Investigasi pekerja pompa bensin yang rentan terhadap

gangguan neurologis berdasarkan bukti ekspresi ekspresi

gen katekol -Omethyltransferase (COMT)
Rezaei TPM1 , Mohamadi F2 , Rashidi Y3 and Ahangari G1 *

Abstrak
Senyawa bensin yang paling berbahaya adalah aromatik karsinogenik seperti benzena
dan toluena. Senyawa aromatik dalam bensin dapat menjadi neurotransmitter berfungsi dengan
cincin aromatik, seperti cincin katekol dan mengganggu peran neurotransmiter. Pekerja yang
bekerja di pompa bensin memiliki potensi tertinggi untuk terpapar bensin. COMT mengkatalisasi
transfer gugus metil dari S-adenosyl-L-metionin ke salah satu dari dua kelompok hidroksil
senyawa katekol, termasuk L-dopa, estrogen katekol, katekolamin endogen dan eksogen serta
metabolitnya yang terhidroksilasi. Pelajaran ini memeriksa perubahan ekspresi gen katekol O-
metil transferee pada orang yang bekerja di pompa bensin di kota Teheran sehubungan dengan
penentuan uap bensin berbahaya bagi kesehatan dan keberadaan senyawa aromatik dalam bensin.
Telah dipilih 30 pekerja yang telah bekerja minimal 5 tahun di Indonesia pompa bensin yang
ramai. Total RNA diekstraksi dari sel darah putih darah tepi dari 30 sukarelawan sehat dan 30
pekerja dan kemudian cDNA disintesis. Proses ini diikuti oleh Real-time PCR menggunakan
pasangan primer khusus untuk catechol-o metil transfrase mRNA dan beta-aktin sebagai kontrol
internal. Sebagai hasil ekspresi relatif katekol-o-metil transfrase telah menunjukkan peningkatan
yang signifikan (p = 0,001) dalam PBMC petugas pompa bensin. Hasilnya menunjukkan itu
ekspresi berlebih dari katekol -O-metiltransferase dalam kelompok target. Neurotransmitter
seperti dopamin, norepinefrin, epinefrin dan katekolamin lainnya neurotransmitter dikatabolisme
oleh katekol -O-metiltransferase. Dopamin dikaitkan dengan gangguan mental seperti
kecemasan, depresi, gangguan tidur, perhatian sindrom defisit / hiperaktif, sindrom kaki gelisah
dan Parkinson. Dapat disimpulkan bahwa orang yang bekerja di pompa bensin kemungkinan
lebih tinggi menderita seperti itu gangguan daripada situasi normal.
Pendahuluan
Bensin adalah campuran dari lebih dari 200 bahan kimia yang berasal dari minyak
bumi dan beberapa produk sintetis yang ditambahkan untuk meningkatkan kinerja bahan bakar
[1-4]. Benzene dan banyak lagi senyawa bukan hanya lebih baik BTEX yang dikenal (toluena,
xilena, dan etil benzena) adalah yang paling banyak komponen berbahaya penting dari bensin.
Aromatik ini ditularkan ke manusia melalui penciuman dengan mudah. Seperti Benzene dan
BTEX disertakan dalam zat karsinogenik Kelompok oleh WHO, mereka sangat berbahaya dan
senyawa karsinogenik [5-6]. Para pekerja yang telah bekerja di pompa bensin dan industri yang
bergantung pada bensin yang terpapar bensin bahaya senyawa aromatik yang dibebaskan dari
bahan bakar bensin. Kapan orang mengisi mobil mereka dengan bensin adalah cara paling umum
mereka terpapar benzena dan hidrokarbon aromatik yang mudah menguap lainnya. Bensol uap
juga hadir dalam knalpot dari industri dan mobil. Orang yang bekerja di pompa bensin dan
tinggal di dekat jalan raya atau industri atau pom bensin dapat terkena hidrokarbon aromatik.
Bensol, toluena, etil benzena, dan xilena juga memiliki efek neurotoksik [7]. Senyawa aromatik
dalam bensin dapat meniru fungsi neurotransmitter dengan cincin aromatik, seperti cincin
katekol. Dopamin, epinefrin dan norepinefrin adalah neurotransmiter Katekolamin. COMT
memainkan peran penting dalam metabolisme estrogen dopamin dan katekol [8,9]. COMT
mengkatalisasi transfer gugus metil dari S-adenosylL-metionin ke salah satu dari dua gugus
hidroksil katekolik senyawa, termasuk norepinefrin, epinefrin L-dopa, katekol Estrogen,
katekolamin endogen dan eksogen serta metabolit terhidroksilasi [9]. Kode gen COMT tunggal
untuk dua enzim terpisah, larut (S-COMT) dan bentuk membran-terikat (MBCOMT) [10,11].
Kedua isoform dari COMT diusulkan untuk dimiliki setidaknya sebagian peran yang berbeda:
MB-COMT diyakini terutama terlibat dalam penghentian dopaminergik dan noradrenergik
neurotransmisi sinaptik bila ada yang relevan secara fisiologis konsentrasi katekolamin yang
rendah [12]. S-COMT dianggap demikian terutama bertanggung jawab untuk menghilangkan
secara biologis aktif atau beracun, khususnya eksogen, katekol bertindak sebagai detoksifikasi
enzimatik penghalang antara darah dan jaringan lain [13-15].
Hubungan antara COMT val158met Polymorphism dan kejadian berbagai penyakit
seperti Nyeri saraf, skizofrenia, gangguan obsesif-kompulsif dan kanker payudara telah
dilaporkan dalam studi penelitian [16-19]. Namun, ekspresi berlebihan dan berlebihan aktivitas
COMT dapat menyebabkan depresi dan bisa berbahaya [9]. COMT adalah enzim yang
ditemukan berlimpah di semua jaringan di sistem saraf pusat. Enzim ini sangat diekspresikan di
hati , diikuti oleh ginjal dan saluran pencernaan (baik lambung dan usus) [20-21], juga
ditemukan di kelenjar limpa dan sub maksila, [22,23] jantung, uterus [24], sel chromaffin dari
kelenjar adrenal [25], prostat [26], otot dan eritrosit manusia mengandung beberapa COMT
aktivitas [27], pembuluh darah di pulpa gigi [28]. Dopamin disintesis dari asam amino tirosin
dan merupakan prekursor norepinefrin dan neurotransmiter epinefrin [29]. Jalur dopaminergik
memainkan peran penting dalam otak, sistem pencernaan, kekebalan tubuh sistem, pankreas dan
arteri. Gangguan pada jalur dopaminergik di otak yang menyebabkan penyakit seperti,
kecemasan, kekerasan, depresi, Penyakit Parkinson [30], sindrom kaki gelisah dan hiperaktif
[31]. Karena bensin adalah konstituen cincin aromatik, mereka dapat bertindak sebagai substrat
enzim katekol-o-metiltransferase karena itu mereka dapat meniru peran neurotransmiter
katekolamin. Menurut sebelumnya Studi telah dihipotesiskan bahwa ekspresi gen COMT
memiliki peran penting pada Individu yang telah bekerja di pompa bensin.

Bahan dan metode

Populasi penelitian
Dalam penelitian ini, subjek dibagi dalam dua kelompok, kelompok kontrol dan
mereka yang bekerja di pompa bensin. Kelompok kontrol termasuk 30 sukarelawan penduduk
daerah pinggiran kota yang jauh dari pompa bensin, tanpa riwayat penyakit neurologis dan
pernapasan, merokok, obat-obatan kecanduan dan kondisi khusus lainnya. Sebenarnya para
member dari kelompok ini benar-benar dalam kondisi sehat (Pria, usia 20 tahun hingga 40
tahun). Kelompok sasaran adalah 30 petugas pompa bensin; mereka bekerja setidaknya selama 6
bulan, tanpa riwayat penyakit mental apa pun, apa pun konsumsi obat-obatan psikiatris dan
penyakit alergi. (Pria, rentang usia 20 hingga 40 tahun). Para peserta yang merokok atau dengan
kecanduan dan penyakit pernapasan dikeluarkan dari penelitian ini. Pengambilan sampel
dilakukan di 3 pompa bensin yang berbeda di berbagai wilayah di Teheran dengan izin
perusahaan minyak nasional. Semua subjek menyetujui untuk mengambil bagian dalam
penelitian ini dan disetujui oleh komite etik.
Isolasi PBMC dan ekstraksi RNA
Sampel darah tepi (5 ml) diperoleh dari kubus vena dan dikumpulkan dalam tabung
persiapan sel yang mengandung antikoagulan (Heparin). Pertama, sampel darah disentrifugasi
dalam 300 g selama 5 menit dan plasma sampel disimpan untuk uji enzim (as substrat).
Kemudian, sampel darah diencerkan dengan volume yang sama saline fosfat buffered (PBS).
Mononuklear darah tepi sel (PBMC) diisolasi dari 4 ml masing-masing sampel darah oleh
FicollHypaque (Pharmacia, Uppsala, Swedia) centrifugation density. Sel kepadatan dan
osmolitas adalah 1,077 ± 0,001 g / ml (20˚C) dan 290 ± 15 ibu masing-masing. Centrifuge
swing-out horizontal digunakan untuk sel isolasi dalam 850 g selama 20 menit dan pengaturan
kecepatan 1.0. Buffy mantel (lapisan limfosit) dikumpulkan dan disentrifugasi dalam 300 g
selama 10 menit dan peraturan Kecepatan 2.0. Akhirnya, pelet yang dihasilkan adalah dicuci di
PBS [32].

Teknik RT-PCR
MRNA total diisolasi dari PBMC oleh RNA murni tinggi isolation Kit (Roche,
Jerman), sesuai dengan pabrikan instruksi. Konsentrasi sampel RNA yang diekstraksi dibaca
bersama Nanodrop untuk menyinkronkan semua sampel lainnya. RNA (1μg) dari masing-masing
sampel digunakan untuk mensintesis cDNA untai pertama dengan sintesis cDNA kit
(Fermentase, Jerman). Demikian pula, sintesis cDNA dilakukan berdasarkan pada protokol
pembuatan. Ada primer yang dirancang menggunakan perangkat lunak oligo5 (WWW.oligo.net)
untuk gen COMT dan b-aktin sebagai gen housekeeping berdasarkan urutan GenBank dan
kekhususannya secara teoritis diperiksa oleh pencarian database BLAST terhadap nukleotida
referensi basis data NCBI (Tabel 1). Untuk mengkonfirmasi keberadaan gen COMT dalam sel
PBMC, merupakan hal biasa Teknik PCR dilakukan untuk semua sampel dalam volume akhir 20
μl dengan 1 Unit Taq DNA polimerase (Sinagene, Iran). Reaksi m campuran mengandung 2–2,5
mM MgCl, masing-masing 0,5 mM dari dNTPs, 0,8–1pM primer, 2,5 μL Taq DNA polimerase
(Sinagene, Iran), dan 1 μL cDNA digunakan sebagai templat dalam setiap reaksi RT-PCR. Di
Untuk memperkuat gen COMT dan b-aktin, PCR dimulai pada 95° C selama 5 menit dan
diamplifikasi selama 35 siklus pada 95 ° C selama 1 menit, 54 dan 62 ° C selama 40 detik dan 72
° C selama 1 menit dan diikuti oleh perpanjangan akhir langkah pada 72 ° C selama 10 menit.
Akhirnya, produk PCR divisualisasikan oleh gel elektroforesis pada gel agarosa 2%. Apalagi
kontrol positif amplifikasi digunakan secara eksperimental untuk memverifikasi primer [33].

CR waktu nyata
PCR waktu nyata juga dilakukan oleh tepung hijau Cyber nukleotida untuk memantau
amplifikasi cDNA oleh (Roche kit, Jerman) mengukur peningkatan intensitas Fluoresensi dan
menggunakan pasangan primer spesifik untuk COMT mRNA dan β-aktin sebagai kontrol
internal dalam Real Instrumen Time-PCR (Corbett, Jerman). PCR dilakukan dalam 10 μL solusi,
yang terdiri dari 2 μL solusi Fast Start Master dan 0,3 μM dari masing-masing primer. Sebanyak
9 μL campuran reaksi ini ditempatkan ke dalam 0,1 vial, dan 1 μL cDNA ditambahkan sebagai
templat. Panas bersepeda terdiri dari langkah denaturasi awal 95° C selama 10 menit diikuti oleh
program amplifikasi (anil primer, amplifikasi dan kuantifikasi) diulang selama 45 siklus.
Program amplifikasi adalah 95 ° C selama 10 detik, 54 dan 62 ° C selama 10 detik, masing-
masing untuk COMT untuk β-aktin dan 72 ° C selama 10 detik dengan akuisisi fluoresensi
tunggal pada akhir langkah perpanjangan. Segmen ketiga terdiri dari sebuah Program kurva leleh
dilakukan oleh program standar instrumen real timePCR. Analisis kurva lebur hanya
menunjukkan satu puncak untuk setiap reaksi dan ini juga dikonfirmasi oleh elektroforesis PCR
produk yang hanya menunjukkan satu band dari ukuran yang diharapkan [33].

Analisis statistik
Pertama, kami menggunakan perangkat lunak LinReg PCR untuk mendapatkan Cycle
of ada perubahan (Ct) dan efisiensi dari setiap reaksi, dan kemudian data diimpor ke perangkat
lunak REST 2009, perhitungan perangkat lunak ini didasarkan pada Persamaan pfaffle yaitu
sebagai berikut: [32]

R: Rasio ekspresi relatif dari gen target dibandingkan dengan

kontrol
E: Efisiensi Real-Time-PCR
ΔCP: Perbedaan titik persimpangan (CP) (Δ) dari satu sampel yang tidak diketahui
Table 1. Urutan primer yang digunakan dalam RT-PCR dan Real-PCR
Gene Length PCR Primer sequences Tm(˚C)
(bp)
B-actin 161 F-5'-AGACGCAGGATGGCATGGG -3' 62

R-5'-GAGACCTTCAACACCCCAGCC -3' 68
202 F-5’-CTGGAGGCCATTGACACCTA -3′ 64

COMT R-5′-GGTTGATCTCGATGGTGATGAG -3′ 58

Pengurutan
Fragmen COMT dan β-aktin diurutkan dengan sequencer DNA Sistem kapiler ABI
3700 (Applied Bio System, USA) untuk konfirmasi urutan diperkuat [33].

Gambar 1. Tampilkan ekspresi gen COMT dalam sel PBMCs. Jalur M: Penanda ukuran
molekul 100bp (Fermentas, Jerman), Jalur1: kontrol negatif, Jalur2: kontrol positif dari COMT-
202bp, Jalur 3: COMT-202bp

Table 2. Statistical analysis information

Gene Type Reaction Expression Std. Error P(H1) Result
Efficiency
B-actin REF 0.9014 1
COMT TRG 0.8531 4.287 3.108 - 0.001 UP
141.436
Hasil
Dalam penelitian ini, ekspresi gen COMT dievaluasi dalam PBMC petugas pompa
bensin dan kelompok kontrol PBMC (Gambar 1). Ada perbedaan besar dalam tingkat ekspresi
gen antara petugas pompa bensin dan kelompok kontrol, enzim COMT gen dalam PBMC kasus
petugas SPBU yang menunjukkan signifikan lebih dari ekspresi dibandingkan dengan rekan-
rekan mereka di kelompok kontrol. Selanjutnya, semua fragmen berurutan diperiksa oleh
BLAST database terhadap referensi database NCBI nukleotida dan dikonfirmasi urutan
amplikon.

Analisis ekspresi
Analisis statistik menggambarkan korelasi yang signifikan antara Aktivitas spesifik
COMT dan ekspresi enzim yang berlebihan. Itu ekspresi gen Comt di PBMC pekerja pompa
bensin secara signifikan lebih tinggi daripada orang normal (Tabel 2). Nilai P (H1):
kemungkinan peningkatan COMTgene ekspresi dibandingkan dengan orang normal yang bekerja
di pompa bensin hanya karena kebetulan. REF: Gen referensi, TRG: Gen target Diskusi
Berdasarkan hipotesis yang dipertimbangkan, ekspresi gen dan COMT aktivitas di PBMC
petugas SPBU berbeda dengan individu yang sehat. Berbagai penelitian menunjukkan hubungan
antar polutan dan penyakit seperti penyakit neurotoksik seperti autisme [34]. Energi Konsumsi
telah meningkat dengan pertumbuhan populasi, industri pengembangan, pertumbuhan populasi
perkotaan dan promosi sosial kesejahteraan di dunia. Akibatnya, permintaan akan bahan bakar
fosil, khususnya bensin meningkat setiap hari. Konsumsi bensin menghasilkan banyak polutan.
Polutan ini dan konsekuensinya efek merugikan pada lingkungan. Seperti disebutkan
sebelumnya bensin memiliki volatilitas tinggi dan uap bensin adalah dua kategori uap sebelum
dan setelah pembakaran. Penelitian sebelumnya telah berfokus pada pasca-pembakaran uap
bensin, penelitian ini meneliti efek uap bensin sebelum pembakaran .jadi, penelitian ini adalah
langkah menuju peningkatan kesehatan tenaga kerja di pompa bensin karena kebanyakan orang
yang terpapar untuk uap-uap ini adalah staf stasiun bahan bakar [35,36]. Apalagi kami baru-baru
ini studi menunjukkan bahwa semakin tinggi ekspresi gen, semakin besar komet aktivitas
protein. Pernafasan bensin yang konstan telah merusak efek pada sistem saraf seperti
ketidakseimbangan, getaran, sindrom ensefalopati akut atau subakut [37] brengsek rahang,
tremor postural, ataksia, gaya berjalan abnormal, refleks tendon dalam, dan bicara yang
terpengaruh [38]. Lain penelitian telah menunjukkan pekerja pompa bensin melaporkan keluhan
sakit kepala, kelelahan, masalah tidur, kehilangan ingatan, dan kelemahan umum [39]. Sulit
untuk menentukan kontribusi paparan benzena untuk gejala yang dilaporkan. Karena kandungan
bensinnya benzena tinggi; nilai berkisar antara 10-17%. Bensin mengandung campuran c4 -c12
alifatik, hidrokarbon aromatik, naftalena, parafin dan alkena [40-42,37-39]. Jadi, itu bisa diserap
dengan mudah melalui kulit dan dipindahkan ke hati. Di hati dikonversi menjadi timbal trietil.
Senyawa ini bersifat neurotoksik dan memiliki waktu paruh lebih dari 500 hari di otak [43].
Hidrokarbon aromatik dalam bensin adalah benzena, toluena, xilena dan n-heksana. Mereka
lipofilik dan diserap dengan cepat [40, 42]. Itu waktu paruh benzena dan toluena berkisar antara
9-24 jam dan 7.5 jam masing-masing [44-46] Dengan demikian, aksi hidrokarbon yang mudah
menguap disebabkan efek akut dari menghirup bensin [45]. Senyawa aromatik telah diketahui
menyebabkan mual, ataksia dan kehilangan kesadaran [44, 47].
Komposisi bensin, benzena, toluena dan xilena Senyawa menyumbang persentase
signifikan bensin. Itu bahaya pernapasan knalpot dan uap bensin dan pelepasan uap bensin
selama pengisian bahan bakar lebih berbahaya daripada kontak dengan kulit. Dalam studi oleh
Amal A Kinay diamati bahwa Tikus terkena untuk bensin tanpa timbal menurun kadar
norepinefrin di korteks serebral dan hipotalamus. Juga dalam penelitian ini diamati kadar
norepinefrin menurun pada hippocampus tikus yang ada terkena bensin bertimbal dan timbal
[48]. Bensin juga berkurang tingkat dopamin di hipotalamus dan hippocampus. Itu MMT
menyebabkan fluktuasi kadar dopamin. MMT adalah organik mangan, yang ditambahkan dalam
bensin tanpa timbal [48]. Mangan memiliki sifat antioksidan dan bereaksi dengan sistem
dopaminergik [49].
Juga terbukti bahwa Mn bereaksi dengan dopamin, yang dapat diaktifkan jalur
pensinyalan ROS dan NOS intraseluler, sebagai akibatnya diinduksi kematian sel dopaminergik.
J. Mann pada tahun 1999 membuktikan level tersebut neurotransmitter monoamine seperti
norepinefrin dan dopamin berkurang pada orang yang depresi [50]. Juga telah ditunjukkan itu
bensin dan tikus menyebabkan kecemasan dan masalah emosional [48].
Benzene sebagai senyawa utama dalam bensin terlibat di dalamnya Sintesis dan
katabolisme katekolamin dan serotonin di otak, menyebabkan efek neurotoksik. Banyak
penelitian menunjukkan defisit perhatian gangguan hiperaktif (ADHD) terkait dengan
pengurangan aktivitas (jumlah) dopamin. Penyakit itu, terkait sindrom kaki gelisah (RLS) untuk
pengurangan aktivitas (jumlah) dopamin [31]. Pencarian untuk pengobatan MDD yang efektif
(gangguan depresi mayor) dan lainnya gangguan depresi telah mengembangkan peran fisiologis
dopamin dalam depresi [48]. bukti dari uji klinis menunjukkan bahwa pada pasien dengan
depresi, metabolit utama dopamin serebrospinal (Asam Homovanillic (HVA) berkurang di
sistem saraf pusat. Ada beberapa bukti bahwa disfungsi neuron dopaminergik dalam Penyakit
Parkinson juga dapat menyebabkan gejala motorik, depresi dan gangguan kognitif [29].
Enzim Catecholamine-O-methyltransferase (COMT) dalam celah sinaptik mengurangi
katekolamin seperti dopamin, epinefrin dan epinefrin. Efek terpenting dari enzim ini adalah
pembersihan dopamin di berbagai wilayah otak. Jadi, ia terlibat dalam neurologis penyakit yang
menurun dopamin membuat mereka seperti depresi berat dan Parkinson [9, 49, 50].

Kesimpulan
Dalam penelitian ini, ekspresi gen katekolamin (COMT) meningkat pada orang yang
terpapar asap bensin. Berdasarkan level yang lebih rendah neurotransmiter katekolamin yang
terkait dengan uap bensin, dapat disimpulkan bahwa peningkatan ekspresi gen ini mengarah
untuk meningkatkan dekomposisi katekolamin seperti dopamin dan norepinefrin pada orang
yang terpapar uap ini. Hasil dari, orang-orang ini lebih rentan terhadap gangguan neurologis
seperti mayor depresi, kecemasan, Parkinson dan penyakit lain yang relevan dengan
berkurangnya dopamin dan neurotransmiter katekolamin lainnya.

Ucapan Terima Kasih

Pekerjaan ini didukung oleh hibah National Institute of Genetics Rekayasa dan
Bioteknologi (NIGEB), Teheran, Iran. Kita juga terima kasih kepada orang-orang yang
berpartisipasi dalam penelitian ini