See discussions, stats, and author profiles for this publication at: https://www.researchgate.

net/publication/331476975

INSTRUMENTATION & BIOMOLECULAR TECHNIQUE DOT BLOT

Article · April 2018

CITATIONS READS

0 350

1 author:

Andre Setiawan
Brawijaya University
18 PUBLICATIONS   6 CITATIONS   

SEE PROFILE

All content following this page was uploaded by Andre Setiawan on 02 July 2019.

The user has requested enhancement of the downloaded file.

 LAPORAN PRAKTIKUM
INSTRUMENTATION & BIOMOLECULAR TECHNIQUE
DOT BLOT

OLEH:
ANDRI SETIAWAN
NIM: 176070100011002

PROGRAM MAGISTER ILMU BIOMEDIK

FAKULTAS KEDOKTERAN UNIVERSITAS BRAWIJAYA
MALANG
2018
 BAB 1
PENDAHULUAN
1.1 Latar Belakang

Immunoblotting merupakan suatu teknik untuk memindahkan atau

transfer protein dari gel poliakrilamid ke pemukaan membran. Umumnya
membran yang digunakan adalah membran nitroselulosa atau Polyvinylidene
Difluoride (PVDF). Immunoblotting merupakan teknik analisis protein yang
memanfaatkan reaksi antibodi dan antigen sebagai pendeteksi protein target.
Protein dideteksi dengan cara penambahan antibodi spesifik yang disebut
sebagai antibodi primer. Antibodi primer ini mempunyai sifat antigenisitas yang
dapat berikatan dengan protein spesifik pada permukaan membran. Setelah itu
ditambahkan antibodi sekunder konjugat yang akan berikatan dengan
antibodiprotein membentuk kompleks. Penambahan substrat akan bereaksi
dengan konjugat sehingga menimbulkan pita protein yang dapat terlihat pada
permukaan membran. Visualisasi pita protein target dapat menggunakan substrat
alkaline phosphatase, peroksidase, substrat kromogenik atau X-Ray (Kurien,
2011).

Dot Blot adalah sebuah teknik untuk mendeteksi, menganalisis, dan

mengidentifikasi protein. Teknik ini menyerupai Western Blot namun
perbedaannya adalah protein sampel tidak dipisahkan melalui elektroforesis
akan tetapi ditandai dengan template sirkuler secara langsung pada substrat
kertas. Konsentrasi protein dalam preparasi mentah atau kasar (misalnya kultur
supernatan) dapat diperkirakan secara semikuantitatif dengan menggunakan
teknik ini jika dimiliki protein yang terpurifikasi dan antibodi untuk protein
tersebut. Dot blot dapat digunakan untuk perhitungan kualitaif pada rapid
screening dari jumlah sampel yang besar atau sebagai tehnik kuantitatif, dan
terutama berguna untuk menguji kesesuaian parameter desain eksperimental
(Smith J, et al., 2012).

Teknik Dot blot memiliki efisiensi waktu yang signifikan, dimana

prosedur blotting yang kompleks untuk transfer gel tidak diperlukan. Namun,
kekurangan metode dot blot adalah tidak dapat digunakan untuk mengetahui

INSTRUMENTATION & BIOMOLECULAR TECHNIQUE 1

DOT BLOT
 ukuran molekul target. Selain itu, jika dua molekul yang berbeda ukuran
terdeteksi, mereka akan tetap muncul sebagai satu titik. Oleh karena hal tersebut,
dot blot hanya dapat digunakan untuk mengkonfirmasi ada atau tidak adanya
molekul (yang dapat dideteksi oleh probe DNA atau antibodi) (Shalahudin,
2001). Hasil positif apabila terbentuk dot-dot pada membran nitroselulose.
Kualitas hasil dilihat berdasarkan gradasi warna (Pratiwi. 2004).

1.2 Tujuan

Adapun tujuan dilakukan praktikum Dot Blot ini adalah untuk :

1. Mengetahui prinsip kerja dari Dot Blot.

2. Melakukan prosedur Dot Blot.
3. Mengidentifikasi semi kuantitatif dari reaksi antigen-antibodi

INSTRUMENTATION & BIOMOLECULAR TECHNIQUE 2

DOT BLOT
 BAB II
METODE PRAKTIKUM

2.1 Pelaksanaan Kegiatan Praktikum

Praktikum Dot Blot ini dilaksanakan pada Rabu, 4 April 2018, dan
bertempat di Laboratorium Sentral Biomedik Fakultas Kedokteran Universitas
Brawijaya.
2.2 Alat dan Bahan
2.2.1 Alat
Alat yang digunakan dalam praktikum ini adalah sebagai berikut: Dot
Blotter Apparatus (BioRad), Vacum Pumps, refrigerator, mikropipet,
yellow tip, White tip, Blue tip, shaker, scanner & Computer.
2.2.2 Bahan
Bahan yang digunakan dalam praktikum ini adalah sebagai berikut:
Membran Nitrocellulose (NC), pili protein, H2O, TBS Skim Milk 5%, TBS
Tween 0,05%, antibodi primer, TBS-Tween 0.05%, BSA 0,02%, Antibodi
Sekunder MMP (M-17): sc-6841 (Policlonal Anti-mouse), Enzim AP
(Alkaline Phospatase), BCIP/NBT Phospatase Substrate, aquades.
2.3 Prosedur Kerja
Adapun prosedur kerja dalam praktikum ini dibagi menjadi beberapa tahap
sebagai berikut :
1. Membran Nitrocellulose (NC) direndam dalam aquadest selama 30 menit.
2. Membran NC diletakkan dalam Dot Blotter Apparatus (BioRad), basahi
membran NC dengan TBS (50 μL/well)
3. Inkubasi Antigen
 Buang larutan TBS dan tapping pada tissue
 Load antigen (yang telah diencerkan dengan sodium azida (NaN3)
0.02% dengan perbandingan 1:4) ke masing-masing well (50 μL/well)
 Degas hingga tidak ada larutan yang tersisa pada membrane
 Inkubasi overnight pada suhu 4°C
4. Blocking Non Spesific Area

INSTRUMENTATION & BIOMOLECULAR TECHNIQUE 3

DOT BLOT
  Membran diinkubasi dalam larutan TBS-skim milk 5% atau TBS-
BSA 2% (50 μL/well) pada suhu 4°C overnight.
5. Inkubasi Antibodi Primer
 Pada hari berikutnya, membran segera dikeluarkan dan diadaptasikan
pada suhu ruang
 Buang larutan TBS-skim/TBS-BSA, cuci dengan larutan TBS-Tween
20 0.05% (50 μL/well), kemudian ditapping dengan tissue hingga
tidak ada larutan yang tersisa, ulangi langkah ini sebanyak 3x3 menit
 Inkubasi antibodi primer (dengan rasio pengenceran 1:200) dalam
pelarut TBS-BSA 1% (50 μL/well).
 Inkubasi 2 jam (RT) atau 4°C (overnight).
6. Inkubasi Antibodi Sekunder MMP (M-17): sc-6841 (Policlonal Anti-
mouse)
 Cuci membran dengan larutan TBS-Tween 20 0.05% (50 μL/well),
kemudian ditapping dengan tissue hingga tidak ada larutan yang
tersisa, ulangi langkah ini sebanyak 3x3 menit
 Inkubasi antibodi sekunder (dengan rasio pengenceran 1:1000 –
1:2500) dalam pelarut TBS
 Inkubasi 2 jam dalam suhu ruangan
7. Inkubasi Enzim AP (Alkaline Phospatase)
 Washing membran 3x3 menit dengan larutan TBS-Tween 20 0.05%
(50 μL/well), kemudian ditapping dengan tissue hingga tidak ada
larutan yang tersisa
 Inkubasi enzim (dengan rasio pengenceran 1:1000) dalam pelarut
TBS
 Inkubasi 40 – 60 menit
8. Inkubasi Substrat
 Washing membran 3x3 menit dengan larutan TBS-Tween 20 0.05%
(50 μL/well), kemudian ditapping dengan tissue hingga tidak ada
larutan yang tersisa
 Membran direndam dalam BCIP/NBT Phospatase Substrate 50
μL/well, dark condition.

INSTRUMENTATION & BIOMOLECULAR TECHNIQUE 4

DOT BLOT
  Inkubasi selama 30 menit hingga membran berubah warna (menjadi
keunguan)
 Stop reaksi dengan aquadest
 Kering anginkan membrane
9. Scan Hasil dan analisis gradasi warna dengan software Corel Photo Paint

INSTRUMENTATION & BIOMOLECULAR TECHNIQUE 5

DOT BLOT
 BAB III
HASIL DAN PEMBAHASAN

3.1 Hasil
Hasil reaksi antigen-antibodi dengan menggunakan metode dot blot
dengan tujuan untuk mengetahui titer pengenceran dengan reaksi terkuat dapat
dilihat pada Gambar 1 Protein yang berfungsi sebagai antigen adalah pili
protein sedangkan yang berfungsi sebagai antibodi primer adalah serum yang
diambil dari mencit yang telah diimunisasi secara intraperitoneal dengan
antigen protein.

Antibodi Primer
1 2 3 4

M= 128,59 M= 157,77 M= 196,49 M= 191,32

Antigen

M= 142,74 M= 153,29 M= 100,39 M= 130,47

M= 155,98 M= 180,66 M= 86,03 M= 46,77

Gambar 1. Hasil positif terbentuk dot-dot pada membran nitroselulose dan

terbentuk gradasi warna (Pixel=859)

3.2 Pembahasan
Dot Blot merupakan metode immunoblotting dengan cara memaparkan
langsung protein pada suatu membrane.Tahap awal yang harus dilakukan
adalah mempetakan sampel yang akan dimasukkan pada dot blot apparatus,
misalkan pada baris pertama dimasukan antigen saja dengan konsentrasi

INSTRUMENTATION & BIOMOLECULAR TECHNIQUE 6

DOT BLOT
 semakin meningkat (dari kiri ke kanan), dan pada kolom pertama dimasukkan
antibodi saja dengan dosis yang semakin meningkat (dari atas ke bawah), pada
kolom dan baris lainya dimasukkan sampel sesuai dengan konsentrasi Ag dan
Ab yang telah ditentukan di kolom dan baris pertama, untuk kemudian diamati
hasilnya. Sampel yang terlarut, ditarik melalui membran dengan cara membuat
suatu keadaan vakum, protein kemudian akan berikatan dengan membran
sedangkan komponen sampel yang lain melewati membran. Protein yang
berada pada membran yang kemudian dapat dianalisis.

Pada Dot blotting tampak sebagai gambaran dot biru keunguan. Warna
dot biru keunguan yang muncul pada membran NC menunjukkan protein pili
diikat oleh antibodi anti pili protein. Dot biru keunguan pada membran NC
menunjukkan respons antigen-antibodi spesifik. Besarrnya titer antibodi
ditentukan oleh nilai pengenceran tertinggi yang masih memiliki konsistensi
ketebalan warna dot sama atau mendekati pengenceran yang pertama. Warna
biru keunguan yang semakin tipis di membran nitroselulosa pada pengenceran
tertinggi, menandakan titer antibodi yang semakin kecil. Kualitas warna dot
yang ditampilkan menunjukkan seberapa tinggi titer antibodi terhadap antigen
yang dicoatingkan pada membrane nitroselulosa.

Penghitungan semi kuantitatif dari reaksi antigen-antibodi dilakukan

dengan software Corel Photo Paint, berdasarkan penghitungan semi kuantitatif
didapatkan titer pengenceran antibodi dengan reaksi terkuat adalah pada C4
dan titer pengenceran antigen pada C4. Dari program tersebut didapat data
berupa nilai mean, standard deviasi, median dan pixel. Selanjutnya dibuat tabel
yang berisi hubungan antara keempat parameter tersebut dengan masing-
masing sampel. Dari sampel tersebut dipakai salah satu parameter saja yakni
mean untuk menghitung sensitivitas dan spesifitas metode tersebut. Dari hasil
tersebut terlihat bahwa semakin rendah angka meannya semakin tebal dot yang
didapatkan sedang semakin tinggi angka meannya maka semakin tipis dot yang
didapatkan.

Hasil dari dot blot dilakukan kuantifikasi dengan program software Corel
Photo Paint. Intensitas warna yang terlihat menunjukkan kuatnya ikatan antara

INSTRUMENTATION & BIOMOLECULAR TECHNIQUE 7

DOT BLOT
 reaksi antigen dan antibodi. Analisis warna dari dot blot dapat menunjukkan
nilai ratarata reaksi antigen-antibodi tersebut secara kuantitatif. Semakin tebal
warnanya menunjukkan nilai rata-rata yang lebih rendah, demikian sebaliknya.
Berdasarkan kuantifikasi tersebut diperoleh hasil bahwa protein mampu
menginduksi pembentukan antibodi dengan titer pengenceran antibodi yang
memiliki reaksi terkuat pada C4. Sedangkan titer pengenceran antigen yang
memiliki reaksi terkuat pada C4. Kemampuan protein ini dalam menginduksi
pembentukan antibodi selanjutnya dapat dikembangkan sebagai alat diagnostik
atau sebagai kandidat vaksin untuk mencegah infeksi.

INSTRUMENTATION & BIOMOLECULAR TECHNIQUE 8

DOT BLOT
 BAB IV
PENUTUP

4.1 Kesimpulan
Berdasarkan hasil dan pembahasan dapat disimpulkan bahwa:
1. Dot blot merupakan uji serologis yang fungsinya sama dengan western
blott, yaitu untuk mendeteksi kespesifikan reaksi antara antigen dan
antibodi.
2. Inkubasi Antigen, blocking Non Spesific Area, Inkubasi antibodi primer,
Inkubasi antibodi sekunder, Inkubasi enzim AP, Inkubasi substrat, stop
reaksi.
3. Hasil positif apabila terbentuk dot-dot pada membran nitroselulose.
Kualitas hasil dilihat berdasarkan gradasi warna.

INSTRUMENTATION & BIOMOLECULAR TECHNIQUE 9

DOT BLOT
 DAFTAR PUSTAKA

Kurien, B. T., Dorri, Y., Dillon, S., Dsouza, A., & Scofield, R.H. (2011). An
Overview of Western Blotting for Determining Antibody Specificities for
Immunohistochemistry. Signal Transduction Immunohistochemistry:
Methods and Protocols, Methods in Molecular Biology, 717:55-67.
Manzila, I., Jumanto H., Rusmilah Suseno, dan S. Hendrastuti H. 2005. Produksi
antibody poliklonal peanut stripe virus. Jurnal Bioteknologi Pertanian. Vol.
10, No.2, pp. 39-44.
Pratiwi.wara. 2004. Sensitivitas dan Spesifisitas metode Dot Blot menggunakan
Antigen Outer Membrane Protein Klebsiella pneumoniae yang Direspon
Secretory-Immunoglobulin A Sputum Penderita Terinfeksi Klebsiella
pneumoniaeJurnal Kedokteran Brawijaya,
Shalahudin, H.D. 2001. Pengembangan Uji Penapisan Antibodi terhadap Simian
Retrovirus Tipe-D Serotipe-2 (SRV-2) dengan Teknik Dot Blot Immunoassay
(DBIA). Skripsi. IPB. Bogor.
Smith J., Mabuchi M., Nadler T., et al. 2012. Rapid Screening of the Epidermal
Growth Factor Receptor Phosphosignaling Pathway via Microplate-Based
Dot Blot Assays. International Journal of Proteomics.

INSTRUMENTATION & BIOMOLECULAR TECHNIQUE 10

DOT BLOT

View publication stats