquades, dipanaskan didalam beaker glass sampai mendidih. Campuran

tersebut selanjutnya dimasukkan dalam erlenmeyer steril yang bertutup dan

disterilisasi di dalam autoklaf pada suhu 1210C selama 15 menit. Setelah

agak dingin media disimpan dalam suhu dibawah 250C (Oxoid, 2006).

c. Peremajaan Bakteri

Bakteri uji sebelum digunakan untuk uji aktivitas antibakteri terlebih

dahulu dilakukan regenerasi. Peremajaan bakteri Escherichia coli dan

 29

Staphylococcus aureus dilakukan dengan cara menanam bakteri ke dalam

cawan petri yang berisi media Nutrient Agar (NA) steril. Isolat bakteri

diinokulasi sebanyak 3 ose kemudian diinkubasi selama 24 jam pada suhu

370C di dalam inkubator (Misna dan Diana, 2016).

d. Pembuatan Biakan Bakteri

Bakteri Escherichia coli dan Staphylococcus aureus dibiakkan dalam

media Nutrient Broth (NB). Pembiakan dilakukan dengan cara mengambil

3 ose bakteri uji dari Nutrient Agar (NA) kemudian disuspensikan dalam

5 mL media Nutrient Broth (NB). Media uji diinkubasi pada suhu 370C

selama 24 jam (Wijaya et al., 2016).

e. Pembuatan Suspensi Bakteri

Bakteri uji hasil dari pembiakan diambil dengan mikropipet steril

sebanyak 100 µl lalu disuspensikan ke dalam tabung yang berisi 10 mL

larutan NaCl 0,9 % b/v hingga diperoleh kekeruhan yang sama dengan

standar kekeruhan larutan Mc. Farland I (Populasi 1x108 CFU/ml) (Deby, et

al., 2012). Kekeruhan ini dipakai sebagai standar kekeruhan suspensi bakteri

uji (Victor, 1980).

7. Pembuatan Larutan Stok Fraksi N-heksan Ekstrak Etanol Daun Sawo

Durian

Larutan stok fraksi n-heksan ekstrak etanol daun sawo durian dibuat

konsentrasi 100 % dengan cara menimbang fraksi n-heksan kental ekstrak

etanol daun sawo durian sebanyak 4,9 gram kemudian diencerkan dengan

penambahan DMSO hingga diperoleh volume larutan stok sebesar 4,9 mL

 30

agar fraksi n-heksan ekstrak etanol daun sawo durian dapat larut secara

sempurna.

8. Pembuatan Seri Konsentrasi dari Fraksi N-heksan

Fraksi n-heksan ekstrak etanol daun sawo durian dibuat dengan seri

konsentrasi 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 % untuk bakteri Escherichia coli dan

seri konsentrasi 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 % dan 100 % untuk bakteri

Staphylococcus aureus. Seri konsentrasi tersebut dibuat dengan cara

mengambil 0,4 mL ; 0,5 mL ; 0,6 mL ; 0,7 mL ; 0,8 mL ; 0,9 mL dan 1 mL

dari larutan stok fraksi n-heksan ekstrak etanol daun sawo durian kemudian

diadkan sampai volume 1 mL dengan DMSO (Octaviani and Prastika, 2017).

9. Uji Aktivitas Antibakteri

Pengujian aktivitas antibakteri fraksi n-heksan ekstrak etanol daun

sawo durian terhadap pertumbuhan bakteri Escherichia coli dan

Staphylococcus aureus dilakukan dengan metode disk diffusion (Tes Kirby

dan Baurer). Nutrien Agar (NA) steril diukur sebanyak 25 mL dituangkan ke

dalam erlenmayer steril yang sudah berisi 100 µl suspensi bakteri. Campuran

kemudian digojok hingga homogen, kemudian dituangkan ke dalam petri dish

steril dan dibiarkan selama beberapa menit sehingga menjadi padat.

Selanjutnya, paper disk dan disk kloramfenikol 30 µg diletakkan pada media

Nutrien Agar (NA). Variasi konsentrasi yang digunakan yaitu 40 %, 50 %,

60 %, 70 %, dan 80 % untuk bakteri Escherichia coli sedangkan seri

konsentrasi 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 % dan 100 % untuk bakteri

Staphylococcus aureus. Variasi konsentrasi ini bertujuan untuk melihat

 31

perbedaan diameter hambat dari masing-masing konsentrasi yang digunakan.

Fraksi n-heksan ekstrak etanol daun sawo durian dilarutkan dengan DMSO.

Campuran tersebut kemudian diteteskan sebanyak 10 µl pada masing-masing

papper disk dan dimasukkan ke dalam inkubator pada suhu 370C selama

24 jam. Sementara itu, kontrol positif yang digunakan adalah disk

kloramfenikol 30 µg, sedangkan kontrol negatif yang digunakan adalah

DMSO. Uji dilakukan dengan replikasi sebanyak 3 kali dan diamati

pertumbuhan bakteri di sekitar disk pada setiap konsentrasi. Diameter daerah

hambat yang terbentuk diukur dengan menggunakan jangka sorong (Munte et

al., 2016).
 32

Skema jalannya penelitian dapat dilihat pada Gambar 6.

Determinasi daun sawo durian

Pengumpulan, sortasi dan pengeringan

suhu 500C

Simplisia kering daun sawo durian

Penyerbukan

Serbuk daun sawo durian

Maserasi dengan etanol 70 % dan dipekatkan

dengan rotary evaporator suhu 500C

Ekstrak etanol daun sawo durian

Dipartisi dengan n-heksan (1:1) dan di rotary

evaporator suhu 500C

Fraksi n-heksan daun sawo durian

Uji Aktivitas Antibakteri

Escherichia coli Staphylococcus aureus

40 %, 50 %, 60 %, 70 %, dan 80 % 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 % dan 100 %

Diameter Daerah Hambat

Analisis Data

Gambar 6. Skema Kerja Penelitian Aktivitas Antibakteri Fraksi N-heksan Ekstrak

Etanol Daun Sawo Durian terhadap Bakteri Escherichia coli dan
Staphylococcus aureus
 33

C. Analisis Data

Data hasil uji aktivitas antibakteri FHEEDSD menggunakan metode disk

diffusion berupa diameter daerah hambat pada pertumbuhan bakteri Escherichia

coli dan Staphylococcus aureus. Data DDH dari seri konsentrasi sampel uji

dibandingkan dengan kontrol negatif dan kontrol positif. Data DDH terhadap

pertumbuhan Staphylococcus aureus tidak dianalisis secara statistik karena

menunjukkan hasil yang sama pada seluruh konsentrasi, sedangkan data DDH

terhadap pertumbuhan Escherichia coli dianalisis menggunakan software SPSS

18. Data DDH diuji menggunakan Shapiro Wilk. Hasil uji yang diperoleh tidak

terdistribusi normal dan tidak homogen maka dilanjutkan uji non parametrik

menggunakan uji Kruskall Wallis. Hasil signifikansi menunjukkan adanya

perbedaan bermakna dari keseluruhan konsentrasi uji pada bakteri Escherichia

coli (P< 0,05) dan dilanjutkan dengan uji Man-Whitney dengan taraf kepercayaan

95 %. Fraksi n-heksan ekstrak etanol daun sawo durian dikatakan memiliki

aktivitas antibakteri terhadap bakteri Escherichia coli dan Staphylococcus aureus

jika membentuk DDH disekitar disk dibandingkan dengan kontrol negatif.