Terminal fragmen restriksi panjang polimorfisme (T-RFLP) analisis digunakan untuk karakterisasi

flora bakteri oral pada air liur dari 18 subyek sehat dan 18 pasien dengan periodontitis. 16S
gen rRNA (rDNAs) dari bakteri mulut dan spirochaetes dalam air liur diamplifikasi dengan PCR
dengan
6
9
karboksi-fluorescein (6-FAM) -labelled maju primer yang universal (27F) dan reverse yang universal
primer (1492R) atau
Spirochaeta
-selective primer sebaliknya. 16S rDNAs yang dicerna dengan
enzim restriksi dengan situs pengakuan 4 bp (
hha
IOR
msp
I) dan dianalisis dengan menggunakan otomatis
DNA sequencer. pola T-RFLP yang numerik dianalisis menggunakan program komputer. Dari
analisis komunitas bakteri mulut, pola yang berasal dari mata pelajaran periodontal yang sehat dan
pasien dengan periodontitis dikelompokkan ke dalam kelompok yang berbeda, meskipun dengan
beberapa ketidakpastian.
Sampel dari pasien dengan periodontitis cenderung mengelompok ke dalam jenis masing-masing
(agresif
dan periodontitis kronis), meskipun ini tidak sangat jelas. Analisis masyarakat spirochaetal
menggunakan T-RFLP menunjukkan bahwa pola yang berasal dari pasien dengan periodontitis
dikelompokkan lebih
dibandingkan dengan analisis komunitas bakteri oral. Hasil ini menunjukkan bahwa sampel
dari pasien dengan periodontitis mengandung keragaman tak terduga. pola T-RFLP 16S rDNAs
dari sampel air liur dari dua mata pelajaran periodontal yang sehat selama periode 5 minggu
menunjukkan host-spesifik
flora bakteri mulut yang relatif stabil. Studi kami menunjukkan bahwa analisis T-RFLP berguna untuk
penilaian keanekaragaman flora bakteri mulut dan perbandingan cepat dari struktur komunitas
antara subjek dengan dan tanpa periodontitis

PENGANTAR
Sejumlah besar dan berbagai bakteri yang ada pada manusia
rongga mulut. Namun, analisis komunitas bakteri ini
telah dibatasi oleh meth- budaya tergantung konvensional
ods; dengan demikian, banyak bakteri mulut tetap tak berbudaya dan
uncharacterized. Akibatnya, studi kausal mikro
organisme dari penyakit mulut termasuk penyakit periodontal
yang, secara umum, terbatas pada spesies diolah.
Baru-baru ini, pendekatan filogenetik berdasarkan gen 16S rRNA
(RDNA) telah diterapkan untuk menyelidiki keragaman
diolah dan non-ditanami spesies di mulut manusia
rongga tanpa budidaya (Choi
et al.
1994, 1996; Dymock
et al.
1996; Kroes
et al.
1999; paster
et al.
2001; Sakamoto
et al.
2000; Spratt
et al.
1999). 16S rDNA perpustakaan clone
Metode dapat memberikan informasi urutan langsung. paster
et al
. (2001) menunjukkan bahwa subgingiva dominan
komunitas mikroba terdiri dari 347 spesies atau phylotypes,
berdasarkan analisis dari 2.522 klon 16S rRNA. Namun,
analisis individu klon 16S rDNA adalah mahal dan
Pendekatan sangat tidak efisien untuk perbandingan dari multi-
tude dari komunitas bakteri.
Terminal fragmen restriksi panjang polimorfisme (T
RFLP) adalah pendekatan molekuler baru yang memungkinkan Assessment tersebut
ment dari keragaman komunitas bakteri kompleks dan
perbandingan cepat dari struktur masyarakat dan keanekaragaman
ekosistem yang berbeda (Liu
et al.
, 1997). Teknik ini memiliki
telah digunakan untuk menilai keragaman dan struktur yang kompleks
komunitas bakteri dalam berbagai lingkungan (Clement

1999) dan dievaluasi di terpisah

Ulasan artikel (Kitts, 2001; Marsh, 1999). Selain itu, Tprogram analisis RFLP (
KERAN
) Telah dikembangkan dan
dipublikasikan di web di seluruh dunia (http://rdp.cme.msu.edu/
html / analyses.html) (Marsh
et al.
, 2000). memahami
flora bakteri dalam rongga mulut manusia adalah penting untuk penuh
deskripsi bakteri penyebab penyakit periodontal.
Metode T-RFLP memungkinkan pengakuan beragam lisan
flora bakteri dan perbandingan cepat masyarakat
struktur antara pasien dengan periodontitis. Oleh karena itu, ini
Metode mungkin juga berguna untuk diagnosis cepat
Penyakit periodontal, meskipun belum diterapkan
untuk diagnosis penyakit tersebut.
Dalam studi komunitas bakteri mulut, air liur tampaknya
menjadi sampel yang paling cocok, karena dianggap mengandung
berbagai bakteri dari situs lisan yang berbeda (lidah misalnya,
plak subgingiva, plak supragingiva), selain
kemudahan sampling. Dalam analisis 16S rDNA clone perpustakaan
saliva manusia, kami menemukan flora bakteri mulut yang sehat
tunduk berbeda dari yang pada pasien periodontitis
(Sakamoto
et al.
, 2000). Temuan ini mengindikasikan bahwa penggunaan
air liur serta plak subgingiva dalam analisis lisan
komunitas bakteri efektif. Selain itu, periodonto-
bakteri pathic seperti
Actinobacillus actinomycetemcomi-
tans
.
Tannerella forsythensis
(dahulu
Bacteroides forsythus
)
(Sakamoto
et al.
2002),
Porphyromonas gingivalis
.
Trepone-
ma denticola
dan
Treponema socranskii
lebih sering
terdeteksi dalam air liur dari dalam sampel plak subgingiva oleh
real-time PCR (Sakamoto
et al.
2001). Hasil ini con-
menguat mereka dari studi sebelumnya (Umeda
et al.
1998). Itu
tingkat bakteri sasaran dapat bervariasi dari saku untuk
saku dan sampel dikumpulkan dari situs periodontitis mungkin
kadang-kadang menjadi organisme hilang. Ini juga mungkin keseluruhan yang
air liur hanya mengandung konsentrasi tinggi dari target yang bakterial
teria dari sampel plak subgingiva. Temuan nyarankan- ini

gested air liur yang sama atau lebih baik dari plak subgingiva
untuk mendeteksi dan mengukur bakteri periodontopathic di
rongga mulut.
Dalam penelitian ini, kami menggunakan analisis T-RFLP untuk mengkarakterisasi
dan membandingkan lisan bakteri flora yang hadir dalam sampel air liur dari
subyek sehat dan pasien dengan periodontitis. Sebagai tujuan
dari penelitian ini adalah untuk menerapkan teknik baru untuk mengevaluasi
keragaman spesies diolah dan non-diolah di
rongga mulut manusia, pendekatan budidaya bergantung
tidak digunakan. Untuk pengetahuan kita, ini adalah laporan pertama pada
karakterisasi flora bakteri oral berdasarkan T-RFLP
pola.
METODE
strain bakteri dan ekstraksi DNA.
strain bakteri yang digunakan dalam
penelitian ini tercantum dalam Tabel 1. Semua bakteri tumbuh di bawah
kondisi budaya yang sesuai. DNA bakteri disiapkan sebagai de-
jelaskan sebelumnya (Sakamoto
et al.
1999).
populasi subjek.
Pasien dengan periodontitis dibagi menjadi
tiga kelompok berdasarkan jumlah probing kedalaman (PD). (I) Kelompok 1
(Periodontitis awal; P2, P3, P8, P10, P14 dan P18) didefinisikan sebagai
berikut: gigi dengan PD
>
4 mm kurang dari 50% dari non-hilang
gigi. (Ii) Kelompok 2 (moderat periodontitis, P4, P5, P7, P9, P11 dan P15)
didefinisikan sebagai berikut: gigi dengan PD
>
4 mm adalah 50% atau lebih dari
non-hilang gigi dan gigi dengan PD
>
6 mm kurang dari 30% dari
gigi non-hilang. (Iii) Kelompok 3 (periodontitis parah; P1, P6, P12, P13,
P16 dan P17) didefinisikan sebagai berikut: gigi dengan PD
>
4 mm adalah 50%
atau lebih gigi non-hilang dan gigi dengan PD
>
6 mm sebanyak 30% atau
lebih gigi non-hilang.
pengumpulan sampel dan ekstraksi DNA.
sampel air liur yang col
lected dalam tabung plastik steril dari atas 18 pasien dengan periodontal
dontitis [usia rata-rata
?
standar deviasi (
SD
)
¼
45 · 8
?
14 · 5 tahun] dan
dari 18 subyek periodontal yang sehat (33 · 4
?
11 · 7 tahun). 0 · 5 ml
Download dari www.microbiologyresearch.org oleh
IP: 114.125.29.100
Pada: Thu, 23 Mar 2017 06:38:30
aliquot dari sampel air liur diencerkan dengan penyangga (10 mM Tris / HCl dan 50
mM EDTA, pH 8 · 0) dalam rasio 1: 2 (v / v), dan dicuci dengan sama
penyangga. Pelet sel bakteri yang diperoleh kemudian disuspensi di 0 · 5 ml
buffer yang mengandung lisozim yang sama (konsentrasi akhir 5 mg
ml
?
1
) dan
N
-acetylmuramidase (konsentrasi akhir 1 mg ml
?
1
).
Setelah inkubasi pada 37
8
C selama 1 jam, proteinase K dan SDS ditambahkan ke
konsentrasi akhir 2 mg ml
?
1
dan 1% (w / v), masing-masing. Itu
Campuran diinkubasi pada 50
8
C selama 2 jam. asam nukleat yang dirilis oleh
tiga siklus pembekuan dalam
?
80
8
C freezer diikuti dengan pencairan dalam
65
8
C air mandi. Campuran itu kemudian diekstraksi dengan volume yang sama
fenol (jenuh dengan 10 mM Tris / HCl, pH 8 · 0) dan fenol / kloroform
bentuk-isoamil alkohol (25: 24: 1). asam nukleat massal diendapkan
dari solusi dengan isopropil alkohol diikuti dengan sentrifugasi. Itu
DNA endapan dicuci dengan 70% etanol dan diresuspensi dalam
100
saya
l TE (10 mM Tris / HCl dan 1 mM EDTA, pH 8 · 0). RNase adalah
ditambahkan ke konsentrasi akhir 10
saya
gml
?
1
, Dan campuran itu
diinkubasi pada 37
8
C selama 1 jam. DNA diendapkan lagi dengan
isopropil alkohol. The DNA pellet dengan sentrifugasi, dicuci dengan
70% etanol, dikeringkan dalam vakum selama 10 menit, dan dilarutkan dalam 100
saya
lofTE
penyangga.
PCR amplifikasi 16S rDNA.
Primer yang digunakan untuk PCR
amplifikasi urutan 16S rDNA yang 27F (5
9
-AGAGTTT
GATCCTGGCTCAG-3
9
)
dan
1492R
(5
9
-GGTTACCTTGTTACG
ACTT-3
9
) (Lane, 1991) atau
Spirochaeta
-selective primer terbalik
(5
9
-GTTACGACTTCACCCTCCT-3
9
) (Paster
et al.
2001; Dewhirst
et
Al.
, 2000). 27F dicap di 5
9
berakhir dengan 6
9
-carboxyfluorescein
(6-FAM), yang disintesis oleh Applied Biosystems Jepang. Ampli-
Reaksi fikasi dilakukan dalam volume total 50
saya
l mengandung
5
saya
l terlarut DNA (100 ng), 1 · 25 U
Takara Ex Taq
(Takara Shuzo),
5
saya
L10
3
ex Taq
penyangga, 4
saya
l dNTP campuran (2 · 5 mM masing-masing) dan 10 pmol
masing-masing primer. 16S rDNAs diamplifikasi dalam Biometra thermocycler
TGradient menggunakan program berikut: 95
8
C selama 3 menit, diikuti oleh
30 siklus yang terdiri dari 95
8
C selama 30 s, 50
8
C selama 30 s dan 72
8
C selama 1 · 5 menit,
dengan masa perpanjangan akhir pada 72
8
C selama 10 menit.
Spirochaeta
-spesifik
16S rDNAs diamplifikasi menggunakan protokol berikut (Paster
et al.
.
2001; Dewhirst
et al.
2000): 95
8
C selama 3 menit, diikuti dengan 30 siklus
yang terdiri dari 94
8
C selama 45 s, 60
8
C selama 45 s dan 72
8
C selama 1 · 5 menit dengan
tambahan 5 s untuk setiap siklus, dengan masa perpanjangan akhir pada 72
8
C untuk
15 menit. Amplified DNA telah diverifikasi dengan elektroforesis dari aliquot dari
campuran PCR (2
saya
l) dalam 1 · 5% agarose dalam 1
3
TAE penyangga. produk PCR
dimurnikan dengan metode presipitasi PEG (Hiraishi
et al.
, 1995)
dengan beberapa modifikasi. A 50
saya
l aliquot dari solusi 16S rDNA adalah
dicampur dengan 30
saya
l larutan PEG (40% PEG 6000 dan 10 mM MgCl
2
)
dan 12
saya
l 3 M natrium asetat, terguncang lembut selama 10 menit pada ruang
suhu, dan disentrifugasi pada 14 000 r.p.m. selama 15 menit. super- yang
natant telah dihapus dengan hati-hati oleh pipetting, dan kemudian diendapkan
DNA dicuci dua kali dengan 70% etanol dan dilarutkan kembali dalam 20
saya
l
air suling steril. Dimurnikan 16S rDNAs disimpan pada
?
20
8
C sampai
analisis.
analisis T-RFLP.
Itu......

HASIL DAN DISKUSI

analisis T-RFLP dari organisme tunggal
T-RF panjang ditentukan untuk semua bakteri yang digunakan. Itu
diamati panjang T-RF yang berbeda (dengan 4 bp) dari
diperkirakan panjang (Tabel 1), dengan satu pengecualian: diamati
panjang T-RF (29 bp) dari
Treponema
spesies setelah pencernaan
dengan
hha
Saya 8 bp lebih kecil dari panjang diprediksi (37
bp). Meskipun panjang diperkirakan berada dalam kisaran
standar (29-926 bp), perbedaan yang diamati. Itu
Alasan untuk perbedaan ini tidak diketahui. Selain itu,
panjang T-RF diamati
Fusobacterium nucleatum
.
T
.
denticola
dan
Treponema vincentii
setelah pencernaan dengan
msp
saya
adalah 10, 7 dan 7 bp lebih besar dari panjang diprediksi,
masing-masing. Namun, dengan menggunakan satu-satunya ukuran standar GS
500 ROX, diamati T-RF panjang dari
F
.
nucleatum
(283
bp),
T
.
denticola
(281 bp) dan
T. vincentii
(288 bp) yang
dalam waktu 3 bp dari prediksi panjang T-RF. temuan ini
menekankan pentingnya memilih standar yang cocok untuk
penentuan akurat ukuran fragmen. discre- ini
pancies antara diprediksi dan diamati panjang T-RF memiliki
telah dilaporkan sebelumnya (Liu
et al.
1997; Sejuk
et al.
.
1998; Kaplan
et al.
2001; Kitts, 2001). Untuk mengimbangi
perbedaan, Kaplan
et al
. (2001) menggunakan jendela pencocokan
yang memungkinkan panjang T-RF diamati (dari sampel) untuk menjadi
dalam 1 ke
?
4 dari prediksi panjang T-RF (di
database).
reproduktifitas
Reproduksibilitas pola T-RFLP diselidiki secara rinci
sebelumnya (Osborn
et al.
, 2000). Untuk menilai reproduktifitas yang
analisis T-RFLP, variasi intragel / polimer (pemilu yang sama
trophoresis gel / polimer) diselidiki oleh tiga ulangan
elektroforesis dari sampel (P17) dari pasien dengan
periodontitis dihasilkan setelah pencernaan dengan
hha
Saya diprogram analisis RFLP (
KERAN
) Telah dikembangkan dan
dipublikasikan di web di seluruh dunia (http://rdp.cme.msu.edu/
html / analyses.html) (Marsh
et al.
, 2000). memahami
flora bakteri dalam rongga mulut manusia adalah penting untuk penuh
deskripsi bakteri penyebab penyakit periodontal.
Metode T-RFLP memungkinkan pengakuan beragam lisan
flora bakteri dan perbandingan cepat masyarakat
struktur antara pasien dengan periodontitis. Oleh karena itu, ini
Metode mungkin juga berguna untuk diagnosis cepat
Penyakit periodontal, meskipun belum diterapkan
untuk diagnosis penyakit tersebut.
Dalam studi komunitas bakteri mulut, air liur tampaknya
menjadi sampel yang paling cocok, karena dianggap mengandung
berbagai bakteri dari situs lisan yang berbeda (lidah misalnya,
plak subgingiva, plak supragingiva), selain
kemudahan sampling. Dalam analisis 16S rDNA clone perpustakaan
saliva manusia, kami menemukan flora bakteri mulut yang sehat
tunduk berbeda dari yang pada pasien periodontitis
(Sakamoto
et al.
, 2000). Temuan ini mengindikasikan bahwa penggunaan
air liur serta plak subgingiva dalam analisis lisan
komunitas bakteri efektif. Selain itu, periodonto-
bakteri pathic seperti
Actinobacillus actinomycetemcomi-
tans
.
Tannerella forsythensis
(dahulu
Bacteroides forsythus
)
(Sakamoto
et al.
2002),
Porphyromonas gingivalis
.
Trepone-
ma denticola
dan
Treponema socranskii
lebih sering
terdeteksi dalam air liur dari dalam sampel plak subgingiva oleh
real-time PCR (Sakamoto
et al.
2001). Hasil ini con-
menguat mereka dari studi sebelumnya (Umeda
et al.
1998). Itu
tingkat bakteri sasaran dapat bervariasi dari saku untuk
saku dan sampel dikumpulkan dari situs periodontitis mungkin
kadang-kadang menjadi organisme hilang. Ini juga mungkin keseluruhan yang
air liur hanya mengandung konsentrasi tinggi dari target yang bakterial
teria dari sampel plak subgingiva. Temuan nyarankan- ini

Download dari www.microbiologyresearch.org oleh

IP: 114.125.29.100
Pada: Thu, 23 Mar 2017 06:38:30
gel yang sama / polimer. Intergel / variasi polimer (gel yang berbeda /
polimer) diselidiki dengan elektroforesis yang sama
sampel pada tiga berbeda gel / polimer. Seventeen T-RFS
yang umum untuk semua pola T-RFLP (Tabel 2). Hanya satu
tambahan T-RF diamati dalam pola T-RFLP. Osborn
et al
. (2000) menunjukkan bahwa sumber terbesar dari variasi
adalah hasil dari sampel loading merata ke sumur gel.
Mereka menemukan bahwa tingkat variasi antara mereplikasi
berjalan dari sampel yang sama lebih rendah dari yang berpengalaman dengan
pemuatan pengguna gel akrilamida ketika mereka menggunakan
kapiler berbasis sistem elektroforesis (ABI Prism 310) dengan
otomatis sampel loading, yang mirip dengan yang digunakan di
penelitian kami.
Selain itu, variabilitas yang dihasilkan selama dua tahap
protokol T-RFLP diselidiki seperti yang dijelaskan sebelumnya
(Osborn
et al.
, 2000): (i) variasi antara tiga yang berbeda
PCR dari sampel DNA tunggal; dan (ii) variasi antara
tiga pencernaan yang berbeda dari produk PCR dari satu
PCR dari sampel DNA tunggal. Seventeen T-RFS yang
umum untuk semua pola T-RFLP serta hasil
intra dan intergel / polimer variasi. Hasil ini menunjukkan
bahwa ada reproduksibilitas data, meskipun kecil
variasi ketinggian puncak diamati (data tidak ditampilkan).
Analisis keragaman komunitas bakteri lisan oleh
T-RFLP
Primer yang universal 27F dan 1492R digunakan untuk char-
mencirikan komunitas bakteri oral. Meskipun pasangan primer ini
mungkin tidak memperkuat semua 16S rDNAs organisme dalam air liur,
dan tidak akurat melestarikan ketidakrataan asli
Template DNA masyarakat, PCR amplifikasi dengan primer
Pasangan 27F - 1492R diikuti oleh pencernaan dengan
hha
IOR
msp
Iis
dianggap sebagai pendekatan yang paling sederhana untuk mengklasifikasikan terbesar
Jumlah urutan gen 16S rRNA ke jumlah terbesar
unik T-RFS dalam penelitian ini.
pola T-RFLP dengan dua enzim restriksi yang berbeda yang
dibandingkan - ini tersedia sebagai data pelengkap di
JMM online (http://jmm.sgmjournals.org).
msp
saya dihasilkan
angka yang lebih besar dari T-RFS dari
hha
I. Masing-masing dari 36 pola
menunjukkan 5 - 35 T-RFS setelah pencernaan dengan
hha
I. Sebanyak 68
berbeda T-RFS yang terdeteksi. Ukuran mayoritas
hha
I-dicerna T-RFS adalah kurang dari 600 bp. Utama T-RFS
sekitar 578 bp terdeteksi dalam pola T-RFLP semua

sampel (31 · 8-84 · 3%). Komputer-simulasi T-RFLP

Analisis menunjukkan bahwa T-RFS sekitar 578 bp yang
berasal dari anggota genus
Streptococcus
. Ini
Hasilnya adalah dalam perjanjian baik dengan itu dari klon 16S rDNA
analisis perpustakaan air liur manusia (Sakamoto
et al.
2000), di
dimana banyak klon yang filogenetis terkait
genus
Streptococcus
(yaitu.
Streptococcus gordonii
.
Strep-
tococcus mitis
.
parasanguinis Streptococcus
.
Streptococcus
pneumoniae
.
Streptococcus salivarius
dan
Streptococcus perlengkapan sanitasi
guinis
). Selain itu, T-RFLP analisis klon (strep-
tococci berasal) menegaskan anggapan di atas (data tidak
ditunjukkan).
Sebuah 29 bp T-RF diidentifikasi dalam pola T-RFLP hanya
empat sampel (P1, P7, P15 dan P17) dari pasien dengan
periodontitis dihasilkan setelah pencernaan dengan
hha
I (Gambar. 1).
Menurut analisis T-RFLP dari organisme tunggal (Tabel 1)
dan analisis T-RFLP komputer-simulasi, itu con-
sidered bahwa 29 bp T-RF berasal dari roh lisan
ochaetes. Anggapan ini didukung oleh T-RFLP
pola dari empat sampel di atas dihasilkan setelah pencernaan
dengan
msp
Saya (data tidak ditampilkan). empat Selanjutnya, ini
sampel menghasilkan produk PCR spesifik untuk
T. denticola
dan
T. socranskii
(Data tidak dipublikasikan kami). choi
et al
. (1994)
melaporkan bahwa meskipun sekitar 20% dari bakteri di
plakat sampel subgingiva dari pasien tunggal dengan
periodontitis destruktif yang spirochaetes, treponeme-
klon spesifik mewakili sekitar 7 dan 1% dari klon
dipilih secara acak dari DNA dan perpustakaan cDNA,
masing-masing. Temuan ini menyarankan bahwa proporsi
klon treponeme khusus rendah untuk 16S rRNA perpustakaan
ketika semua bakteri primer yang digunakan. Dengan demikian, 29 bp T-RF
akan terdeteksi hanya dalam empat sampel dari pasien dan
populasi kecil (0 · 8-3 · 4%). PCR Bias telah digambarkan
sebelumnya (Farrelly
et al.
1995; Suzuki & Giovannoni, 1996).
Liu
et al
. (1997) menunjukkan bahwa data yang diperoleh dengan menggunakan T-
RFLPs harus hati-hati ditafsirkan akan. Alasan adalah sebagai
berikut. Jumlah populasi diwakili dalam T yang
Pola RFLP dari setiap masyarakat diberikan tergantung pada peringkat
kelimpahan masing-masing populasi. populasi mikroba yang
tidak numerik dominan tidak terwakili, karena
yang DNA template dari populasi ini mewakili kecil
sebagian kecil dari total DNA masyarakat. Oleh karena itu, spesies
keragaman komunitas mikroba diremehkan.
Di atas empat sampel yang dihasilkan T-RFS lebih besar dari 1000 bp
(Gambar 1.), Yang merupakan penduduk yang relatif besar (12 · 9 -
26 · 4%) dibandingkan dengan 13 sampel lainnya (1 · 8 - 11 · 6%,
orang-orang dari P6, P10 dan P11 yang sangat kecil) dari pasien
(Kecuali untuk P2 yang tidak menghasilkan T-RFS lebih besar dari 1000
bp). T-RFS lebih besar dari 1000 bp terdeteksi di T-RFLP
pola sampel dari pasien dengan periodontitis lebih
dari subyek periodontal yang sehat. Namun, di awal
eksperimen dengan P17, karena penurunan ketinggian puncak
T-RFS lebih besar dari 1000 bp diamati dengan peningkatan
konsentrasi enzim dan waktu pencernaan (data tidak ditunjukkan),
mereka T-RFS dapat terdiri dari produk yang dicerna sebagian.
Masalah pencernaan yang tidak sempurna dengan pembatasan
enzim telah dilaporkan secara detail oleh Osborn
et al
. (2000).

Mereka menyebutkan risiko menghapus asli T-RFS yang

mewakili anggota yang berbeda dari genus yang sama atau kelompok
ketika fragmen tersebut (produk dicerna sebagian) yang
dikecualikan dari analisis, dan menyarankan bahwa fragmen tersebut
KASIH harus dipertahankan dalam analisis.
Masing-masing dari 36 pola menunjukkan 13-40 T-RFS setelah pencernaan
dengan
msp
I. Sebanyak 107 berbeda T-RFS yang terdeteksi. Itu
ukuran mayoritas
msp
I-dicerna T-RFS kurang dari
600 bp. Utama T-RFS sekitar 554 bp, diduga
anggota dari genus
Streptococcus
, Terdeteksi di T-RFLP
pola dari seluruh sampel (38 · 6-85 · 1%) (lihat tambahan
Data di JMM online; http://jmm.sgmjournals.org). Ini
Hasilnya adalah dalam perjanjian baik dengan itu pola T-RFLP
dihasilkan setelah pencernaan dengan
hha
SAYA.
Analisis keragaman masyarakat spirochaetal oleh
T-RFLP
Bernhard & Field (2000) melaporkan metode T-RFLP menggunakan
itu
Bacteroides
-
Prevotella
Kelompok-spesifik primer. dalam kami
studi, kami menggunakan
Spirochaeta
-selective primer (Paster
et al.
.
2001; Dewhirst
et al.
2000) mencirikan masyarakat
profil spirochaetes lisan, meskipun ada risiko bahwa
urutan primer ini adalah sama dengan semua anggota
keluarga
Coriobacteriaceae
(Dewhirst
et al.
2001). Masalah
tentang kekhususan
Spirochaeta
primer -selective
telah dibahas oleh Dewhirst
et al
. (2001). Tidak ada amplikon
diperoleh dari dua sampel (H2 dan H5) dari periode-
subyek ontally sehat dengan 27F dan
Spirochaeta
-
selektif primer sebaliknya. Selain itu, dua sampel ini melakukan
tidak menghasilkan produk PCR spesifik untuk
T. denticola
dan
T.
socranskii
(Data tidak dipublikasikan kami). Masing-masing dari 34 pola
menunjukkan 2-16 T-RFS setelah pencernaan dengan
hha
I. Sebanyak 43
berbeda T-RFS yang terdeteksi. Sebagian besar dari
hha
I-dicerna
T-RFS yang 29 dan 31 bp panjang - melihat data tambahan di
JMM online (http://jmm.sgmjournals.org). Proporsi
dari 29 bp T-RF, yang diduga menjadi spirochaetes lisan
berdasarkan analisis T-RFLP dari organisme tunggal, berkisar antara
21 · 6-78 · 5% (49 · 2
?
14 · 9) (Tabel 3). Di samping itu,
bahwa dari 31 bp T-RF tiba-tiba 1 · 4-77 · 3% (29 · 7
?
21 · 6). Proporsi 31 bp T-RFS pola T-RFLP
sampel dari subyek periodontal yang sehat (43 · 1
?
19 · 7%)
lebih besar dari itu dalam pola T-RFLP sampel dari
pasien dengan periodontitis (17 · 1
?
14 · 5%,
P
.
0 · 001,
t
-
uji). 31 bp T-RFS mungkin tidak berasal dari lisan
spirochaetes, dan studi lebih lanjut diperlukan untuk memverifikasi ini
hipotesa. Proporsi 202 dan 203 bp T-RFS di
Pola T-RFLP dari P2 tiba-tiba 56 · 9% (angka di
Data tambahan dan Tabel 3), meskipun yang satu 29 bp
T-RF kecil (21 · 6%). Selain itu, proporsi T-RF
lebih besar dari 1000 bp dalam pola T-RFLP dari P17 relatif
lebih besar dari sampel lainnya (27 · 6%). 16S rDNA
analisis perpustakaan klon mengungkapkan bahwa saat ini, ada sekitar
60 spesies treponema lisan atau phylotypes di sub manusia
plak gingiva (Paster
et al.
2001; Dewhirst
et al.
, 2000).
Spesies lain yang belum teridentifikasi atau phylotypes mungkin
masih ada di rongga mulut manusia.
Masing-masing dari 34 pola menunjukkan 8-33 T-RFS setelah pencernaan
dengan
msp
I. Sebanyak 92 berbeda T-RFS yang terdeteksi. Itu

Download dari www.microbiologyresearch.org oleh

IP: 114.125.29.100
Pada: Thu, 23 Mar 2017 06:38:30
ukuran mayoritas
msp
I-dicerna T-RFS kurang dari
600 bp (melihat data tambahan di JMM online; http: //
jmm.sgmjournals.org). Dalam pola T-RFLP sampel dari
subyek periodontal yang sehat, T-RFS sekitar 202 bp yang
dominan (angka dalam data tambahan dan Tabel 3). Di
Sebaliknya, T-RFS dari 202 bp ditambah sekitar 291 dan
296 bp yang dominan dalam pola T-RFLP sampel
dari pasien dengan periodontitis. Menggunakan 16S rRNA yang universal
maju primer dan
Spirochaeta
primer -selective, Dewhirst
et al
. (2001) melaporkan bahwa 75% dari klon yang diperoleh
Treponema
spesies, dan mayoritas non-spirokaeta
klon terkait erat dengan genus
Atopobium
dalam
keluarga
Coriobacteriaceae
. diprediksi T-RF panjang yang dari
Atopobium
spesies setelah pencernaan dengan
hha
Saya 37 bp,
yang identik dengan spirochaetes. Namun,
diprediksi T-RF panjang
Atopobium
spesies setelah pencernaan
dengan
msp
Saya berbeda dari spirochaetes. quences
berkala, mayoritas 16S rDNAs diperkuat dari sampel
dari periodontal subyek sehat mungkin terkait erat dengan
marga
Atopobium
tapi tidak spirochaetes. studi lebih lanjut yang
perlu.
Analisis numerik
Dalam analisis keragaman komunitas bakteri oral,
jumlah T-RFS pada pasien dengan periodontitis (
msp
saya

Sampel dari pasien dengan periodontitis cenderung mengelompok

dengan jenis masing-masing (periodontal agresif dan kronis
dontitis), meskipun ini tidak sangat jelas. Menariknya, P8
dan P14, yang dalam tahap pemeliharaan, membentuk cluster
dengan sampel dari subjek periodontal yang sehat dan
relatif terpisah dari sampel pasien lain. P8 melakukan
tidak menghasilkan produk PCR spesifik untuk
A. actinomycetemco-
mitans
.
T. forsythensis
.
P. gingivalis
.
T. denticola
atau
T.
socranskii
, Dan P14 tidak menghasilkan produk PCR spesifik
untuk
A. actinomycetemcomitans
atau
T. denticola
(Tidak dipublikasikan kami
Data diterbitkan).
MD
t
nilai berkisar antara 4 · 3 sampai 20 · 6. Dalam
analisis komunitas spirochaetal (Gambar. 3), pola
berasal dari pasien dengan periodontitis menunjukkan yang lebih baik
pengelompokan dibandingkan dengan analisis com- bakteri mulut
munity. Hasil ini menunjukkan bahwa sampel dari pasien dengan
periodontitis mengandung keragaman tak terduga.
MD
t
nilai-nilai
berkisar antara 3 · 5 sampai 13 · 0.
analisis T-RFLP komputer-simulasi
Spirochaetes ada di beberapa lingkungan (Choi
et al.
1997;
Iida
et al.
2000; Lilburn
et al.
1999; paster
et al.
1996) di
Selain rongga mulut manusia. Selain itu, sejumlah

Download dari www.microbiologyresearch.org oleh

IP: 114.125.29.100
Pada: Thu, 23 Mar 2017 06:38:30
spirochaetes hadir dalam usus rayap (Lilburn
et al.
1999).
16S rDNA analisis clone perpustakaan mengungkapkan bahwa semua termite-
gut klon spirochaetal berafiliasi dengan genus
Treponema
(Iida
et al.
2000; Lilburn
et al.
1999; paster
et
Al.
, 1996). Lilburn
et al
. (1999) melaporkan bahwa setidaknya 21 baru
spesies
Treponema
diakui dalam satu rayap
jenis. Dalam penelitian, 194 urutan treponemal kami (termasuk
rayap-gut klon spirochaetal) diambil dari DDBJ /
EMBL / GenBank dipilih untuk analisis T-RFLP. Itu
distribusi ukuran T-RFS diprediksi untuk treponema ditampilkan
pada Gambar. 4. Jumlah T-RFS setelah pencernaan dengan
msp
saya
lebih besar dari itu setelah pencernaan dengan
hha
I. Hasil ini
perjanjian dengan analisis keragaman spirochaetal yang
masyarakat. Dari komputer-simulasi analisis T-RFLP
dengan
hha
Aku, meskipun proporsi 37 bp T-RF, yang
Sesuai dengan 29 bp T-RF diamati dalam penelitian ini, adalah
sekitar 90%, yang dari 29 bp T-RF berkisar dari 21 · 6 untuk
78 · 5%. Tanpa diduga, proporsi 31 bp T-RF adalah
besar (1 · 4-77 · 3%). Selanjutnya, T-RFS sekitar 202 bp
ditambah sekitar 291 dan 296 bp (dari spirochaetes oral)
yang dominan dalam analisis dengan
msp
I. Dalam Compu- yang
analisis T-RFLP ter-simulasi, proporsi T-RFS dari
sekitar 202 bp itu tidak besar. Temuan ini menunjukkan bahwa
31 bp T-RF (dengan
hha
I) dan T-RFS sekitar 202 bp (dengan
msp
I) mungkin tidak berasal dari spirochaetes oral. Dalam
masa depan, kami akan merancang dan menggunakan primer yang lebih spesifik untuk oral
spirochaetes.
Host-spesifik dan pola T-RFLP stabil oral
komunitas bakteri dalam air liur manusia
Akhirnya, kami juga menyelidiki stabilitas bakteri mulut
masyarakat selama periode 5 minggu (Gbr. 5). Meskipun kecil
perubahan pola T-RFLP diamati, sampel air liur dari
subjek yang sama yang diproduksi pola T-RFLP sama tanpa memperhatikan di
tive dari waktu sampling. Hasil ini menunjukkan bahwa
perubahan flora bakteri mulut relatif kecil dalam kehidupan sehari-hari
dan menunjukkan kegunaan metode ini untuk mon-
itoring flora bakteri oral individu selama periode
waktu.
Kesimpulan
Meskipun populasi subjek kecil, penelitian kami
menunjukkan bahwa analisis T-RFLP berguna untuk penilaian
dari keragaman flora bakteri mulut dan compari cepat
putra struktur komunitas di antara individu dengan dan
tanpa periodontitis. Pendekatan dilaporkan di sini harus
berguna di masa depan untuk menjelaskan etiologi periodontal
penyakit dan untuk mengembangkan alat diagnostik baru, penyakit-pencegahan
program tion dan modalitas pengobatan. studi yang
berlangsung di laboratorium kami untuk memeriksa efek dari
perawatan medis periodontitis pada pola T-RFLP.
ACKN