PERBEDAAN JUMLAH SEL MAKROFAG GINGIVA TIKUS WISTAR JANTAN YANG

MENGALAMI GINGIVITIS PADA PEMBERIAN PROBIOTIK YANG

MENGANDUNG Lactobacillus casei DAN Lactobacillus reuteri
Dwi Putra Saifullah, Herrina Firmantini1, Demitria Defita D.N2
Program Studi S1 Fakultas Kedokteran Gigi Institut Ilmu Kesehatan Bhakti Wiyata Kediri
Dwiputrasaifullah@gmail.com

ABSTRAK

Latar belakang : Penyakit periodontal banyak diderita oleh manusia hampir di seluruh dunia dan mencapai 50%
dari jumlah populasi dewasa. Penyakit periodontal merupakan penyakit kronis yang diawali dengan gingivitis.
Gingivitis ditandai dengan peningkatan infiltrasi makrofag yang berfungsi untuk memfagositosis bakteri yang
menginfiltrasi jaringan gingiva. Probiotik mempengaruhi sitokine (TNF-α, dan interleukin) yang perannya dalam
aktivasi sitokin proinflamasi yang berpengaruh pada proses pergantian dan adhesi leukosit terutama makrofag untuk
keluar dari pembuluh darah dan menuju tempat terjadinya inflamasi, dan perdarahan gingiva, sehingga penurunan
tadi mempengaruhi jumlah sel makrofag menjadi berkurang. Tujuan : Penelitan ini dilakukan untuk mengetahui
perbedaan jumlah sel makrofag gingiva tikus wistar jantan yang mengalami gingivitis pada pemberian probiotik
yang mengandung Lactobacillus casei dan Lactobacillus reuteri. Metode : Jenis penelitian ini eksperimental
laboratoris, dengan rancangan post test only control group design. Penelitian ini dilakukan pada 27 ekor tikus putih
(Rattus norvegicus) jantan berusia 2-4 bulan dengan berat 200 gram. Dibagi menjadi 3 kelompok, kelompok
pertama perlakuan probiotik Lactobacillus casei, kelompok dua perlakuan probiotik Lactobacillus reuteri, kelompok
tiga kelompok tanpa pemberian probiotik. Pemberian probiotik dilakukan saat terjadi tanda peradangan pada gingiva
tikus akibat induksi LPS E.coli. Kemudian pada hari ke-4 dilakukan dekaputasi setelah perlakuan. Selanjutnya
gingiva anterior rahang bawah bagian labial dibuat sediaan histologi untuk pengecatan hematoxylin eosin. dan
pemeriksaan mikroskopis untuk menghitung jumlah sel makrofag. Data dianalisis menggunakan One-Way Anova
dan dilanjutkan uji LSD. Hasil : Hasil uji One-Way Anova menunjukkan nilai p<0,05 memperlihatkan bahwa secara
keseluruhan terdapat perbedaan yang bermakna. Hasil uji LSD terdapat perbedaan bermakna antar kelompok
penelitian. Kesimpulan : Pemberian probiotik yang mengandung lactobacillus casei dan lactobacillus reuteri
menujukkan perbedaan jumlah sel makrofag pada tikus wistar jantan yang mengalami gingivitis.

Kata Kunci : makrofag, gingivitis, Lactobacillus casei, Lactobacillus reuteri.

 BAB IV

METODOLOGI PENELITIAN

A. Jenis Penelitian

Jenis penelitian ini adalah eksperimental laboratoris secara in vivo, dengan rancangan

penelitian yang digunakan adalah desain post test only control group design (Notoatmodjo,

2010).

B. Tempat dan Waktu Penelitian

1. Tempat Penelitian

Penelitian ini akan dilaksanakan di Laboratorium Farmakologi Fakultas Kedokteran

Universitas Brawijaya dan Laboratorium Patologi Anatomi Fakultas Kedokteran Universitas

Brawijaya.

2. Waktu Penelitian

Penelitian ini akan dilaksanakan pada bulan Juli-Agustus 2016.

C. Populasi dan Sampel Penelitian

1. Populasi Penelitian

Populasi dalam penelitian ini adalah hewan coba tikus putih (Rattus norvegicus) jenis

wistar jantan. Tikus diambil dari laboratorium Farmakologi Fakultas Kedokteran Universitas

Brawijaya.
2. Sampel Penelitian

a. Kriteria Sampel Penelitian

Pemilihan sampel penelitian menggunakan teknik non random sampling yaitu purpossive

sampling, sampel dipilih berdasarkan pertimbangan tertentu yang dibuat oleh peneliti

(Notoatmodjo, 2010).

Adapun Kriteria sampel antara lain :

1) Tikus jenis wistar.

2) Kondisi fisik sehat dan tidak mengalami kelainan.

3) Jenis kelamin jantan.

4) Umur 3 bulan dan berat badan 150-200 gram.

5) Pemberian pakan dan minuman yang sesuai setara seragam.

b. Besar sampel

Menurut Federer (1993) dalam Dada (2013) untuk penelitian eksperimen dengan

rancangan acak lengkap, acak kelompok atau faktorial secara sederhana dapat dirumuskan :

( t - 1) x ( r – 1) ≥ k

Keterangan :

(t) : Jumlah Kelompok perlakuan

(r) : Jumlah sampel kelompok perlakuan

(k) : Konstanta (15)

( n - 1) ( r – 1) ≥ 15
 ( 3 - 1) ( r – 1) ≥ 15

2 ( r – 1) ≥ 15

2r - 2 ≥ 15

2r ≥ 17

r ≥ 8,5

Hasil perhitungan jumlah sampel untuk penelitian ini yaitu 9 sampel tiap perlakuan.

c. Pembagian Kelompok Perlakuan

Hewan coba yang sudah diadapatasikan akan dikelompokkan menjadi 3 kelompok, yaitu:

1. Kelompok 1 : kelompok perlakuan yang diberi induksi Lipopolisakarida

dan diberikan larutan aquadest steril.

2. Kelompok 2 : kelompok perlakuan yang diberi induksi Lipopolisakarida

dan diberikan bakteri probiotik Lactobacillus casei.

3. Kelompok 3 : kelompok perlakuan yang diberi induksi Lipopolisakarida

dan diberikan bakteri probiotik Lactobacillus reuteri.

D. Variabel Penelitian

1. Variabel Bebas

Variabel bebas dalam penelitian ini adalah pemberian probiotik (Lactobacillus casei dan

Lactobacillus reuteri).

2. Variabel Terikat

Variabel terikat dalam penelitian ini adalah jumlah sel makrofag

3. Variabel Terkendali
 Variabel yang dikendalikan dalam penelitian ini adalah:

a. Metode kerja.

b. Alat dan bahan.

c. Teknik pemberian probiotik Lactobacillus casei dan Lactobacillus reuteri.

d. Pemeliharaan hewan coba termasuk makan, minum dan lingkungan kandang.

E. Definisi Operasional Variabel Penelitian

1. Bakteri probiotik Lactobacillus casei didapatkan dari sediaan yakult, yang diaplikasikan

pada hewan coba dengan cara disuntikkan pada junctional ephithelium sulkus gingiva gigi

insisivus pertama kanan rahang bawah bagian labial, dengan dosis 2 x 10 8 sel/ml dengan

menggunakan pipet sebanyak 1,17 ml.

2. Bakteri probiotik Lactobacillus reuteri didapatkan dari sediaan biogaia, yang diaplikasikan

pada hewan coba dengan cara disuntikkan pada junctional ephithelium sulkus gingiva gigi

insisivus pertama kanan rahang bawah bagian labial, dengan dosis 2 x 10 8 sel/ml dengan

menggunakan pipet sebanyak 1,17 ml.

3. Jumlah sel makrofag pada gingiva adalah banyaknya pembentukan sel makrofag gingiva

setelah perlakuan yang didentifikasi menggunakan pewarnaan Haematoksilin eosin (HE)

kemudian diamati secara histologis menggunakan mikroskop cahaya dengan pembesaran

400x. Sel ini berukuran 10 sampai 30 µm dan umumnya memiliki satu inti yang berbentuk

lonjong dan berbentuk ginjal yang terletak eksentris Secara histologi sitoplasma terpulas

gelap dengan permukaan yang tidak teratur dan lipatan serta tonjolan yang menandakan

aktivitas fagositosisnya.
4. Lipopolisakarida yang digunakan berasal dari Escherichia coli, diaplikasikan pada hewan

coba dengan cara disuntikkan pada junctional ephithelium sulkus gingiva gigi insisif

pertama kanan rahang bawah bagian labial, dengan dosis 5 μg/0,05 ml PBS dan

menggunakan pipet sebanyak 0,02 ml.

F. Alat dan Bahan

1. Bahan Penelitian

Bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah:

1) Tikus wistar jantan

2) Lipopolisakarida Escherichia coli

3) Probiotik Lactobacillus casei sedian pasar (Yakult)

4) Probiotik Lactobacillus reuteri sedian pasar (Biogaia)
5) Eter 10%

6) Formalin 10%

7) EDTA 10%

8) Ammonium Hydroxide 5

9) Ammonium Oxalate 5%

10) Alkohol 70%, 80%, 95%, 100%

11) Xylol

12) Gliserin

13) Meyer Egg Albumin

14) Embedding Paraffin (Paraplast Plus)

15) Dry Ice (VWR International)

16) Haematoksilin Eosin

 17) Entellan

18) Aquades steril

19) Spiritus

20) Kapas steril

21) Kertas saring (Whatmann filter paper No.1)

22) Minuman dan makanan standar tikus wistar

2. Alat Penelitian

Alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah:

1) Kandang pemeliharaan hewan coba

2) Kandang perlakuan hewan coba

3) Tempat makan dan minum hewan coba

4) Pipet

5) Tabung reaksi (Pyrex)

6) Sonde

7) Neraca (Ohaus, Jerman)

8) Filing cabinet (Sakura, Jepang)

9) Autoclave

10) Gelas Ukur

11) Erlenmeyer (Pyrex)

12) Beaker Glass

13) Pengaduk

14) Lampu spiritus

15) Cutter
 16) Refrigerator

17) Gunting bedah

18) Pinset

19) Botol untuk dekalsifikasi

20) Vibrator (Vortex)

21) Stopwatch (Diamond, Cina)

22) Besi bentuk L untuk alat cetak blok paraffin

23) Mikrotom (Leica RM 2135)

24) Block holder mikrotom

25) Waterbath (Memmert, Jepang)

26) Slide Warmer (Sakura, Jepang)

27) Oven (Memmert, Jepang)

28) Automatic Staining (Sakura, Jepang)

29) Mikroskop (Olympus CX21LED, Jepang)

30) Obyek glass (Citoplus)

31) Deck glass

G. Prosedur Penelitian

1. Persiapan hewan coba

Hewan dilakukan aklimatisasi selama seminggu sebelum diberi perlakuan untuk adaptasi

tikus dengan tempat yang memiliki ventilasi udara cukup dan makanan yang baik.

2. Persiapan bahan perlakuan

Bahan yang dipakai pada kelompok perlakuan terdiri dari Lipopolisakarida Escherichia

coli yang dipakai untuk menginduksi dan menghasilkan infeksi pada jaringan periodontal.
Bakteri probiotik yang digunakan adalah Lactobacillus casei dan Lactobacillus reuteri. Dosis

konfersi dari manusia ke-hewan (Suhardjono,1995) dosis probiotik 2 x 108 CFU/ml. Pada

manusia diberikan sebanyak 65 ml. Cara perhitungan volume probiotik yang diberikan terhadap

hewan coba.

Volume pemberian :

= 65 ml x (faktor konfersi)

= 65 ml x 0,018

= 1,17 ml

Jadi volume yang diberikan terhadap hewan coba dengan pemberian selama 4 hari

volume yang diberikan sebesasar 1,17 ml.

a. Pembuatan sediaan LPS

1) Membeli LPS dengan sediaan yang sudah jadi dengan jumlah 10 mg.

2) Pembuatan stok LPS didapat dengan cara 10 mg LPS dilarutkan dalam 2 ml

Phosphate Buffer Saline (PBS).

3) Stok LPS dikemas dalam wadah tertutup dan disimpan dalam suhu ruang.

3. Pelaksanaan penelitian

a. Pembiusan hewan coba

Hewan coba sebelum diberi perlakuan, dilakukan pembiusan dengan menggunakan

ketamin dan xyla dengan dosis 80mg/kg berat badan yang disuntikkan pada kaki belakang

bagian kanan hewan coba di musculus quatdricep.

b. Aplikasi bahan perlakuan infeksi jaringan periodontal

Infeksi pada jaringan periodontal dilakukan dengan induksi Lipopolisakarida Escherichia

coli. LPS disuntikan pada junctional ephithelium sulkus gingiva gigi insisif pertama kanan
rahang bawah bagian labial sebanyak 0,02 ml, diberikan 1 kali sehari selama 4 hari, sampai

munculnya gejala klinis gingivitis berupa perubahan warna gingiva menjadi kemarahan,

perubahan konsistensi menjadi lebih padat, dan perubahan tekstur menjadi lebih halus dan

menkilap. Pada hewan coba yang mengalami abses, kematian ataupun tidak terdapat tanda klinis

terjadinya gingivitis dilakukan penggantian hewan coba lain yang diberi perlakuan yang sama

agar didapatkan hasil yang akurat. Setelah gejala klinis muncul dilakukan pemberian probiotik

yang mengandung Lactobacillus casei dan Lactobacillus reuteri.

c. Aplikasi pemberian Probiotik

Setelah gejala klinis muncul dilakukan pemberian bakteri probiotik dilakukan dengan

menyuntikkan pada daerah junctional ephithelium sulkus gingiva gigi insisif pertama kanan

rahang bawah bagian labial. Volume pemberian sebanyak 1,17 ml, diberikan 1 kali sehari

selama 4 hari. Pemberian bakteri probiotik ini dilakukan dengan cara yang sama, yaitu: untuk

Kelompok II dan kelompok III diberikan secara bersamaan setalah terjadinya tanda klinis

gingivitis.

d. Pengambilan sampel penelitian

Hewan coba baik dari kelompok kontrol maupun perlakuan sebelum didekaputasi

dilakukan pemeberian eter secara inhalasi menggunakan eter 10% selama 3 menit sampai hewan

coba mengalami kematian, setelah itu dilakukan pengambilan sampel jaringan ikat gingiva, dan

gigi pada regio insisif pertama kanan rahang bawah sebelah labial. Jaringan dipotong dengan

ketebalan 2-3 mm, panjang 1 cm, lebar 0,5 cm dan selanjutnya dilakukan fiksasi dengan

menggunakan formalin 10% selama 24 jam (Ahmad, 2009).

e. Dekalsifikasi Sampel Penelitian

Sampel yang telah difiksasi menggunakan formalin 10% dilakukan dekalsifikasi dengan tujuan

untuk melepaskan bahan anorganik dalam tulang tanpa merusak protein yang ada, dengan

memakai larutan EDTA 10% (pH 7,4) pada suhu 4°C. Adapun urutan dekalsifikasinya sebagai

berikut:

1) Sampel yang sudah difiksasi dicuci dengan air bersih yang mengalir pelan

selama minimal 30 menit.

2) Dimasukkan pada larutan EDTA yang sudah ada dan dilakukan vibrasi 2x agar proses

dekalsifikasi merata.

3) Sampel yang sudah terdekalsifikasi lengkap dibersihkan dengan air mengalir dan segera

ditransfer pada larutan ammonia selama 30 menit (ammonia concentrated 5 tetes dalam 100

ml distilled water) dengan tujuan untuk menghilangkan larutan dekalsifikasi yang tersisa.

4) Setelah itu dicuci dengan air mengalir selama 24 jam.

f. Pemrosesan jaringan

Pemrosesan jaringan bertujuan untuk mempersiapkan jaringan sebelum dilakukan

penyayatan dengan mikrotom. Tahapan pemrosesan jaringan menurut Syafriadi et.al. (2008),

adalah sebagai berikut:

1. Dehidrasi, yaitu penarikan air dari jaringan secara bertahap dengan menggunakan alkohol.

Dari konsentrasi yang kecil yaitu 70% selama 1 jam, 80% selama 1 jam, 90% selama 1 jam

sebanyak 2 kali, kemudian alkohol 100% selama 1 jam sebanyak 3 kali.

2. Clearing, yaitu untuk menjernihkan jaringan sehingga tampak transparan dengan cara

memasukkan jaringan ke dalam larutan xylol sebanyak 3 kali selama 1 jam, 2 jam dan 3 jam.
3. Impregnasi, yaitu proses infiltrasi parafin. Proses ini dilakukan dengan cara mencairkan

parafin solid pada suhu 60°C dan selanjutnya memasukkan parafin pada jaringan sebanyak 2

kali. Masing-masing selama 2 jam.

4. Embedding, yaitu penanaman jaringan dengan parafin solid yang dilakukan dengan cara:

a. Menyiapkan jaringan yang dikondisikan dalam suhu 60°C. Bahan embedding juga

dipanaskan pada suhu 60°C.

b. Penyiapan alat pencetak berupa kaset, lalu bahan embedding dituang ke dalam alat

pencetak dengan volume yang cukup.

c. Jaringan diambil dengan menggunakan pinset lalu ditanam ke dalam pencetak yang telah

diisi oleh parafin dengan posisi yang telah dikehendaki.

d. Alat pencetak yang telah terisi parafin dan jaringan didinginkan pada alat pendingin

sehingga terbentuk blok parafin.

5. Penyayatan

Sebelum dilakukan penyayatan jaringan, sebelumnya dilakukan beberapa persiapan,

antara lain:

a. Mengolesi obyek glass dengan meyer albumin.

b. Menempelkan blok paraffin pada block holder mikrotom dengan bantuan pemanasan.

Setelah itu, dilakukan proses penyayatan jaringan dengan alat yang digunakan untuk

memotong jaringan adalah rotary microtom. Blok yang akan dipotong disiapkan pada alat

pendingin agar parafin tetap padat dan kompak. Gelas objek disiapkan dan diberi label sesuai

dengan nomer spesimen. Water bath (tissue floation bath) disiapkan pada suhu 40°C, kemudian

blok parafin diletakkan pada head microtom dan diatur ketebalan yang dikehendaki (4µ = 4x10-
3
). Sayatan yang diperoleh diletakkan pada water bath agar sayatan dapat mengembang dengan
baik lalu tiriskan. Setelah itu, sayatan pada gelas obyek diletakkan pada hot plate (alat pemanas)

pada suhu 60°C selama 10-15 menit (Bancroft, 2008).

6. Pengecatan Haematoksilin eosin (HE)

Pengecatan HE digunakan untuk melihat jumlah sel makrofag. Teknik pengecatan HE

yang dilakukan adalah sesuai standar rutin Laboratorium Patologi Anatomi Fakultas Kedokteran

Hewan Universitas Brawijaya. Metode pengecatan Haematoksilin eosin secara progresif menurut

Syafriadi et.al. (2008), antara lain:

1) Xylol : 2-3 menit

2) Xylol : 2-3 menit

3) Alkohol absolut : 3 menit

4) Alkohol absolut : 3 menit

5) Alkohol 95% : 3 menit

6) Alkohol 95% : 3 menit

7) Bilas air hangat : 10-15 menit

8) Mayer’s Haematoksilin : 10 menit

9) Bilas air hangat : 20 menit

10) Eosin : 15 detik-2 menit

11) Bilas air hangat : 20 menit

12) Alkohol 95% : 2-3 menit

13) Alkohol 95% : 2-3 menit

14) Alkohol absolut : 2-3 menit

15) Alkohol absolut : 2-3 menit

16) Xylol : 3 menit

17) Xylol : 3 menit

18) Xylol : 3 menit

19) Mounting menggunakan cairan Entellan lalu ditutup dengan obyek glass. Sedangkan hasil

pengecatan yang didapatkan antara lain: inti sel (biru), eritrosit (merah), sitoplasma

(merah), dan otot (merah).

7. Tahap penghitungan jumlah makrofag

Sel makrofag gingiva setelah perlakuan kemudian diamati secara histologis

menggunakan mikroskop cahaya dengan pembesaran 400x. Sel makrofag dihitung dengan

bantuan mikroskop cahaya pada 3 slide dari masing-masing ulangan dengan 5 lapang pandang.

Setiap preparat secara sistematis dihitung mulai dari pojok kiri bawah kemudian digeser keatas

hingga tepi atas jaringan, lalu digeser ke kanan kemudian ditarik ke bawah demikian seterusnya

hingga ujung kanan jaringan sehingga semua lapangan terbaca. Jumlah makrofag tiap sampel

ditentukan dengan menghitung jumlah rata-rata makrofag dari ketiga perlakuan.

H. Analisis data

Data yang diperoleh dalam penelitian berupa jumlah sel makrofag tikus yang telah diberi

perlakuan yang dihitung dalam mikroskop dengan pembesaran 400x. Jenis data yang didapat

disajikan dalam bentuk tabel, diagram, dan gambar. Pengolahan data dilakukan dengan SPSS.

Data dari setiap pemeiksaan dianalisis secara statistik dengan tingkat kemaknaan 95% (p= 0,05),

memakai uji sebagai berikut :

1. Uji Normalitas menggunakan uji Shapiro Wilk dengan syarat jumlah ≤ 50 sampel, untuk

melihat distribusi data nomal atau tidak antara kelompok data.

2. Uji Homogenitas dengan uji Levene’s Test, untuk melihat perbedaan proporsi yang

bermakna data tidak homogen diantara kelompok data, dimana asumsi homogenitas

terpernuhi jika nilai signifikansi pada Levene’s Test, di atas 0,05 (p > 0,05).

3. Uji One-Way Anova dengan syarat distribusi data normal dan varians data harus sama,

untuk melihat perbedaan jumlah sel makrofag antar kelompok perlakuan.

4. Jika uji One-Way Anova menghasilkan p < 0,05, maka dilanjutkan dengan uji LSD pada

taraf kesalahan p < 5%.

5. Jika syarat uji One-Way Anova tidak terpenuhi, maka dilanjutkan uji alternative dengan

uji Kruskall Wallis.

 I. Alur penelitian

Rattus Norvegicus

Induksi LPS 0,02 ml selama 4 hari (1 hari satu kali)

Gingivitis

Kelompok I (kontrol) Kelompok II Kelompok III

Diberikan induksi LPS Diberi probiotik L. Diberi probiotik L. reuteri
dan larutan aquadest casei Sebanyak 1,17 Sebanyak 1,17 ml, setiap
steril setiap hari selama ml, setiap hari selama 4 hari selama 4 hari
4 hari hari

Pada hari ke 4 hewan coba dikorbankan kemudian dilakukan

pengambilan jaringan gingiva

Pembuatan preparat

Pengecatan HE

Pengamatan jumlah sel makrofag

Hasil Penelitian

Analisa Data

Gambar IV.1 Alur Penelitian

Lampiran 1. Data Penelitian

Hasil Perhitungan Sel Makrofag Pada Pembesaran 400x

N0 HASIL PERHITUNGAN
JUMLAH SEL MAKROFAG
1. 8
2. 7
3. 10
4. 9
5. 11
6. 11
7. 9
8. 11
9. 12
10. 12
11. 10
12. 11
13. 10
14. 11
15. 19
16. 14
17. 17
18. 15
19. 17
20. 15
21. 19
22. 18
23. 14
24. 23
25. 23
26. 28
27. 23