Prosedur Dasar Teknologi DNA Rekombinan

Prosedur dasar teknologi DNA Rekombinan yang akan dikemukakan pada bagian ini
dibatasi lebih pada teknik yang diperantarai oleh vektor. Urutan proses yang menjadi prosedur
dasar pada teknik DNA rekombinan yang diperantarai vector akan dikemukakan lebih lanjut
(Klug dkk, 1994).
1. Pembuatan fragmen DNA dengan bantuan enzim nuclease restriksi yang mengenal dan
memotong molekul DNA pada urut-urutan nukleotida yang spesifik.
2. Segmen-segmen tersebut digabung ke molekul DNA lain dengan bantuan vector. Vector
dapat bereplikasi secara otonom sehingga memfasilitasi manipulasi dan identifikasi molekul
DNA yang baru terbentuk.
3. Vektor yang sudah terinsersi segmen DNA ditransfer ke suatu sel inang. Di dalama sel
tersebut molekul DNA rekombinana (yang tersusun dari segmen yang terinsersi) direplikasi
menghasilkan berlusin-lusin salinan yang disbeut klon-klon.
4. Segmen-segmen DNA yang diklon dapat diambil dari sel inang, dimurnikan dan dianalisis.
5. Sel-sel inang yang mengandung DNA rekombinan mewariskan kepada seluruh sel turunan,
menghasilkan suatu populasi sel-sel yang identic yang semuanya membawahi urut-urutan
yang diklon.
6. Secara potensial, DNA yang diklon dapat ditranskripsikan, RNAd-nya ditranslasikan, serta
produk-produk gennya diisolasi dan dikaji.

Peran Enzim Endonuklease Restriksi

Sebagaimana yang sudah disebutkan, pada urutan pertama proses yang menjadi prosedur
dasar teknik DNA rekombinan yang diperantarai oleh vektor enzim endonukelase dibutuhkan
untuk memotong molekul DNA dalam rangka pembuatan fragmen DNA. Jelaslah bahwa pada
teknik DNA rekombinan tidak dapat dibentuk tanpa bantuan enzim endonuklease restriksi.
Enzim itu memang dapat memotong molekul DNA unting ganda pada urutan pasangan
nukleotida spesifik yang dikenal sebagai tapak restriksi (Russel, 1992).
Sejauh yang dilaporkan, pada berbagai makhluk hidup prokariotik tidak ada enzim
endonuclease restriksi yang serupa satu sama lain (Russel, 1992). Penamaan enzim endonuclease
restriksi diberi nama berdasarkan macam makhluk hidup tempat enzim tersebut diisolasi; secara
konvensional digunakan sistem tiga huruf dalam posisi miring yang diikuti denga suatu angka
romawi. Huruf-huruf tambahan kadang-kadang disertakan untuk menendai suatu strain teryentu.
Sebagai contoh misalnya, Bgl ii berasal dari Bacillys globigi, Eco RI berasal dari E. coli strain
Ry 13 dan Hind III berasal dari Haemophilus influenza strain Rd.
Enzim endonuclease restriksi terbagi menjadi dua kelompok atau tipe (Russel, 1992).
Tipe I akan mengenali suatu urutan pasangan nukleotida yang spesifik pada DNA dan
selanjutnya memotong DNA pada suatu tapak tidak spesifik jauh dari urutan tadi. Oleh karena
tapak pemotongan tidak spesifik, enzim endonuclease restriksi tipe I tidak terlalu bermanfaat
untuk pembentukan molekul DNA rekombinan.
 Enzim endonuclease restiksi tipe II juga mengenal suatu urutan pasangan nukleotida
spesifik pada DNA namun tipe ini memotong DNA justru di dalam urutan tadi (Russel, 1992).
Oleh karena itu pemotongan DNA selalu pada urutan yang sama (tapak yang sama, maka enzim
endonuklease restriksi II sangan bermanfaat untuk pembentukan molekul DNA rekombinan.
Urutan pengenalan enzim endonuklease restriksi tipe II memiliki suatu sumbu simetri yang
melewati titik tengah urutan pengenalan (Russel, 1992). Dalam hal ini, urutan basa 5’→3’ pada
unting DNA sama dengan urutan basa 5’→3’ pada komplementernya. Oleh karena itu, urutan itu
disebut sebagai two fold rotational symmetry.
Enzim edonuklease restriksi juga sudah diisolasi dari sejumlah besar strain bakteri yang
berbeda (Russel, 1992). Oleh karena itu, tiap enzim memotong DNA pada suatu urutan pasang
nukleotida yang spesifik untuk enzim yang bersangkutan, jumlah potongan yang dibuat enzim
pada suatu molekul. DNA tertentu tergantung pada jumlah berapa kali urutan pengenalan
ditemukan pada DNA. Pada beberapa kasus, enzim yang berbeda mengenal dan memotong
urutan pasangan nukleotida yang sama. Enzim yang semacam itu disebut sebagai isoschizomer.
Sebagian pemutusan DNA oleh enzim endonuklease restriksi restriksi tipe II terjadi pada
posisi menyamping, tetapi sebagian lagi pada posisi berhadapan. Pemutusan DNA pada posisi
menyamping menghasilkan ujung 5’ lancip ataupun ujung 3’ lancip; sedangkan pemutusan pada
posisi berhadapan menghasilkan ujung tumpul. Enzim endonuclease restriksi tipe 2
menghasilkan ujung-ujung lancip yang memiliki nilai khusus pada pengklonal fragmen-fragmen
DNA jika kedua ujung tajam hasil pemotongan bertemu dalam larutan, maka akan berbentuk
pasangan basa yang sempurna (ikatan kimia antar gula dan asam fosfat akan terbentuk di bawah
pengaruh enzim DNA ligase.

Tabel 3. Peluang jumlah tapak pemutusan pada molekul DNA oleh enzim endonuklease restriksi
tipe II (Russel, 1992)
Pasangan nukleotida pada tapak restriksi Probabilitas kejadian

4 (1/4)4 = 1 dalam 256 bp

5 (1/4)5 = 1 dalam 1024 bp
6 (1/4)6 = 1 dalam 4096 bp
8 (1/4)8 = 1 dalam 65, 476 bp
11 (1/4)11
Peluang jumlah tapak pemutusan pada suatu molekul DNA oleh enzim endonuclease restriksi
tipe II dapat dihitung dalam kaitannya dengan jumlah pasangan nukleotida pada setiap urutan
pengenal, sepanjang keberadaan tiap pasangan, nukleotida bersifat acak. Peluang jumlah tersebut
ditunjukkan pada Tabel 3.

Seleksi Klon Rekombinan

 Seringkali perlu diketahui urutan yang mana dari fragmen DNA restriksi yang
ditranskripsi menjadi RNA atau bagaimana membuat peta urutan-urutan hasil hibridasi dengan
fragmen-fragmen restriksi. Oleh karena itu Southern mengembangkan suatu metode untuk
mendeteksi fragmen – fragmen di dalam sel agarose yang komplementer dengan uu=rutan RNA
atau DNA tertentu. Metode ini dikenal sebagai Southern Blotting yang kemudian dikembangkan
untuk menganalisis RNA dan protein yang dikenal dengan Nothern dan Western blotting.
Pada intinya, teknik blotting ini mentransfer makro molekul dari gel yang berarti mereka
telah dipisahkan secara elektroforesis ke permukaan suatu membrane. Sekali di transformasi,
makromolekul ini akan atau dapat difiksasi secara permanen pada membran. Membrane ini
relatif mudah ditangani dan dapat dipakai untuk berbagai macam teknik analisis. Sebagai
akibatnya membrane ini juga luas dan pemakaiannya dalam mendeteksi dan menganalisis asam
dan protein.

Manfaat dan Resiko Rekayasa Genetika

Rekayasa genetik digambarkan sebagai ilmu dimana karakteristik suatu organisme yang
sengaja dimodifikasi dengan manipulasi materi genetik, terutama DNA dan transformasi gen
tertentu untuk menciptakan variasi yang baru. Dengan memanipulasi DNA dan
memindahkannya dari satu organisme ke organisme lain (disebut teknik rekombinan DNA),
memungkinkan untuk memasukkan sifat dari hampir semua organisme pada tanaman, bakteri,
virus atau hewan. Organisme transgenik saat ini diproduksi secara massal, seperti enzim,
antibodi monoklonal, nutrien, hormon dan produk farmasi yaitu obat dan vaksin (Brown, 1996;
Campbell, 1996).
Manfaat analisis rekyasa genetika dapat dilihat dalam kiatannya dengan analisis genetik,
diagnosis molekuler atas penyakit manusia, terapi gen, sidik jari DNA, serta bioteknologi (Klug
dkk., 1994). Adapun potensi manfaat pada makanan hasil rekayasa genetik sebagaimana yang
dikutip pada tulisan Pramashinta dkk (2014) antara lain : (1) Peningkatan ketersediaan pangan,
(2) Peningkatan umur simpan dan kualitas organoleptik makanan, (3) Peningkatan kualitas gizi
dan manfaat kesehatan, (4) Peningkatan kualitas protein, (5) Peningkatan kandungan karbohidrat
makanan, (6) Peningkatan kuantitas dan kualitas daging dan susu, (7) Peningkatan yield tanaman
pertanian, (8) Pembuatan vaksin dan obat-obatan yang edible atau dapat dimakan, (9) Ketahanan
biologis terhadap penyakit, hama, gulma, herbisida dan virus, (10) Bioremidiasi, (11) Efek
positif pada produk pertanian/makanan, (12) Perlindungan lingkungan, (13) Tanaman rekayasa
genetik berfungsi sebagai biofactories dan sumber dari bahan baku industri, (14) Terciptanya
lapangan kerja.
Adapun manfaat rekayasa genetika yang terkait kepentingan diatas akan diperjelas secara
ringkas sebagai berikut:
Analisis Genetik
Selama teknik-teknik DNA rekombinasi untuk kepentingan analisis genetik. Teknik-
teknik itu memungkinkan penggandaan suatu kumpulan klon yang meliputi keseluruhan klon
demikian pula memungkinkan pemetaan genetik maupun fisik yang lengkap, serta
memungkinkan penetapan urutan nukleotida dari keseleuruhan kromosom. Dari analisis tersebut
salah satunya telah ditemukan ukuran genome beberapa makhluk hidup.
Proyek genome manusia mulai dirintis sejak tahun 1986 dan sejak 1988 dilaksanakan
suatu rencana royek genome manusia berjangak 5 tahun (Klug dkk., 1994). Negara-negara yang
juga sudah melaksanakan proyek genome manusia adalah perancis,inggris, dan jepang. Analisis
genetik manusia ini sudah memungkinkan untuk membuat peta kelamin genetik manusia natara
lain dengan bantuan penanda rflp (retriction fragment lenght polymerphism).

Diagnosis Molekuler atas Penyakit Manusia

Teknologi DNA rekombinan sudah terbukti menjadi suatu alat yang sangat sensitive dan
teliti untuk mendeteksi kelainan-kelainan genetika (Klug dkk., 1994). Pemanfaatan urutan DNA
yang di klon memungkinkan pengamatan langsung terhadap genotip dari  pada pengamatan atas
suatu produk gen yang belum dikenal atau tidak terekspresi. Sebagai contoh deteksi molekuler
dapat diinduksikan atas thelessemia dan sickle cell anemia.
Terapi Gen
Pada mulanya kemampuan mengklon dan mengisolasi gen-gen spesifik manusia yang
dikembangkan sebagai suatu kegiatan penelitian, sekarang sedang b digunakan dalam bidang
kedokteran secara operasional untuk mengani kelainan-kelainan menurun dan cara yang
ditempuh adalah mengganti gen cacat dengan salinan gen normal (klug dkk, 1994). Yang mana
prosesnya dikenal sebagai terapi gen. Sudah banyak metode yang diterapkan dalam memasukkan
gen ke dalam sel manusia termasuk pemanfaatan vektor virus maupun fusi sel dengan vesikula
buatan yang mengandung urutan dna yang diklon, transfer kimiawi yang mendorong
pengangkutan gen melewati membran sel jika sudah dilakukan. Panduan terapi yang sudah
ditemukan seduah ditemukan berdasarkan prasyarat berikut (Klug,dkk 1994) :
a. Gen harus diisolasi dan ditransfer  
b. Cara transfer gen yang efektif harus ada
c. Jaringan target harus dapat tercapai sebagai contoh, percobaan terapi gen yang pertama
menggunakan sel-sel darah putih ataupun prekusornya sebgai jaringan target.
d. Terapi gen tidak boleh menyakiti pasien dan sudah tidak ada cara terapi lain yang efektif

Sidik Jari DNA

RFLP sudah digunakan untuk membedakan salinan gen yang normal dari yang mutan dan
dapat digunakan sebagai penanda genetik , karena polimorfisme tersebut diwariskan dalam pola
kodominan (Klug dkk,1994). Fenotip dari penanda-pennda ini berupa susunan atau deretan
fragmen dna berbagai ukuran yang ada pada southern blout, sesudah dna dipotong dengan suatu
enzim endonuklease restriksi. Suatu tipe rflp kedua muncul dari variasi jumlah urutan berulang
tandem. Dna yang ada diantara dua tapak enzim edonuklease restriksi. Urutan tersebut berasal
dari dua hingga dua puluh nukleotida.
 Pola pita yang dihasilkan ketika urutan vnrt dipotong dengan menggunakan enzim
endonuklease restriksi dan divisualisasikan dengan southern blotting itulah yang dikenal sebgai
sidik jari dna. Rflp tersebut ekuivalen dengan sidik jari konvensional karena pola pita yang
dihasilkan berbeda beda dari orang per orang.

Bioteknologi
Pemanfaatan rekayasa genetika atau teknologi DNA rekombinan dalam bidang
bioteknologi untuk kepentingan manusia. Pada rekayasa genetika masing-masing jaringan
dikendalikan oleh banyak gen, jadi untuk mengubah bentuk tubuh maupun irtelegensi manusia
pada saat sekarang masih jauh dari jangkauan teknologi genetika yang diketahui.
Bioteknologi di bidang pertanian menjanjikan masa depan namun ada keterbatasan
bioteknologi pertanian. Menurut Micklos dan Freyer (1990) kesulitan analisis genetika dibidang
pertanian disebabkan oleh: (1) pertumbuhan tanaman yang lambat dan umur pergantian generasi
yang lama, (2) besarnya genom tanaman, termasuk banyaknya kromosom peliploid, dan (3)
dimilikinya “kotak kayu” yaitu dinding sel berupa selulose yang mengelilingi tanaman. Oleh
karena itu, penelitian dilakukan terutama untuk sifat-sifat yang dikendalikan oleh gen tunggal
masalahnya, kebanyakan sifat dikendalikan oleh banyak gen (multigen) sehingga sifat yang
dikendalikan oleh banyak gen sulit direkayasa dan dikendalikan.
Misalnya tumbuhan memerlukan oksigen untuk membuat protein, tetapi mereka tidak
dapat memanfaatkan secara langsung nitrogen dari udara. Perakaran kacang tanah, kedelai, dan
semanggi mengandung bakteri bintil akar yang dapat mengubah (mengfiksasi) nitrogen diudara
menjadi bentuk yang dapat dimanfaatkan. Tetapi perakaran tanaman lain seperti jagung dan padi
harus memperoleh nitrogen dari pupuk atau dari produk samping organisme lain yang
“meninggalkan nitrogen yang tersedia dari dalam tanah”. Apabila dapat diciptakan jagung yang
dapat membuat nitrogen tentulah dapat mengurangi biaya pemupukan, termasuk mengurangi
pencemaran system perairan karena masuknya sisa-sisa pemupukan nitrat dan fosfat dari tanah
pertanian. Sayangnya, pada saat ini memproduksi tanaman budidaya pemfiksasi nitrogen
(misalnya jagung).

Fiksasi nitrogen
Dikendalikan oleh lebih dari 15 gen yang berbeda dalam sistem bakteru/tanaman. Banyak
diantaranya melibatkan gen-gen yang sampai saat ini belum berhasil diisolasi (dipisahkan).
Bahkan kalaupun gen-gennya dapat dipisahkan, ilmuan masih harus mengatasi masalah
kesulitan-kesulitan dalam memindahkan gen-gen itu ke dalam tubuh tanaman budidaya yang
penting tersebut, misalnya jagung. Gen-gen itu harus diletakkan pada sisi / tempat tertentudalam
kromosom tanaman agar dapat berfungsi, sementara ilmuwan belum menentukan cara
bagaimana meletakkan gen yang diinginkan tersebut ke lokasi yang tepat. Bahkan bila jagung
dan tanaman budidaya yang penting tersebut telah dapat menerima gen pemfiksasi nitrogen,
masih tetap belum diketahui bagaimana caranya mengatur “kerja” dan “tidak kerja” gennya
(“on” dan “off” nya).
 Peneliti tanaman menghadapi masalah-masalah yang sama dalam upaya mereka untuk
merekayasa secara genetis pengembangan kemampuan tanaman dalam fotosintesis (misalnya
mengubah tanaman C3 menjadi tanaman C4 yang lebih efisien energy) dalam toleransi terhadap
kekeringan dan dalam hal sifat meningkatkan jumlah panen. Peneliti hewan bekerja keras
mengupayakan agar ternak yang lebih baik juga menghadapi masalah-masalah serupa sehingga
umumnya mereka membatasi diri dalam penyelidikan sifat-sifat yang dibawa oleh gen tunggal
yang tidak menuntut penyisipan secara tepat gen-gen ke dalam genom hewan tertentu.
Menciptakan dasar yang kokoh bagi keberhasilan pengambangan rekayasa genetika di
Indonesia
Gagasan yang dikemukakan pada bagian ini sudah pernah dikemukakan dalam seminar
nasional bioteknologi pertanian di IPB (Corebima. 1987). Keinginan kita adalah agar supaya
sebagai suatu ilmu terapan baru dalam biologi si Indonesia, Rekayasa genetika dapat dikuasai
dan dikembangkan. Usaha yang baru dilakukan untuk menunjang harapan itu adalah secepat
mungkin menciptakan dasar yang kokoh bagi pengembangan rekayasa genetika yang dilakukan,
harapan lebih berhasil sehingga kita tidak selalu hanya mampu melakukan alih teknologi saja.
Dasar yang kokoh bagi pengembangan rekayasa di Indonesia adalah umpan dan
berkembangnya ilmu-ilmu murni pendukung. Inilah dasar utama bagi pengembangan rekayasa
genetika sebagai ilmu terapan, di samping faktor-faktor lain. Hal itu berarti bahwa ilmu-ilmu
murni dalam genetika, biokimia, biologi molekuler, dan sebagainya, harus tumbuh dan
berkembang. Perkembangan ilmu-ilmu murni itu harus ditunjang oleh tenaga-tenaga handal dan
prasarana yang dibutuhkan.
Suatu cara pengadaan tenaga handal akan menekuni usaha-usaha pengembangan ilmu-
ilmu murni adalah berupa perbaikan dan pembenahan dalam jalur sekolah. Dan antara tenaga-
tenaga handal yang memili ilmu murni yang kuat, diharapkan akan banyak muncul karya
penelitian murni yang dapat mendorong pertumbuhan dan perkembangan ilmu-ilmu murni dalam
genetika biokimia, biologi molekuler dan sebagainya. Atas dasar ilmu murni terapan yang sudah
berkembang inilah, diharapkan laju pertumbuhan dan perkembangan ilm-ilmu terapan termasuk
rekayasa genetika semakin dipercepat.
Daftar Rujukan
Brown KS. 1996. Prescription: one plant please. Bioscience. 46 (2) : 82.
Campbell POQ. 1996. Super Foods: Agricultural Products And Genetic Engineering. Biology
Digest. 1 (23) : 10–7.
Pramashinta, Alice., Riska, Listiyana., Hadiyanto. 2014. Bioteknologi Pangan: Sejarah, Manfaat
dan Potensi Risiko. Jurnal Aplikasi Teknologi Pangan. 3 (1): 1-6
Wiji Astutik

1. Apakah jagung hasil rekayasa genetika dapat membunuh satwa?

Jawab: Bisa , jagung hasil rekayasa genetika berbahaya bagi hama dan satwa lainnya,
Serbuk sari jagung hasil rekayasa genetika memproduksi sendiri insektisida dengan
konsentrasi tertinggi. Ini ampuh dalam membunuh hama, namun juga berakibat buruk bagi
kupu-kupu serta ngengat yang tidak berbahaya bagi jagung.
2. Apa peranan rekayasa genetika dalam kehidupan manusia?
Jawab: Dalam bidang kedokteran, pada manusia, manfaat yang paling menjanjikan dari
rekayasa genetika adalah terapi gen yang merupakan pengobatan suatu penyakit dimana gen
yang cacat diperbaiki dan diganti atau gen terapeutik diperkenalkan untuk melawan
penyakit. Selama decade terakhir, banyak penyakit autimun dan hati telah diobati
menggunakan terapi gen. dalam bidang pertanian, telah dimanfaatkan terutama untuk
memberikan karakter atau sifat baru pada berbagai jenis tanaman. Teknologi rekayasa
genetika tanaman memungkinkan pengintegrasian gen-gen yang berasal dari organisme lain
untuk perbaikan sifat tanaman.